DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DE CLORHIDRATO DE COCAÍNA EN MUESTRAS DE ENTOMOFAUNA OBTENIDAS EN RATAS PREVIAMENTE TRATADAS

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGIAS DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DE CLORHIDRATO DE COCAÍNA EN MUESTRAS DE ENTOMOFAUNA OBTENIDAS EN RATAS PREVIAMENTE TRATADAS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS P R E S E N T A Q.B.P. ANA GABRIELA CERDA GÓMEZ DIRECTOR Dr. RICARDO ALEJANDRE AGUILAR MEXICO, D.F. DICIEMBRE 2010

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4 El presente trabajo fue realizado en las instalaciones del Laboratorio de Química del Servicio Médico Forense del Distrito Federal dependencia perteneciente al Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal bajo la asesoría del Q.F.B. Adrian Waldo Capetillo, del M. en C. Ernesto Bernal Morales, del Q.F.B. Alejandro Romero Ayón, del pbiol. Arturo Gabriel Cortes Cruz y en el Laboratorio de Entomología del Departamento de Parasitología en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas bajo la dirección del Dr. Ricardo Alejandre Aguilar. Este proyecto fue financiado por la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) del IPN mediante el proyecto con clave SIP y por el programa de becas CONACYT nacionales del periodo Agosto de 2008 a Julio 2010

5 ÍNDICE GENERAL Pág. Índice general Índice de figuras Índice de tablas Resumen Abstract i iii iv v vi 1. Introducción Cocaína 4 2. Antecedentes Justificación Hipótesis Objetivo General Objetivos Particulares Material y métodos 7.1 Análisis presuntivo para la determinación de clorhidrato de cocaína 7.2 Análisis confirmativo para la determinación de clorhidrato de cocaína 7.3 Identificación taxonómica de larvas de dípteros Resultados 8.1 Análisis presuntivo para la determinación de metabolitos de clorhidrato de cocaína Análisis confirmativo para la determinación de i

6 metabolitos de clorhidrato de cocaína 8.3 Identificación taxonómica Relación entre especies colonizadoras y temperatura Discusión Conclusiones Bibliografía 37 ii

7 Figura 1. ÍNDICE DE FIGURAS Adulto de Chrysomya albiceps, díptero representativo del periodo sarcofágico. Figura 2. Adulto de Dermestes maculatus representante del periodo dermesteriano. 3 Figura 3. Nicrophorus orbicollis representante del periodo silfiano 3 Figura 4. Larva de Eutrombicula belkini, representante del cuarto periodo Figura 5. Eritroxylon coca lam 5 Figura 6. Figura 7. Representación de la distribución de los cadáveres en donde se muestran los diferentes lotes. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto benzoilecgonina-tms Figura 8. Espectro de benzoilecgonina-tms 22 Figura 9. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto ecgonina metil éster Figura 10. Espectro de ecgonina metil ester 24 Figura 11. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto cadaverina tri-tms Figura 12. Espectro de cadaverina tri-tms 26 Pág Figura 13. Figura 14 Figura 15. Larva de díptero con estructuras anatómicas de utilización para identificación taxonómica Esquematización de las especies de dípteros identificados taxonómicamente, con las estructuras en estadio larvario y ejemplar de adulto, y la presencia de los dípteros en las épocas estacionales Ejemplares de coleópteros y díptero colonizadores de cadáveres iii

8 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Aportaciones más importantes sobre el uso y descubrimiento de la cocaína. Tabla 2. Farmacocinética de cocaína de acuerdo a la ruta de administración Tabla 3. Trabajos de entomología forense realizados del año 1916 a 2000 Tabla 4. Asignación de la dosis administrada a cada uno de los ejemplares. Tabla 5. Tabla comparativa entre la temperatura media por estación y el periodo de duración del periodo larvario. Tabla 6. Periodo con obtención de resultados positivos dentro del intervalo total de descomposición. Tabla 7. Especies de ejemplares del orden Diptera y Coleoptera identificadas taxonómicamente Tabla 8. Aparición de artrópodos durante el periodo de exposición del cadáver. Pág iv

9 RESUMEN Actualmente existen ramas que han aportado información extra para poder completar la investigación forense, entre las cuales se encuentra la antropología, la odontología, la patología, la genética, la química, la toxicología y la que concierne a este trabajo: la entomología. La Entomología es la ciencia que estudia a los artrópodos en general; como auxiliar en el área forense aporta información de relevancia sobre todo cuando el cuerpo no es descubierto inmediatamente después de la muerte, la entomotoxicología se encarga de la determinación cualitativa y/o cuantitativa de sustancias toxicas en artrópodos que colonizan restos humanos. El presente trabajo tiene como propósitos determinar los metabolitos del clorhidrato de cocaína en los artrópodos presentes en cadáveres de ratas previamente tratados, proponer la técnica adecuada para la determinación de cocaína en entomofauna cadavérica e identificar las especies de artrópodos que colonizan los cadáveres de ratas previamente tratados con el clorhidrato de cocaína en la zona urbana del Distrito Federal.Se administró una solución de clorhidrato de cocaína a ratas Wistar macho de g de peso corporal, en diferentes dosis para que al ser sacrificadas se permitiera la colonización de los artrópodos y de esta manera fue posible determinar los metabolitos producidos por la biotransformación del xenobiótico administrado lo cual demostró que es una herramienta importante la utilización de los artrópodos en un análisis toxicológico preciso. La exposición de los cadáveres de ratas fue de 27 días, en las cuatro épocas estacionales: verano, primavera, otoño e invierno. Se obtuvieron muestras de los artrópodos colonizadores para realizar la determinación de los metabolitos de clorhidrato de cocaína por medio de la técnica EMIT y por Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, así como para la identificación taxonómica. Se identificaron los siguientes compuestos: la benzoilecgonina en su forma derivatizada (Benzoilecgonina-TMS), ecgonina metil éster y también fue identificado otro compuesto presente en los cuerpos en descomposición: cadaverina en su forma derivatizada (cadaverina tri-tms), mediante el desarrollo de la técnica propuesta para el tratamiento de muestras entomológicas. Los artrópodos identificados en los cadáveres en las cuatro estaciones del año fueron los siguientes: Lucillia sp, Chrysomia sp, Calliphora sp, Sarcophaga sp, Hydrotea capensis, Saprinus sp, Dermestes maculatus y Necrobia rufipes. v

