II CURSO INTERNACIONAL CULTIVO DE LA FRESA METODOS ALTERNATIVOS DE PRODUCCION DE PLANTA DE FRESA. MULTIPLICACION INDUSTRIALIN VITRO.

Transcripción

1 II CURSO INTERNACIONAL CULTIVO DE LA FRESA METODOS ALTERNATIVOS DE PRODUCCION DE PLANTA DE FRESA. MULTIPLICACION INDUSTRIALIN VITRO. J.M. López-Aranda CIFA Málaga-Churriana Consejería de Agricultura y Pesca. Dirección General de Investigación y Formación Agraria y Pesquera.

2 Métodos alternativos de producción de planta de fresa. Multiplicación industrial in vitro. Autor: J.M. López Aranda (CIFA Málaga-Churriana) Indice de la versión word para el II Curso Internacional Cultivo de la Fresa.

3 Boxus (+) (1974, 1975) diseñó un procedimiento industrial de multiplicación in vitro de plantas de fresa, a partir de ápices caulinares que se creía revolución en el sistema tradicional de producción de plantas de esta especie. La fresa fue la primera especie de interés agronómico en la que se uso masivamente el cultivo in vitro como procedimiento a escala industrial de producción de plantas. Dicho procedimiento fijaba con claridad las tres fases clásicas del cultivo in vitro;.- inicio (cultivo de meristemos).- multiplicación.- enraizamiento in vitro

4 Medio de cultivo para fase de INICIO propuesto por Boxus (1974,1975) *Medio solidificado con Agar. *Enriquecido con los elementos nutritivos clásicos adecuados: macroelementos, microelementos, vitaminas, hidratos de carbono, etc; *Añadiéndose una combinación de reguladores de crecimiento (fitohormonas) a base de: Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico), Citoquininas (0,1 mg/l de BA, BAP, benziladenina), Giberelinas (0,1 mg/l de GA 3 ). En concreto, sugería el medio de cultivo de Knop para la fresa. Esta fase de inicio, varias semanas de duración (3-6), permite producir una única planta a partir de cada ápice caulinar (meristemo) que es transferida a la fase de multiplicación.

5 Medio de cultivo para fase de MULTIPLICACION propuesto por Boxus (1974,1975) Mismo medio para la fase de inicio pero: Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico), Con concentración aumentada 10 X de benciladenina (1,0 mg/l de BA). Giberelinas (0,1 mg/l de GA 3 ). En este caso, debido a la acción de esta citoquinina benciladenina, que induce la formación de tallos axilares contrarrestando la dominancia apical, la plántula in vitro crece de modo distinto y se transforma en una masa (colonia) de yemas y tallos sin raíces. Esta fase de multiplicación se realiza en ciclos denominados subcultivos, de una duración entre 3 y 7 semanas, que produce una teórica progresión geométrica, cuya razón podemos denominar tasa de multiplicación (número de tallos producidos/tallo iniciado/subcultivo), oscilando dicha tasa entre 6 y 20 según autores.

6 Medio de cultivo para fase de ENRAIZAMIENTO propuesto por Boxus (1974,1975) Mismo medio para la fase de inicio pero: Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico), Retirando la citoquinina benciladenia, Giberelinas (0,1 mg/l de GA 3 ). Fase única de duración entre 4 y 6 semanas.

7 Este procedimiento industrial fue asumido con interés por los viveristas europeos, holandeses, franceses, británicos e italianos, principalmente, a finales de los años 70. También por parte de la Investigación pública Norteamericana y de países del Este (URSS, Polonia, Rumanía, etc.): Ya que suponía lo que se pensaba eran ventajas evidentes frente a la producción convencional de plantas in vivo de fresa: *Permitía el saneamiento del material (liberación de virus y otras enfermedades) en la fase de INICIO mediante el cultivo de cúpulas meristemáticas de tamaño inferior a 1 mm. *Asumía la posibilidad de realizar un número de ciclos de cultivo in vitro (subcultivos) ILIMITADO (ad infinitum) en la fase de multiplicación, lo que permitía la obtención de varios millones de plántulas/año a partir de un ápice caulinar (meristemo) iniciado. *Posibilitaba el USO DIRECTO de estas plantas, tras su aclimatación ex vitro, como productoras de fruto.