10 ABSTRACT Currently there are branches that have provided extra information to complete the forensic investigation, among which is the anthropology, dentistry, pathology, genetics, chemistry, toxicology and regards this job: entomology. Entomology is the science of studying arthropods in general, as an aid in the forensic field provides important information especially when the body is not discovered immediately after death; entomotoxicology is responsible for the qualitative and/or quantitative toxic substances in arthropods that colonize human remains. The present study is to determine the metabolites of cocaine hydrochloride in arthropods present in the bodies of rats previously treated propose the appropriate technique for the determination of cocaine in entomofauna cadaverous and identify species of arthropods that colonize the bodies of rats pretreated with cocaine hydrochloride in the urban area of Mexico City. It was given a solution of cocaine hydrochloride to male Wistar rats g body weight at different doses for that being sacrificed to be allowed the colonization of arthropods and thus were able to determine the metabolites produced by the biotransformation of xenobiotic administered which showed that it is an important tool arthropods using a precise toxicological analysis. The exposure of dead rats was 27 days in the four seasonal periods: summer, spring, autumn and winter. Samples were collected arthropods settlers to make the determination of metabolites of cocaine hydrochloride using the technique EMIT and gas chromatography coupled with mass spectrometry, as well as for taxonomic identification. We identified the following compounds: benzoylecgonine in derivatized form (Benzoylecgonine-TMS), ecgonine methyl ester and was also identified another compound in the decomposing bodies: cadaverine in derivatized form (cadaverine tri-tms), through the development of the proposed technique for the treatment of entomological samples. Arthropods identified in the bodies in the four seasons were: Lucillia sp, Chrysomia sp, Calliphora sp, Sarcophaga sp, Hydrotea capensis, Saprinus sp, Dermestes maculatus and Necrobia rufipes. vi

11 1. INTRODUCCIÓN La palabra entomología proviene de los vocablos griegos: tomos que significa parte cortada y logos que significa ciencia, estudio o tratado de ahí que sea la ciencia que estudia a los seres segmentados (Torrez et al., 2006). Actualmente, la entomología estudia a los artrópodos en general; entendemos por artrópodos al conjunto de animales con apéndices segmentarías, provista de musculatura intrínseca, rodeada de una cutícula constituida básicamente por quitina y esclerotina y que está parcialmente esclerotizada. Poseen musculatura somática organizada en haces y piezas endoesqueléticas, de origen tendinoso y secundariamente cuticular; su órgano dorsal es contráctil y está metamerizado; la cavidad general del cuerpo es hemocelica siendo su liquido el liquido circulatorio, su desarrollo embrionario originariamente holoblástico, desigual y espiral, ha pasado a un tipo no espiral e incluso meroblástico superficial (Nieto y Mier., 1985). Las ciencias forenses están relacionadas con la criminalística, que es un conjunto de técnicas y procedimientos de carácter técnico-científicas, de suma importancia en la época actual en que nos encontramos en pleno desarrollo científico de la investigación judicial. La medicina forense es el punto de unión de las ciencias jurídicas y las biológicas, cuyos conocimientos deberán ser comunes a médicos, abogados y agentes investigadores de la policía científica. De esta manera el médico forense, evitando toda precipitación, divide las dificultades de la observación y el análisis del hecho delictuoso en estudio, en tanta partes como sea posible, para poder resolverlos mejor, dirigiendo ordenadamente el pensamiento, de los más sencillo a lo más complejo, haciendo enumeraciones completas de datos y revisiones exhaustivamente, ayudando a resolver los problemas más importantes, convirtiéndose en un valioso auxiliar de la administración de justicia (Fernández, 1981). Para lograr llegar a una respuesta sobre el acto delictivo, el médico forense debe considerar las herramientas que tiene a su alcance y que serán de gran utilidad; algunas de las disciplinas forenses auxiliares son: traumatología, asfixiología, tanatología, sexología, 1

12 obstetricia, psiquiatría, legislación mexicana, odontología, toxicología, y por último pero no menos importante, la entomología (Fernández, 1981). La muerte de un ser vivo lleva consigo una serie de cambios y transformaciones físicoquímicas (Torrez et al. 2006), atrayendo una variedad de insectos y otros invertebrados (Kenneth, 1973), que hacen de este cuerpo sin vida un ecosistema dinámico y único (Torrez et al., 2006) que va reduciendo éste a lo que conocemos como "restos áridos". Los artrópodos están usualmente entre los primeros y más importantes invertebrados que colonizan un cadáver y siguen una secuencia de sucesión predecible en carcasas animales (Iannacone, 2003). La entomología es usualmente aplicada como ayuda en el establecimiento del tiempo de muerte, como un factor importante en algún crimen (Kenneth, 1973). Tras la intervención de Megnin en numerosos casos de la práctica judicial, valorando la intervención de los insectos en el proceso de destrucción de la materia orgánica, dicho autor recopiló sus experiencias, publicando en 1894 su conocida obra La faune des cadavres, con la que sentó las bases científicas de la entomología cadavérica (Romero-Polanco et al., 2006). Megnin divide en cuatro periodos la colonización del cuerpo desde el momento en que exhala el último suspiro, hasta la desaparición completa de las partes blandas, los cuales son llamados de la siguiente forma: a) Primer periodo o sarcofágico, dura tres meses (Figura 1) Fuente. Grassberger, et al., Figura 1. Adulto de Chrysomya albiceps, díptero representativo del periodo sarcofágico. 2

13 b) Segundo periodo o dermesteriano tiene una duración de 3 a 4 meses (Figura 2) Fuente. Leccese, 2004 Figura 2. Adulto de Dermestes maculatus representante del periodo dermesteriano. c) Tercer periodo o silfiano, dura de 4 a 8 meses (Figura 3). Fuente. Figura 3. Nicrophorus orbicollis representante del periodo silfiano d) Cuarto periodo o acarino tiene una duración aproximada de de 6 a 12 meses (Figura 4) Fuente. Bennett ywebb, 1985 Figura 4. Larva de Eutrombicula belkini, representante del cuarto periodo Estos cuatro periodos se suceden con regularidad, pero una vez pasado el primer periodo los que siguen pueden presentarse conjuntamente, así se ve con frecuencia que mientras una 3