8 Sin embargo, es bien conocido, que desde los primeros años de uso de esta técnica de producción alternativa de plantas de fresa (micropropagación), comenzaron a observarse anomalías fisiológicas, fenotípicas y morfológicas. Con sus correspondientes consecuencias negativas de tipo agronómico, principalmente en los campos de fructificación. (por ejemplo, en la zona de cultivo italiana de Cesena en Emilia- Romagna), que contenían este tipo de material vegetal, directo ex vitro e incluso en la primera generación de multiplicación in vivo. Algunas Referencias de episodios de alteración fenotípica:

9 Aparición de rasgos de juvenilidad en plantas micropropagadas: incrementode yemas axilares y ramilletes florales: descenso del calibre de los frutos (Sansavini y Gherardi, 1980; Schaeffer et al., 1980; Swartz y Lindstrom, 1986). Aparición de Cambios morfológicos como enanismo o portes erectos y/o arbustivos, que se separaban de las características normales de las plantas multiplicadas convencionalmente. Aumento de susceptibilidad a ciertas enfermedades criptogámicas (D Ercole y Nipoti, 1979; Rancillac y Nourrisseau, 1980). En general, se describieron numerosos episodios de clorosis tipo "June yellows", "White streaks", y otros, así como aparición de individuos variegados.

10

11

12

13 Variantes somaclonales de Chandler

14 El conjunto de problemas descritos creó una polémica internacional sobre el tema desde principios de los años 80. Se cuestionó la técnica de cultivo in vitro de la fresa en Europa y Estados Unidos (California). Abandonando la mayor parte de los viveristas su utilización a escala industrial. Cayendo incluso en una pobre reputación (Dijkstra y Van Oosten, 1979, 1980) en Holanda, Jones (1987) en Inglaterra, Sansavini et al. (1982) en Italia, y Nelson (1987) en California, etc. Así, a modo de ejemplo, la producción italiana de plantas in vitro de fresa, que era de varios millones a finales de los 70 descendía a no más de plantas en 1989.

15 Las dudas sobre la estabilidad fenotípica del material vegetal de fresa multiplicado in vitro (micropropagado) y cultivado en campo a continuación, aún siguen vigentes en los tiempos actuales. De hecho, en el Informe Final del Meeting de Expertos en Frutas del ámbito de la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales (CPVO), celebrado en Angers (Francia) entre el 8 y el 9 de Octubre de 2002, se aprobó un nuevo test guía para los ensayos DHE para la protección comunitaria de variedades de fresa que introducía en el apartado de condiciones sobre el material vegetal a testar que éste no debería haber sido obtenido directamente por cultivo in vitro. Así, figuran las siguientes correcciones en el nuevo documento CPVO-TP/22/1 Draft-4 de 17 de Enero de 2003 (los países indicados son aquellos en los que la CPVO realiza estos tests en Europa, respecto a los que se realizan en España, nuestro equipo de trabajo en coordinación con la OEVV-MAPA, es el responsable de los mismos.