14 parte del cadáver está ocupado por escuadras de trabajadores del segundo periodo, en otra parte ya existen algunos del tercero, y todavía no han desaparecido éstas por completo, cuando alguna parte del cuerpo, entra en vías de momificación, gracias al trabajo de ciertos ácaros (Marín-Retiff, 1996). Puede afirmarse que en los últimos años ha comenzado un verdadero resurgir de la entomología cadavérica, con la aparición de un amplísimo grupo de trabajos sumamente interesantes para conseguir un mayor conocimiento de la misma, no limitándose sus aplicaciones al establecimiento del intervalo postmortem (Romero-Polanco et al., 2006). Mediante la identificación de los insectos presentes y sus estadios de vida, es posible estimar cuanto tiempo el cuerpo ha estado muerto y donde ocurrió la muerte del cadáver (Iannacone, 2003). Diversos autores señalan la conveniencia de repetir aquellas observaciones en las diferentes localidades, habiéndose denunciado la ausencia de extensas investigaciones sistemáticas que permitieran establecer particularidades para las diferentes regiones geográficas (Romero-Polanco et al., 2006). La toxicología médico legal ha tenido la labor de aportar pruebas en caso de crimen por envenenamiento, o bien esclarecer la etiología de las intoxicaciones, si éstas son de origen suicida, si es accidental debida a una causa fortuita, o bien en caso de homicidio, cuando la es intencional y con propósitos criminales (Fernández, 1981). La entomotoxicología es el área especializada de la entomología y de las ciencias forenses que se encarga de la determinación cualitativa y/o cuantitativa de sustancias toxicas en artrópodos en restos humanos (Gagliano-Candela y Aventaggiato, 2001). 1.1 Cocaína La cocaína es un alcaloide extraído de las hojas del arbusto Erythroxylon coca (Figura 5), que crece mayormente en Sudamérica (Lange y Hills, 2001) en regiones cálidas y húmedas entre m sobre el nivel del mar. Perteneciente a la familia de las eritroxiláceas, con hojas alternas, aovadas y enteras, flores blanquecinas y fruto en baya pequeña y roja, crece 4

15 hasta una altura media de un metro y contiene hasta alcaloides distintos de los que el más conocido y estudiado es la cocaína. Existen entre setenta y cinco y doscientas cincuenta especies de eritroxiláceas, aunque las más extendidas son la Eritroxylon coca lam y la Erytroxylon novogratense, destinadas en la región andina al cultivo para consumo tradicional y su transformación en cocaína. (Pascual et al., 2001). Fuente. Herbario ENCB, IPN Figura 5. Eritroxylon coca lam En Sudamérica y Centroamérica el habito de masticar hoja de coca se remonta a tiempos muy antiguos, pero fue hasta que los primeros exploradores llevaron a Europa noticias sobre la planta y sus propiedades (Arif, 1988) (Tabla 1). 5

16 Tabla 1. Aportaciones más importantes sobre el uso y descubrimiento de la cocaína. Acontecimiento Pizarro Encontró que la corte del imperio Inca, usaba la coca como un privilegio. Se producían panes de coca 1551 y 1567 La Iglesia intentó suprimir su consumo al considerar que iba unido a rituales profanos, condenándola por estar unida a la idolatría y a la hechicería LA COCA DURANTE EL SIGLO XIX J.J. von Tschudi Escribió el libro llamado Travels in Perú, en el que plasmó como los porteadores del Perú podían pasar cinco días sin tomar alimento alguno y durmiendo muy poco gracias al consumo de coca Paolo Mantegazza Destaca el efecto exaltante y recomienda para las enfermedades nerviosas. 1876, La revista Lancet en un artículo de Dowdeswell que describe los primeros efectos negativos tales como cambios en el pulso y en la temperatura. A finales del siglo XIX Alrededor de diez millones de indios de América del Sur seguían con su costumbre de mascar coca. Fuente: Pascual et al., 2001 El uso de la coca data desde el año 5000 a.de. C. y se ha observado en restos funerarios del 2500 a. de C. En objetos precolombinos de 1000 a. de C. y en estatuillas encontradas en las costas de Ecuador y Perú datadas en el s. III a. de C. (Pascual et al., 2001). Uno de los usos más extendidos fue entre los braceros al norte de los Andes para no notar el cansancio, en 6

17 las grandes caminatas, mascaban hojas de coca, para calmar el hambre y la sed. Las distancias se contaban por cocadas, es decir, por descansos durante los cuales se volvía a mascar las consabidas hojas de coca cuyo efecto no solía rebasar los tres cuartos de hora, la cocada era tanto una unidad de tiempo como de espacio (Pascual et al., 2001). En 1859, Albert Niemann, aisló el alcaloide principal de la coca: la cocaína. Entre 1863 y 1865, un químico austriaco, Wilhem Lossen, descubrió que la fórmula química de la cocaína es C 17 H 21 N O 4 (Pascual et al., 2001). Durante 1880 la cocaína se consideraba toda una panacea, e incluso se podría prescindir de los asilos para alcohólicos, y conseguir su cura radical en 10 días. Angelo Mariani, químico de Córcega, embotelló y vendió el Vin Mariani, e incluso el Papa León XIII prestó su efigie para la etiqueta y concedió la medalla de oro a su inventor. (Pascual et al., 2001) Los principales modos de administración son: masticación (hojas), inhalación (clorhidrato de cocaína), inyección (clorhidrato de cocaína), fumar (pasta de coca) (Arif, 1988). El clorhidrato de cocaína se descompone cuando se calienta. Ésta puede ser tomada oral, intravenosa o intranasalmente. La base libre es manufacturada procesando la cocaína con amonio o bicarbonato de sodio para remover el clorhidrato. Esta forma es termoestable y se funde a 98 o C, lo que permite que sea fumada. A esto se le conoce como crack porque es el sonido que se produce cuando es calentada (Lange y Hills, 2001). El clorhidrato de cocaína se absorbe bien a través de todas las membranas mucosas, los consumidores crónicos alcanzan una alta concentración sanguínea principalmente por administración intranasal, sublingual, intravaginal o rectal. En comparación con la inyección intravenosa de cocaína, la administración por mucosas resulta ser de acción más lenta, un efecto pico más tardado, y una larga duración de acción (Tabla 2). 7