16 Las dudas sobre la estabilidad fenotípica del material vegetal de fresa multiplicado in vitro (micropropagado) y cultivado en campo a continuación, aún siguen vigentes en los tiempos actuales. A modo de ejemplo reciente: Informe Final del Meeting de Expertos en Frutas del ámbito de la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales (CPVO), celebrado en Angers (Francia) entre el 8 y el 9 de Octubre de 2002, se aprobó un nuevo test guía para los ensayos DHE para la protección comunitaria de variedades de fresa que: introducía en el apartado de condiciones sobre el material vegetal a testar que éste no debería haber sido obtenido directamente por cultivo in vitro. Así, figuran las siguientes correcciones en el nuevo documento CPVO- TP/22/1 Draft-4 de 17 de Enero de 2003:

17 3. Plant material requirements Survey of final dates for request for technical examination and sending of Technical Questionnaire by the CPVO as well as submission date of plant material by the applicant. Request of examination Plant material Plant material requirements FRANCE 15/07 31/08 40 well-rooted, vigorous, virus-tested potted fresh plants. Plants should not have been obtained directly by in vitro culture. GERMANY (v) 15/07 (s) 15/11 (v) 31/08 (s) 15/12 (v) 30 well-rooted, vigorous, virus-tested potted fresh plants. Plants should not have been obtained directly by in vitro propagation. (s) 1.5 g seed; minimum germination capacity 60% PORTUGAL 31/10 30/11 40 virus-tested plants packed in such a way as to prevent dehydration. Plants should not have been obtained directly by in vitro culture. SPAIN 31/07 15/10 30 well-rooted, vigorous, virus-tested, potted fresh plants. Plants should not have been obtained directly by in vitro culture.

18 Con objeto de paliar los problemas descritos, ya desde hace años se ha seguido un proceso alternativo de cultivo in vitro denominado por Arias (1988) y otros autores macro-propagación : Basado en la utilización de la técnica para producir una única planta a partir de un ápice caulinar, siguiendo la posterior multiplicación mediante los métodos convencionales in vivo. Este procedimiento ofrece la ventaja del saneamiento pero abandona las tradicionales ventajas de multiplicación acelerada del material. En definitiva, la fase in vitro quedaba reducida a lo que hemos llamado fases de inicio y de enraizamiento.

19 El hecho de ser la fresa la primera especie de interés agronómico en la que se aplicaron procedimientos industriales de producción in vitro, dió lugar a recapacitar acerca de las causas de los fracasos agronómicos obtenidos y a estudiar posibles soluciones para recuperar esta eficiente técnica de multiplicación; pudiendo por otra parte servir de modelo a problemas similares que se vislumbraban en los años 80 y 90 en otras especies de interés agrícola, como frambuesa, zarzamora, alcachofa, espárrago, ajo, platanera (banano), etc.

20 Paralelamente a la descripción de los problemas fenotípicos y agronómicos surgidos, se fueron lanzando hipótesis y estudiando las posibles causas de las alteraciones observadas. Pronto se ligaron estos problemas de inestabilidad fenotípica a las técnicas de cultivo in vitro que se habían generalizado en la última mitad de los años 70. 1º) Se relacionó la incorporación de citoquininas (particularmente, benziladenina: BA ó BAP) al medio de multiplicación con los problemas fenotípicos citados, Ya que efectos similares se habían observado por numerosos autores tras aplicaciones exógenas a plantas in vivo. Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la incorporación sistemática de una concentración estandarizada de 1 mg/litro de BA al medio de multiplicación.

21 2º) Aunque el fenotipo de la fresa es bastante estable en el campo, esto no ocurre cuando los tallos producidos in vitro son de origen adventicio; Así, estudios de Marcotrigiano et al. (1984, 1987) indicaron que al añadir concentraciones de BA superiores a 0,33 mg/l al medio de cultivo, se producía una alta proporción de formación adventicia. Así, ya desde principios de los años 80 comenzó a recomendarse el uso de la menor concentración de citoquininas posible en los medios de cultivo in vitro de fresa, siempre que se obtuviera una adecuada tasa de multiplicación.

22 3º) Además de la adición de citoquininas, otros autores, como Navatel (1983) y Rancillac et al. (1987), habían llamado la atención sobre la responsabilidad del número de subcultivos in vitro en la presencia de frutos de menor tamaño y en la aparición de plantas anormales; En esta línea, se ha sugerido reducir el número de subcultivos en cada proceso de micropropagación a no más de Zimmerman (1991) observó que también puede influir la amplitud (duración) de cada subcultivo, pues la realización de subcultivos muy frecuentes (o sea, de muy poca duración) favorece la formación de tallos adventicios. Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la realización ilimitada (ad infinitum) de subcultivos in vitro.

23 4º) También se ha señalado la utilización generalizada de medios de cultivo para cualquier variedad; (en definitiva, la elección de formulaciones minerales inadecuadas para el genotipo a micropropagar). Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la formulación mineral de Knop (pobre), mientras que otros autores sugerían la formulación mineral de MS (Murashige y Skoog, 1962) (rica); Que sospechamos son las empleadas mayoritariamente en los trabajos de investigación y de uso comercial. Ambas formulaciones minerales son las extremas en concentración iónica (concentración de nutrientes) de entre las más conocidas para cultivo in vitro.

24 Podemos destacar resumiendo: lo adecuado de la utilización de técnicas que hagan mínima la presencia de callo en la base de las colonias de tallos durante el proceso in vitro, para evitar la proliferación de material adventicio causante de inestabilidad fenotípica, frente a material axilar Una vez conocidas, con relativa seguridad, las causas de los problemas de inestabilidad fenotípica anteriormente descritos, se ha pasado a una lenta pero significativa reapreciación de la técnica de micropropagación de fresa (Boxus, 1992), a través de importantes modificaciones en los planteamientos originales:

25 *Uso generalizado de la técnica únicamente en la obtención de material (F 0 ) inicial en el proceso de certificación y control de planta de vivero (es decir, un meristemo-una planta). *O en su caso una moderada micropropagación industrial a base de:.-mantenimiento de los reguladores de crecimiento, y en particular la citoquinina BA, a las menores concentraciones posibles en la fase de multiplicación, que permitan una tasa de multiplicación aceptable (4-6 tallos axilares viables/mes de subcultivo)..-restricción del número de subcultivos (menos de 10 a partir de cada ápice caulinar). Incluso en algunos casos (máximo de 3-4 subcultivos)..-uso exclusivo de las plantas micropropagadas como plantas madre, y nunca directamente como material de producción de fruto..-inicio del proceso de micropropogación con una cierta cantidad de explantos, y no desde un único meristemo..-adaptación de medios de cultivo in vitro al comportamiento de cada variedad específica.

26 El abandono de la técnica de multiplicación in vitro (micropropagación) o el uso únicamente de la macropropagación (es decir obtención únicamente de material F 0 inicial) supondría perder una valiosa herramienta de producción masiva de material sano y de calidad, así como de independencia tecnológica y comercial.

27 Estos y otros datos parecían justificar sobradamente que, a partir de 1986, nuestro equipo de trabajo iniciara y culminara diversos proyectos de investigación para el estudio de los procesos de micropropagación de fresa, a la luz de las hipótesis anteriormente señaladas, y su influencia en el comportamiento agronómico y morfológico posterior en las variedades de origen californiano Douglas y Chandler que en aquellos años eran de cultivo mayoritario en España.

28 Estudiamos en concreto los siguientes aspectos de la micropropagación de ambas variedades de fresa: 1.- Efecto en el establecimiento de los cultivos in vitro, del tamaño y fecha de recolección de los explantos. 2.- Selección de una formulación mineral adecuada para el medio de cultivo. 3.- Selección de las concentraciones adecuadas de la citoquinina BA en la fase de multiplicación. 4.- Efecto del número y duración de los subcultivos en la fase de multiplicación. 5.- Estudio de técnicas que permiten disminuir la cantidad de callo en la base de los cultivos.