18 Tabla 2. Farmacocinetica de cocaína de acuerdo a la ruta de administración Vía de Inicio de acción Pico máximo Duración de administración acción Inhalación 3-5 s 1-3 min 5-15 min (fumada) Intravenosa s 3-5 min min Intranasal u otra 1-5 min min min mucosa Fuente. Pascual et al., La cocaína es metabolizada por el plasma y colinesterasas hepáticas a metabolitos solubles en agua (principalmente benzoilecgonina y ecgonina metilester) que son excretados en orina. La vida media sérica de la cocaína es de 45 a 90 minutos; solo el 1% de la droga puede ser recuperada en la orina después de ser ingerida. Así la cocaína se puede detectar en la sangre o en la orina en tan solo 4 horas después de su uso. Sin embargo, sus metabolitos son detectables en la sangre o en la orina de 24 a 36 horas después de la ingestión proporcionando así un indicador útil de reciente consumo de drogas (Pascual et al, 2001). Cuando se administra de manera sistémica, sus efectos están mediados a través de alteraciones en la transmisión sináptica. La cocaína bloquea la recaptación pre sináptica de noradrenalina y dopamina, produciendo un exceso de estos neurotransmisores en el sitio de receptor postsinaptico. (Lange y Hills, 2001). El aumento de dopamina en las estructuras límbicas y prefrontales se vincula con los efectos placenteros de refuerzo, y un exceso de la misma produciría rabia, agresividad, alucinaciones y delirios. El aumento de noradrenalina se relaciona con el estado simpático de alerta, taquiarritmias e hipertensión arterial y el de serotonina con las variaciones del ánimo, temperatura, apetito y sueño. La inhibición prolongada de la recaptura de dopamina se vincula con un estado de virtual depleción del neurotransmisor acompañado de una 8

19 supersensibilidad de receptores que se asocia a los síntomas el hambre o anhelo de droga (Toro y Rudelir, 2004). Los riesgos del consumo de cocaína además de su potencial de adicción, son arritmias cardiacas (aparato cardiovascular), isquemia del miocardio, miocarditis, disección aortica, vasoconstricción cerebral y convulsiones (Sistema Nervioso Central). La cocaína produce un incremento dependiente de la dosis en la frecuencia cardiaca y la presión arterial, aunado a un aumento de la excitación, rendimiento mejorado en las tareas de vigilancia y alerta, y sensación de confianza en sí mismo. El daño que produce tanto en Sistema Nerviosos Central como en Sistema Nervioso Periferico se debe al bloqueo de la captación de catecolaminas. También son frecuentes los trastornos psiquiátricos, como ansiedad, depresión y psicosis. Se ha informado que la cocaína genera un orgasmo prolongado e intenso si se administra antes del coito, y su utilización se relaciona con una actividad sexual compulsiva y promiscua. Sin embargo, a largo plazo, su consumo suele culminar en disminución del impulso sexual. El consumo en mujeres embarazadas pueden tener trabajo de parto prematuro y desprendimiento prematuro de placenta. (Goodman y Gilman, 2006) 9

20 2. ANTECEDENTES Desde el primer registro del uso de la entomología en un caso criminal hace 13 siglos en China, los trabajos en entomología forense han sido esporádicos (Kenneth, 1992). El primer caso de entomología forense fue documentado en The Washing Away of Wrongs en el que se describe el caso de un asesinato de un campesino de una aldea china, que fue encontrado asesinado a machetazos por una hoz de mano, lo que sugirió que otro trabajador campesino había cometido el asesinato. El magistrado realizó la investigación llamando a todos los campesinos locales para que cada uno llevara sus hoces de mano a la plaza del pueblo y una vez reunidos colocaron sus hoces en el suelo, cuando aparecieron moscas verde metálico brillante que comenzaron a centrarse en una de las hoces de mano en específico. El conocimiento del juez de la aldea sobre la conducta de un grupo de insectos específicos con respecto a su atracción al tejido humano muerto fue la clave para resolver este acto violento y la justicia se sirvió en la antigua China. A finales de 1800 fue usada esporádicamente en Europa la aplicación de entomología forense para la determinación del tiempo de muerte, y en mayor grado en los Estados Unidos. La mayoría de los textos publicados sobre medicina forense e investigación de la muerte han proporcionado poca información práctica sobre el uso e importancia de la entomología, parte de la investigación y estudios de casos relacionados sobre éste tema han sido publicados principalmente en revistas entomológicas (Rodríguez III, 1988). La descomposición de los cuerpos humanos es diferente según el clima (fresco o cálido) y la zona, ya sea urbana o rural (Barreto et al., 2002). La descomposición comienza por la acción de los microorganismos como hongos y bacterias, después una serie de artrópodos continúa con la descomposición, predominando los insectos sarcosaprófagos. Payne menciona que existe una notable diferencia en el proceso de descomposición relacionada básicamente en el tiempo de desintegración que depende de la presencia o ausencia de insectos (Carvalho et al., 2000). La identificación de insectos asociados con cadáveres humanos es relativamente escasa en la literatura de la región neotropical (Tabla 3). 10

21 Tabla 3. Trabajos de entomología forense realizados del año 1916 a 2000 Autor Trabajo Dunn. Reporto a Hermetia illuscens en Panamá Pessôa and Lane. Presenta registros de Scarabaeidae necrophilus en Brasil Jirón. Muestran información sobre Jirón et al Jirón y Solano. Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae y Stratiomyidae en Costa Rica Baumgartner y Greenberg. Presencia de un total de 70 insectos adultos son colectados de 12 cuerpos humanos, también 2 hembras del género Sarcophagidae, así como Chrysomya megacephala y Chrysomya rufifacies, especies que arriban en el Sur y Centro de América, de África y Australia respectivamente Dear. Identifica ejemplares de la familia Calliphoridae Baumgartner y Greenberg. Encontraron que hay una alta competencia entre especies de Cochliomyia y Chrysomya por los cadáveres humanos en algunas áreas en Cali Colombia Greenberg. Ambas especies fueron reconocidas por en el Norte de América Olaya Estudios en carcasas de perros Carvalho et al Identifica artrópodos asociados con la carroña de los cerdos y cuerpos humanos en Campinas, Estado de São Paulo, Brasil. Fuente: Barreto et al.,

22 Recientemente, algunos estudios experimentales de entomología forense tienden a ser realizados en diferentes regiones de Colombia entre los que podemos mencionar los realizados por Idrobo y Martínez 2000, Restrepo et al. 2000, Wolff y Uribe En Cali, Olaya en 1999 determinó la sucesión de artrópodos y la velocidad de descomposición en perros, pero aparentemente no la identificación específica de insectos hallados en cuerpos humanos. Entre 1990 y 1991 se descubrieron insectos sobre 16 cadáveres humanos son colectados en el Instituto de Medicina legal de Cali (Barreto, et al., 2002). Uno de los países latinoamericanos que ha utilizado esta herramienta de forma ordinaria y ha presentado avances importantes en la fauna cadavérica de la región es Brazil, los primeros reportes publicados corresponden entre 1908 y 1940 directamente influenciados por las ideas de Megnin, desde 1991 aparecieron reportes que describen los insectos asociados con carroña (Moura et al., 1997). Si bien ha podido comprobarse la coincidencia de familias y géneros de insectos de los que suelen acudir a los cadáveres en muy diferentes y distantes puntos geográficos, es necesaria la realización de investigaciones sistemáticas que permitan establecer las peculiaridades de la fauna cadavérica en cada región geográfica. Algunos estudios de este tipo se han realizado en diversas zonas del planeta, en la provincia de Cádiz en el sur de España en cadáveres de perros realizado en tres épocas estacionales y en diferentes zonas: zona de marismas, zona de campiña y zona de serranía (Romero-Polanco et al., 2006) Estudios previos han demostrado que la mayoría de las sustancias involucradas en muertes relacionadas con drogas son detectables por medio de análisis de gusanos que se alimentan del cuerpo (Campobasso et al. 2004). La entomotoxicología es una herramienta que tiene dos problemas a resolver: a) La identificación y cuantificación de xenobióticos en artrópodos que se alimentan de carroña, y su relevancia en la evaluación toxicológica de las causas y circunstancias de muerte. De acuerdo a la literatura las drogas detectadas en 12

23 larvas incluyen barbitúricos, benzodiacepinas, antidepresivos, opiáceos, derivados de anfetaminas, cocaína y/o benzoilecgonina, trazodona, acetaminofén, salicilatos y malation. b) El estudio de cambios inducidos por droga en el crecimiento de artrópodos con respecto a la estimación del intervalo post-mortem por métodos entomológicos (Tracqui et al., 2004). En los cuerpos en descomposición, las larvas de moscas pueden ser usadas como sustrato para análisis toxicológico y proveer información cuando se sospecha de envenenamiento. Las larvas de la clase Diptera son frecuentemente usadas en cuerpos descompuestos después de un tiempo largo cuando las muestras tradicionales de tejidos para análisis toxicológico como sangre, orina u órganos sólidos han desaparecido (Campobasso et al., 2004). El análisis toxicológico usado para materiales de insectos son generalmente los mismos usados para tejidos humanos y fluidos biológicos e incluyen radioinmunoensayo (RIA), cromatografía de gases (GC), cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) y cromatografía de líquidos de alta resolución/espectrometría de masas (HPLC- MS) (Campobasso et al., 2004). La historia de la entomotoxicología es relativamente corta. El primer reporte fue de Sohal y Lamb en 1970, demostró la acumulación de diferentes metales, incluyendo cobre, fierro, zinc y calcio, en tejido de moscas adultos. En 1982 Nourteva describe la recuperación de mercurio en varias especies de califóridos. Posteriormente Gunatilake y Goff detectan el plaguicida malation. En 1980 el primer artículo sobre fenobarbital fue publicado por Beyer et al. En casos entomológicos otros autores también analizan las muestras para drogas y narcóticos, en particular triazolam, oxazepam, fenobarbital, alimemazina, clomipramina, bromazepam, levomeprazina y clomipramina, morfina, cocaína, amitriptilina y nortriptilina, propoxifeno y acetaminofén, opiáceos, temazepam, trazodona y trimipramina, salicilatos, paracetamol, aminohipurato (Gagliano-Candela y Aventaggiato., 2001). 13

24 3. JUSTIFICACIÓN La aplicación de los conocimientos de la entomología forense en la toxicología podría convertirse en determinante en los casos de difícil diagnóstico de la posible causa de muerte, cuando esta pudiera estar relacionada con el consumo de drogas y que por el estado avanzado de descomposición del cadáver no se cuente con los tejidos idóneos para realizar dichas pruebas toxicológicas. Por tal motivo, el utilizar las larvas y/o adultos de artrópodos que se alimentan de los cadáveres es una alternativa en el análisis toxicológico forense. Al administrarse clorhidrato de cocaína; a ratas y luego sacrificarlos, estos cadáveres atraerán diversas especies de artrópodos que se alimentarán de los mismos e incorporarán la droga y sus metabolitos que fueron previamente administrados, por lo que se espera encontrar la sustancia en el cuerpo de dichos artrópodos. Considerando lo anterior de igual forma al analizar la entomofauna presente en cadáver en estado avanzado de descomposición se espera encontrar la droga y sus metabolitos cuando se sospeche de su consumo. 14

25 4. HIPÓTESIS Los metabolitos de clorhidrato de cocaína pueden aislarse de los artrópodos que colonizan el cadáver, si en sus tejidos se encuentra este compuesto. 15

26 5. OBJETIVO GENERAL Determinar los metabolitos de clorhidrato de cocaína en muestras de entomofauna cadavérica obtenidas de cadáveres de ratas previamente tratadas, así como la identificación de los artrópodos que colonizan el cadáver en diferentes épocas del año en una zona de la Delegación Cuauhtémoc del Distrito Federal. 6. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Determinar los metabolitos del clorhidrato de cocaína en los artrópodos presentes en cadáveres de ratas previamente tratados. 2. Proponer la técnica adecuada para la determinación de metabolitos de clorhidrato de cocaína en entomofauna cadavérica. 3. Identificar las especies de artrópodos que colonizan los cadáveres de ratas previamente tratados con el clorhidrato de cocaína en la zona urbana del Distrito Federal. 16