29 6.- Estudio del proceso de enraizamiento in vitro y aclimatación de ambos cultivares. 7.- Enraizamiento in vivo del material micropropagado. 8.- Estudios en vivero a nivel del mar del material micropropagado en las diferentes formulaciones minerales, niveles de BA y número de subcultivos. 9.- Estabilidad fenotípica y aptitud como plantas madre comparando con material importado multiplicado mediante técnicas in vivo Estudio del material primera generación in vivo y sucesivas generaciones como plantas productoras de fruto (productividad, tamaño de fruto, calidad y estabilidad fenotípica).

30 Después de varios años de trabajo, pudimos reunir una serie de conclusiones en el siguiente esquema, aplicadas a la multiplicación in vitro de fresa, tomando como modelo la variedad Chandler: 1º.-Realización de selección masal de individuos que muestren las características morfológicas y agronómicas adecuadas del cultivar, en campos de fructificación de nuestra zona. 2º.-Tratamiento de termoterapia e indexaje en clones silvestres de Fragaria vesca para garantizar su sanidad frente a virus. Conservación del material en recintos insect-proof. 3º.-Iniciar los cultivos in vitro a partir de explantos extraídos de jóvenes estolones emitidos por dichas plantas madre en los meses de Mayo y Junio, utilizando ápices caulinares de 1-2 mm de tamaño.

31 4º.-La utilización formulaciones minerales de riqueza nutriente intermedia; concretamente la formulación N 30 K (Margara, 1984) nos permitió obtener material de buena calidad con una aceptable tasa de multiplicación. Cuando utilizábamos formulaciones minerales de alta concentración iónica, formulación de Murashige y Skoog (1962), se obtenían tallos vitrificados de aspecto suculento, mientras que las de baja concentración iónica, formulación de Knop, daba lugar a tallos de excelente aspecto pero la tasa de multiplicación obtenida era muy pequeña. 5º.-Utilizar, sin variación, la formulación mineral N 30 K en las tres fases de la micro-propagación.

32 6º.-La variedad Chandler resultaba tener pequeños requerimientos de citoquinina BA durante la fase de multiplicación, de modo que encontrábamos tasas de multiplicación óptimas en el nivel 0,33 mg/l de BA añadido al medio de cultivo (en el caso de la variedad Douglas dicho nivel de BA con tasas óptimas de multiplicación era ligeramente más elevado, entre 0,33 y 0,66 mg/l de BA). Niveles de 1,00 mg/l de BA, o superiores, disminuían la tasa de multiplicación y la calidad del material in vitro obtenido en cada subcultivo. Ello nos permitió en nuestros trabajos, desde hace años, hacer coincidir nuestros óptimos (0,33 mg/l de BA), con las recomendaciones de diversos autores (por ejemplo los citados Marcotrigiano et al. (1984, 1987) ), de reducir las concentraciones de citoquinina BA que antes comentábamos. Incluso concentraciones de 0,165 mg/l (6 veces menores de las habitualmente utilizadas), próximas al 0,1 mg/l de BA nos ha permitido inducir una aceptable tasa de multiplicación en la variedad Chandler.

33 7º.-La frecuencia de subcultivo óptima ha resultado ser de 7 semanas; con una tasa de multiplicación media de 4 tallos viables por mes de subcultivo, en el sistema normal de colonias de tallos. 8º.-El número de subcultivos (ciclos de multiplicación in vitro) máximo que recomendamos es de 6 a 8; sin embargo, a efectos prácticos, nuestros resultados avalan un ciclo anual de micropropagación, permitiendo un máximo de 5-6 subcultivos del material procedente de un mismo ápice caulinar (yema axilar). Ello es así porque el ciclo anual comienza en Mayo-Junio, cuando comienza el estolonado de las plantas madre (en estas latitudes del hemisferio Norte), con el establecimiento de los cultivos in vitro (fase inicial, 6 semanas) y finaliza en Abril-Mayo con el material aclimatado y endurecido ex vitro (al menos 8 semanas), dispuesto a ser transferido a multiplicación en vivero. Comenzando de nuevo otro ciclo anual con la extracción de nuevos explantos: Mayo-Junio (fase inicial), multiplicación in vitro, Abril-Mayo final de aclimatación ex vitro.