27 7. MATERIAL Y MÉTODOS Con base a los resultados del estudio preliminar hecho en la época de otoño-invierno , en una zona del Distrito Federal en las coordenadas y Se determinaron las dosis para los experimentos posteriores tomando como dato la dosis mínima letal de cocaína 1.2 g (Moffat et al., 1986) (Tabla 4), así como el volumen de distribución a fin de comprobar que la dosis administrada se distribuyera de forma homogénea en todo el organismo. El número de animales de experimentación por lote fue de 5 individuos con un total de 20 y el tiempo entre la administración y el sacrificio por dislocación cervical fue de 1 hora, así como el tiempo total de exposición fue durante 27 días. Tabla 4. Asignación de la dosis administrada a cada uno de los ejemplares. Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 4 0 g/kg 0.3 g/kg 0.75 g/kg 1.2 g/kg Cada una de las diferentes cantidades fue disuelta en 0.3 ml de solución salina 0.85 % e inyectada vía intraperitoneal en el individuo correspondiente y fueron sacrificados una hora después de la administración y expuestos a temperatura ambiente. Los ejemplares son expuestos en un área total de 4 m 2, que está totalmente descubierta para estar expuesta a lluvia, polvo, luz, etc., la distribución de los cuerpo se realizó de forma lineal para cada uno de los diferentes (Figura 6) Figura 6. Representación de la distribución de los cadáveres en donde se muestran los diferentes lotes. El lote No. 1 es el grupo testigo, en el lote 2, se administró 0.3 g/kg de solución de clorhidrato de cocaína, en el lote 3, se administró 0.75 g/kg de solución de clorhidrato de cocaína, en el lote 4, se administró 1.2 g/kg de clorhidrato de cocaína. 17

28 7.1 Análisis presuntivo para la determinación de metabolitos de clorhidrato de cocaína Se realizó una curva con los controles de concentración conocida (150 ng/ml, 300 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml) de cocaína de la marca Dade Behring utilizado para el equipo Viva Twin. Para este análisis se colectaron 3 g de larvas de dípteros en cada uno de los ejemplares, durante el tiempo de monitoreo del experimento en cada una de las estaciones. El procedimiento para la extracción de la droga de la matriz biológica, es la siguiente: 1 g de muestra se le agregaron 2 ml de metanol, se trituró con homogeneizador de tejidos, se agitó en vortex por 5 minutos (Perrigo y Joynt, 1989) y se centrifugaron 5 minutos (3000 r.p.m.) y el sobrenadante es separado y analizado por la técnica EMIT (Asselin et al., 1988). Las muestras de resultado positivo para la técnica EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) se procesan para el análisis confirmativo. 7.2 Análisis confirmativo para la determinación de metabolitos clorhidrato de cocaína Los aparatos digestivos resultantes de 1 g de muestra de larvas de dípteros con 3 ml de agua bidestilda son triturados con un homogeneizador de tejidos, esta mezcla fue colectada en un embudo de separación en donde se agregarón 6 ml de hexano, se agitó vigorosamente por 1 minuto y se desechó la fase orgánica. Ésto se realizó en una segunda ocasión, a la fase inorgánica se le agregarón 6 ml de una mezcla de cloroformo: isopropanol: amoniaco (78:20:2) y se llevó a cabo la extracción, recuperando la fase orgánica, este procedimiento se realizó dos veces más, la fase recuperada en las tres extracciones se evaporó bajo corriente de nitrógeno, y se añadió 100 µl de BSTFA + TMCS (N,O-bis(trimethylsilil) trifluoroacetamide y trimethylchlorosilane) y fue sometido a 70 C durante 15 minutos; después de este procedimiento se inyectan 2 µl en el cromatógrafo Agilent 6890N con un detector de masas Agilent 5973N en modo splitles. Las condiciones de operación fueron las siguientes: la temperatura del inyector es de 250 C en modo splitless, la temperatura inicial del horno es 100 C por 3 minutos, para después aumentar 25 C/min hasta llegar a 300 C y mantenerse 15minutos, la presión fue de psi, flujo total de 32.7 ml/min, el gas acarreador fue helio, Columna HP-5MS 5 % fenil metil siloxano, la operación del detector de masas se realizó en forma scan con un intervalo de detección de masa menor de 82.0 m/z y de masa mayor de 370 m/z. Para detectar la benzoilecgonina-tms los iones buscados son 82, 240,361 m/z, para ecgonina metil ester 82, 96, 271 m/z, para cadaverina tri-tms son 174, 73 y 303 m/z. Solo algunas drogas pueden ser determinadas en escarabajos o en sus exuvias, y esto se logra utilizando métodos para extracción de la sustancia en cabello. (Gagliano y Aventaggiato, 2001) por lo tanto las muestras de escarabajos, se trituraron con 10 ml de HCl 10% y se incubó a 80ºC por 24 h, pasado este tiempo fue filtrado y recuperada la fase del HCl y se realizó la extracción con una mezcla de cloroformo: isopropanol: amoniaco (78:20:2) que fue agregada en proporción 2:1 respecto al volumen obtenido del filtrado, la 18

29 extracción con la mezcla se realiza 2 ocasiones más, al reunir las 3 porciones resultantes de las extracciones son evaporadas bajo flujo de nitrógeno y se añade 100µL de BSTFA y es sometido a 70 C durante 15 minutos para ser inyectado en el CG-EM mediante el mismo método utilizado para larvas de dípteros. 7.3 Identificación taxonómica de larvas de dípteros Se tomarón 10 ejemplares más y se sacrificarón sumergiéndolos en agua caliente, para después transportarse en etanol al 70% (Lord y Burger, 1983). A dichos ejemplares se les realizó el procedimiento de fijación, el cual consiste en: 1. Realizar un corte de forma sagital en la larva 2. Retirar el contenido del espécimen ayudándose de una solución de KOH al 10% a 90ºC durante 15 minutos. 3. Lavar con agua corriente 4. Lavar con agua destilada 5. Sumergir en agua acidulada (acido acético) 10 minutos 6. Deshidratar en alcohol al 70 % por 15 minutos 7. Deshidratar en alcohol al 80 % por 15 minutos 8. Deshidratar en alcohol al 90 % por 15 minutos 9. Deshidratar en alcohol al 96 % 15 minutos 10. Sumergir en xilol 30 minutos, y fijar en resina.(alejandre-aguilar y Martin- Frias, 1996) 19

30 8. RESULTADOS 8.1 Análisis presuntivo para la determinación de clorhidrato de cocaína El número total de muestras utilizadas para esta fase estuvieron determinadas por la cantidad de tomas durante la duración del periodo larvario, especifico para cada una de las épocas estacionales (Tabla 5). Tabla 5. Tabla comparativa entre la temperatura media por estación y el periodo de duración del periodo larvario Estación Temperatura C Duración periodo larvario Inicio toma de muestra Fin de toma de muestra Verano Día 2 Día 11 Otoño Día 10 Día 26 Invierno Día 14 Día 26 Primavera Día 7 Día 14 Así mismo el número de días en que se obtuvieron resultados positivos durante el periodo de descomposición para todas las dosis administradas (Tabla 6) Tabla 6. Periodo con obtención de resultados positivos dentro del intervalo total de descomposición Estación Intervalo de días de descomposición Verano Del día 2 al día 9 Otoño Del día 10 al día 24 Invierno Del día 14 al día 26 Primavera Del día 7 al día Análisis confirmativo para la determinación de clorhidrato de cocaína Después de haber inyectado las muestras en el cromatografo de gases acoplado a Espectrometria de Masas se obtuvieron tanto los cromatogramas como los espectros de masas. En los cromatogramas mostrados para cada uno de los compuestos identificados se puede observar que en la parte superior denominada como a se muestra el corrimiento total de la muestra en donde cada uno de los picos cromatográficos representa un compuesto específico el cual fue eluido en un tiempo (minutos) definido según el método utilizado, así como la abundancia en la que se presenta; y en la parte inferior denominada como b se logra observar la imagen amplificada en donde se especifican el pico que representa el metabolito de importancia (Figuras 7,9,11) 20

31 Para las imágenes en las que se muestra los espectro de masas resultantes, en la parte superior denominada como a se encuentra el espectro correspondiente a nuestra muestra problema, enmarcando con un círculo rojo los iones principales que permiten la identificación del compuesto, así mismo, también se muestra la estructura química, formula condensada y nombre; y en la parte inferior de la imagen llamada b se encuentra el espectro del compuesto proveniente de la biblioteca NIST 05 con el cual se corrobora la identidad del compuesto detectado (Figuras 8,10,12) Fig.7 Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto benzoilecgonina-tms. a) Corrimiento total de la muestra R9-1. b) Acercamiento del pico cromatrográfico de la benzoilecgonina-tms, en el minuto

32 Figura 8.Espectro de benzoilecgonina-tms. a) Espectro de masas de la muestra R9-1 indicando los iones principales. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05 para el compuesto benzoilecgonina-tms 22

33 Fig.9. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto ecgonina metil éster. a) Corrimiento total de la muestra R9.b) Acercamiento del pico cromatrográfico de la ecgonina metil éster, en el minuto

34 Figura 10.Espectro de ecgonina metil éster. a) Espectro de masas de la muestra R9 indicando los iones principales encontrados. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05 para el compuesto ecgonina metil éster 24

35 Fig.11. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del compuesto cadaverina tri-tms. a) Corrimiento total de la muestra R9.b) Acercamiento del pico cromatrográfico de la cadaverina tri-tms, en el minuto

36 Figura 12.Espectro de cadaverina tri-tms. a) Espectro de masas de la muestra R9 indicando los iones principales encontrados. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05 para el compuesto cadaverina tri-tms. 26

37 8.3 Identificación taxonómica Se observó la colonización de diferentes especies de artrópodos sobre los cadáveres de las ratas los cuales fueron identificados, entre los que se encontraron ejemplares de los ordenes Diptera y Coleoptera (Tabla 7) Tabla 7. Especies de ejemplares del orden Diptera y Coleoptera identificadas taxonómicamente Orden: Diptera Orden: Coleoptera Lucillia sp. Dermestes maculatus Chrysomia sp Necrobia rufipes Calliphora sp Saprinus sp Sarcophaga sp. Hydrotaea capensis Las partes importantes para la identificación taxonómica de las larvas de dípteros son: estigmas respiratorios posteriores, estigmas respiratorios anteriores, aparato cefalofaringeo y la presencia de espinas o procesos carnosos (Figura 13). Figura 13. Larva de díptero con estructuras anatómicas de utilización para identificación taxonómica. 27

38 En base a las estructuras antes mostradas se identificaron diferentes especies de dípteros en estadio larvario, así mismo se muestra el estadio adulto correspondiente a cada uno y las estaciones en las que estuvieron presentes colonizando los cadáveres de ratas.. Hay que observar que tanto el tamaño como las estructuras externas en las larvas son diferentes, de esta forma es fácilmente apreciar una diferencia muy marcada en la larva del genero Chrysomya que muestra procesos carnosos a diferencia de las demás que solo presentan espinas distribuidas a todo lo largo del cuerpo. Los estigmas respiratorios posteriores pueden presentar el peritrema abierto o incompleto como en el caso de Sarcophaga sp., o presentar este peritrema mas grueso como en el caso de Chrysomya, o peritrema completo como en el caso de Calliphora sp. y Lucillia sp., en el caso de los adultos es bastante observable la diferencia de colores entre ellas, Lucillia sp. muestra un color verde metálico con una coloración roja marcada en los ojos, los ejemplares del género Chrysomya sp. También son llamadas moscas azules por su coloración azul metálico o en el caso de Sarcophaga sp. La disposición de las bandas blancas y negras en el torax y la presencia de un abdomen ajedrezado, sólo por mencionar algunas características (Figura 14) 28

39 Especie Larva Estigmas respiratorios posteriores 10x Lucillia sp. Espinas 10x Estigmas respiratorios anteriores 10x Aparato cefalofaringeo 10x Adulto Aparición en estación Predominando en primavera y verano Chrysomya sp. Calliphora sp. Sarcophaga sp. Otoño Invierno Menor en Verano y primavera Predominando en invierno, menor en verano, primavera y otoño Verano Primavera Menor en Otoño e Invierno Figura 14. Esquematización de las especies de dípteros identificados taxonómicamente, con las estructuras en estadio larvario y ejemplar de adulto, y la presencia de los dípteros en las épocas estacionales. 29