34 9º.-En la fase de enraizamiento in vitro (6 semanas), la adición de 500 mg/l de carbón activo al medio de cultivo, impide o disminuye de manera significativa la aparición de callo en la base de las colonias de tallos axilare y acelera la emisión de raíces. Sin embargo, es de tal sencillez y seguridad el enraizamiento in vivo del material de la variedad Chandler, que nos ha servido de modelo general para la totalidad de las entradas del género Fragaria, que el ahorro económico, en tiempo (6 semanas), y la disminución de riesgos de contaminación, hacen recomendable abandonar el enraizamiento in vitro, pasando directamente desde la fase de multiplicación a la de enraizamiento-aclimatación in vivo. No obstante en aquellos casos que se haga necesaria la obtención de plántulas in vitro perfectas y muy enraizadas, por ejemplo para la obtención única y exclusivamente de material F 0, podría ser adecuado realizar una fase de enraizamiento in vitro de plántulas individuales directamente procedentes de la fase inicial o cultivo de meristemos.

35 10º.-La fase de enrazimiento-aclimatación in vivo (ex vitro) no es crítica si se dispone de instalaciones adecuadas (túneles de nebulización y bancadas de aclimatación) en invernadero climatizado. Recuérdese que este proceso coincide en nuestro esquema y en cualquier otro que emplee nuestro sistema de viverismo, con los meses de invierno Febrero-Marzo (en el hemisferio Norte). 11º.-Desde hace años hemos confirmado una alta estabilidad fenotípica en vivero del material micropropagado de la variedad Chandler (como modelo para variedades modernas de día corto) y una capacidad de estolonado comercial superior a la del material del mismo cultivar obtenido por técnicas convencionales in vivo.

36 12º.-La capacidad de producción de fruto no se ha visto afectada por el sistema de multiplicación utilizado. Con una total ausencia de diferencias en campos de fructificación, en calibre de fruto, reparto en categorías comerciales, precocidad, etc., entre plantas primera generación ex vitro y obtenidas por técnicas convencionales, no habiéndose detectado ninguna anomalía ligada a los procesos de micropropagación.

37 No obstante, en general, la micropropagación de la fresa in vitro sigue siendo una práctica de producción de plantas temida y desprestigiada en el sector comercial; Puede ser debido a diversas causas reales o imaginarias. *desconfianza en procesos de laboratorio no conocidos. *tendencia a achacar fallos a terceros, cuando la responsabilidad es propia. *posibles protocolos de trabajo in vitro no bien testados ni conocidos por los propios laboratorios de cultivo in vitro (no puede trabajarse con meras recetas).

38 Es habitual ante la presencia de fenómenos adversos en la multiplicación en vivero de plantas micropropagadas, como variaciones del fenotipo, síndromes ligados a filodios (que pueden ambos tener causas puramente naturales del proceso in vivo), responsabilizar ese erróneo comportamiento a las técnicas in vitro utilizadas. Por ello, es imprescindible realizar un trabajo previo de testaje de los procedimientos utilizados antes de lanzarse a una producción a escala comercial mediante estas técnicas in vitro.

39 En definitiva, entre 1986 y 1992 habíamos puesto a punto un método de micropropagación para las variedades de origen californiano Douglas y Chandler que produjo material vegetal cuya primera generación ex vitro no mostró diferencias morfológicas o agronómicas respecto al material estándar propagado usado como testigo. Recordemos que este método incluía la utilización de una solución mineral cuyos niveles de macroelementos eran inferiores a las de la formulación MS, unas concentraciones de citoquinina en el rango 1,48-2,96 µm (0,33-0,66 mg/l), inferiores a las propuestas por Boxus (1974), y la limitación del número de subcultivos hasta un máximo de 8. Sin embargo, esos trabajos de investigación se realizaron en condiciones ligeramente distintas a las estandarizadas en el sector fresero español; por ejemplo, multiplicación de plantas madre a nivel del mar, en parcelas situadas en Churriana (Málaga). Por otra parte, los ensayos de fructificación se realizaron en Chipiona (Cádiz) (López-Aranda et al., 1994b). O sea, los resultados se obtuvieron en una situación algo diferente al mundo del viverismo y producción de la fresa en España.

40 1990 Condiciones establecidas para micropropagación de la variedad Chandler. Tamaño explantos Fecha inicio Fase inicio Formulación mineral Período de subcultivo 0,5-1,0 mm Mayo-Junio 6 semanas N 30 K (todas las fases) 7 semanas Número máximo de subcultivos 4-5 Concentración BA Nivel irradiancia Enraizamiento in vitro Inicio aclimatación ex vitro Envío a vivero 1,48µM (0,33 mg/l) 40 µm.m.s No Febrero Abril

41 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

42 Estadillo para la fabricación del medio de cultivo N 30 K (Margara), fase de inicio en fresa (1ª hoja)

43 Estadillo para la fabricación del medio de cultivo N 30 K (Margara), fase de inicio en fresa (2ª hoja)

44 Estadillo para la fabricación del medio de cultivo N 30 K (Margara), fase de multiplicación en fresa (1ª hoja)

45 Estadillo para la fabricación del medio de cultivo N 30 K (Margara), fase de multiplicación en fresa (2ª hoja)

46

47

48 PREPARACION Y SIEMBRA DE EXPLANTOS (CUPULAS MERISTEMÁTICAS) PARA LA FASE DE INICIO

49

50

51 Meristemo de la yema apical del estolón Meristemo de las yemas axilares de las hojas en los filamentos estoloníferos Meristemos de la yemas axilares de las hojas principales del estolón

52

53 INICIO DE CULTIVOS (FASE I MERISTEMOS)

54

55

56 FASE II MULTIPLICACION

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71 FASE III ENRAIZAMIENTO IN VITRO (CREEMOS QUE NO ES NECESARIA EN FRESA)

72

73 CAMARAS DE CULTIVO (FITOTRONES) Y DE CONSERVACION IN VITRO

74

75

76

77

78

79

80 ENRAIZAMIENTO Y ACLIMATACION EX-VITRO

81

82

83

84

85 ALGUNOS RESULTADOS PARA LA PUESTA A PUNTO DE NUESTRA METODOLOGIA DE MICROPROPAGACION EN LAS VARIEDADES CHANDLER Y DOUGLAS.

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96 En 1991, repetimos el proceso para asegurarnos de la estabilidad fenotípica del material producido con nuestro método, mediante el estudio en invernadero de 33 caracteres, combinación de los propuestos por UPOV e IBPGR, cuyos resultados positivos fueron presentados en el 2º Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas celebrado en Zaragoza (España) (López-Aranda et al., 1993). El material vegetal ensayado estuvo integrado por plantas de la variedad Chandler de tres orígenes: 1º.-Material estandar propagado: Procedente de vivero de altura situado en la provincia de Segovia: Chandler-Segovia. 2º.-Material micropropagado: Procedente de vivero de altura situado en la provincia de Soria, segunda generación: Chandler-Soria. 3º.-Material micropropagado: Planta base procedente de vivero sin horas frío situado en Yunquera (Málaga), primera generación ex vitro: Chandler- Yunquera.