40 También se identificaron otras especies de artrópodos en estadio adulto colonizando los cadáveres de ratas, entre los cuales encontramos ejemplares del género Saprinus, Dermestes y Necrobia rufipes, los cuales son representantes del Orden Coleoptera, los cuales se presentaron colonizando los cadáveres de ratas en las estaciones de primavera y verano; otra especie de dípteros que se presentaron fueron ejemplares de Hydrotea capensis que están relacionados con parasitismo hacia otros dípteros pero no están relacionados específicamente con la sucesión cadavérica, sin embargo, pueden influir de forma indirecta en el tiempo de descomposición de un cuerpo (Figura 15) Saprinus sp Necrobia rufipes Dermestes sp Hydrotea capensis (díptero) Figura 15. Ejemplares de coleópteros y díptero colonizadores de cadáveres. 8.4 Relación entre especies colonizadoras y temperatura Al ocurrir la sucesión cadavérica el factor más crítico fue la temperatura, (Lord y Burger, 1983) de la cual va a depender el tiempo de aparición y variabilidad en el número de especies. Por esta razón consideramos importante el hecho de monitorear la temperatura ambiental para poder comparar entre una y otra estación, y la probable repercusión en la diversidad de fauna cadavérica. Los datos de temperatura fueron obtenidos de la página oficial del Servicio Meteorológico Nacional. La diversidad de artrópodos en cada una de las épocas estacionales en cuanto a su tiempo de aparición dentro del periodo total de descomposición, es diferente e incluso podemos encontrar a ejemplares de distintas familias conviviendo en armonía en la ardua labor de alimentarse de los diferentes tejidos de un cuerpo, en nuestro experimento logramos observar la presencia de varios grupos de artrópodos y su colonización respecto al tiempo. El tipo de artrópodos presentes en todas las estaciones fueron los dípteros, los ejemplares 30

41 del Orden Coleoptera sólo se presentaron en primavera y verano, ya que en estas estaciones del año se presenta la temperatura adecuada para su desarrollo, aunque la función de éstos dentro de la sucesión cadavérica no es descomponer los tejidos blandos, se encuentran desde el principio de la exposición ya queen los primeros días depositan los huevos para que cuando los dípteros hayan realizado su función las larvas de los coleópteros se dediquen a descomponer la piel y anexos, los himenópteros sólo se presentaron en verano e invierno por la misma razón de la temperatura mayor en comparación con los ácaros que se presentaron en una sola estación y por un periodo muy corto (Tabla 9) Cabe mencionar que cada uno de los grupos de artrópodos realiza una función específica sobre la descomposición de los tejidos de los cuerpos pero pueden estar conviviendo en un mismo momento, es decir, no es necesario que termine el periodo sarcofagico para que comience el periodo dermesteriano y así sucesivamente. Tabla 8. Aparición de artrópodos durante el periodo de exposición del cadáver. Día Verano Otoño Invierno Primavera Dípteros Coleópteros Himenópteros Ácaros 31

42 9. DISCUSIÓN El uso más amplio que se les ha dado a los insectos en el área legal es la estimación del tiempo post-mortem, porque diferentes artrópodos son atraídos por los distintos estados de descomposición de un cadáver, lo que produce una sucesión de ellos (Benecke, 1998), pero debido a las variaciones apreciadas entre la fauna cadavérica se hace necesario conocer la influencia que puede tener el medio geográfico y las condiciones climáticas en dicha sucesión, por lo que surge la necesidad de realizar estudios experimentales de la fauna tanatológica a nivel local, debido a que no existe registro alguno en el Distrito Federal, y con ello se podría mejorar la aplicación práctica de estos conocimientos. Ya que las condiciones climatológicas son suficientes para modificar la evolución espontánea de la putrefacción cadavérica en uno u otro medio, así como para influir en la mayor o menor riqueza entomológica de la zona e incluso sobre la duración del ciclo biológico de las diferentes especies (Romero-Polanco et al. 2006). Lo que se logró observar desde el estudio preliminar en donde se presentó exclusivamente la colonización por especies de dípteros. En los 4 experimentos posteriores correspondientes a las 4 estaciones del año mostraron una marcada diferencia en cuanto al número de familias representantes de 2 órdenes diferentes: Diptera y Coleoptera; pudiendo observar que en todas las estaciones se presentaron ejemplares de las familias Sarcophagidae y Calliphoridae, pero su tiempo de permanencia fue mayor durante la época de primavera y verano predominando los ejemplares de la amilia Sarcophagidae; los adultos representantes del orden Coleoptera permanecieron menor tiempo y aparecieron de forma intermitente, es decir al principio de la descomposición fueron atraídos los adultos y depositaron sus huevos, pero como avanzaba el estado de descomposición fue haciéndose notable la ausencia gradual de adultos y el aumento de larvas de coleópteros, ya que comenzaba el periodo de desecación para alimentarse de la piel y anexos, no es de extrañar que se hayan encontrado estos artrópodos ya que son los que comúnmente se han colectado alrededor de una escena del crimen a lo largo del mundo. Esto coincide con lo observado por Introna y colaboradores en Italia (1998); en Cali, Colombia por Barreto y colaboradores (2002), en Brazil por Carvalho y colaboradores (2000), en Tennessee por Rodriguez y Bass (1983), en las islas Hawaianas por Lee y Flynn (1991), en Tailandia por Sukontason y colaboradores (2001), entre muchos más, destacando un reporte de éstas y otras familias en una zona de Aguascalientes realizado por Martínez et al en 2009, sin duda una investigación que sirve para aportar una gran información en el área de entomología forense en nuestro país y específicamente en la zona mencionada, el trabajo antes mencionado también fue realizado en diferentes épocas estacionales (primavera, otoño y verano). Además, el hallazgo de estos tipos de artrópodos de acuerdo con el tiempo de exposición concuerda con lo encontrado por Lord y Burger en 1983, los cuales mencionan que los grupos de artrópodos más importantes durante los primeros dos meses de descomposición de un cuerpo son los pertenecientes al orden Diptera y Coleoptera. Sucediendo lo contrario en las estaciones frías en las que se presenta una exclusiva colonización de ejemplares de dípteros, lo que es un factor importante en el desarrollo de moscas (Ames & Turner 2003) esto es debido a que durante las temperaturas bajas del otoño e invierno el numero y tipos de insectos carroñeros es menor por lo tanto la degradación de los cadáveres es más lenta (Rodriguez y Bass 1983). Cabe mencionar que los artrópodos presentes en la descomposición que ocurrió en las ratas expuestas son 32