97 Dicho material se plantó el 30 de Octubre de 1990 en dos localidades de Huelva: bajo invernadero de P.E. (0,1 mm de espesor) en Finca Experimental El Cebollar-Moguer y bajo tunelillos de P.E. (0,075 mm de espesor) en Granja-Escuela de Diputación Provincial de Huelva en Trigueros. Se dispuso un diseño de bloques al azar con tres repeticiones; cada parcela elemental contenía 115 y 136 plantas respectivamente. Las técnicas de cultivo fueron las utilizadas habitualmente en la zona, en aquellos años; el proceso de recolección y toma de datos finalizó en la última semana de Mayo de La evaluación morfológica y organoléptica se realizó de modo subjetivo, siguiendo una combinación de los criterios de IBPGR (Clamot et al., 1986) y las normas UPOV. Los caracteres generales de la planta, de la hoja, de la flor, y morfológicos del fruto fueron realizados mediante una observación mensual iniciada a mediados de Enero y finalizada a mediados de Mayo.

98 Los resultados se detallan en la versión word de esta comunicación. No se observaron diferencias directamente atribuibles a la procedencia in vitro o ex-vitro del material ensayado.

99 Para reproducir nuestros anteriores resultados en condiciones similares a la multiplicación y producción comerciales (fase de transferencia de tecnología al sector), repetíamos entre 1991 y 1994 nuestros ensayos con la variedad Chandler. El objetivo principal de estos trabajos era el estudio agronómico del material obtenido a partir de plantas micropropagadas, sin tener en cuenta otros condicionantes. Se presenta a continuación un extracto de los resultados presentados a las XXVI Jornadas de estudio (AIDA) (López-Aranda et al., 1994a) y en el Curso El Cultivo de la frutilla celebrado en la Universidad de Chile durante Enero de 1996 (López-Aranda, 1996).

100 Material y método: Primer año. Micropropagación Plantas purple-tag de fresa, de la variedad Chandler, utilizadas habitualmente como material madre para los viveros de altura, fueron tomadas al azar en Abril En Junio-Julio de 1991 se iniciaron cultivos de meristemos a partir de de jóvenes estolones aéreos. Empleamos nuestro método de micropropagación. El material fue subcultivado 4 veces. El material fue aclimatado, a partir de mediados de Febrero de 1992, en invernadero climatizado del CIFA-Málaga, directamente desde la fase de multiplicación.

101 Primer año. Multiplicación en vivero. En la primera semana de Mayo de 1992, el material perfectamente aclimatado se plantó en dos viveros: a) Vivero de la Cooperativa CORA, Finca "El Barcial", situado en Quintana del Puente (Palencia) (vivero de altura); b) Vivero ubicado en el CIFA-Chipiona (Cádiz), situado a nivel del mar (vivero de bajura). Primer año. Campos de Fructificación. A finales de Octubre de 1992 fueron recolectadas las plantas hijas del material micropropagado en ambos viveros, y parte de ellas fueron transportadas a dos campos de fructificación en Huelva: -Finca El Cebollar-Moguer (agroambiente favorable), -Finca San Juan del Puerto (agroambiente desfavorable).

102 Se realizaron tres tratamientos: MA.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del vivero de altura de la Cooperativa CORA. MB.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del vivero de bajura del CIFA-Chipiona. SA.- Material estándar propagado en el vivero de altura de la Cooperativa CORA, a partir de plantas madre "purple-tag" procedentes de Lassen Canyon (California). Testigo no multiplicado in vitro e idéntico al material empleado por los socios de dicha Cooperativa para la campaña El diseño experimental era de bloques al azar con 3 repeticiones, con una dotación de 750 plantas por parcela elemental. La plantación se efectuó entre el 28 y el 29 de Octubre de 1992.

103 Segundo año. Micropropagación. A mediados de 1992, se eligieron al azar plantas "purple-tag" de la variedad Chandler, de la Cooperativa CORA, y se repitió el proceso del primer año. Segundo año. Multiplicación en vivero. En la 2ª semana de Mayo de 1993, el material ex vitro, perfectamente aclimatado, era plantado en Tordesillas (Valladolid). La otra parte de material vegetal producido en los viveros del año anterior y no enviado a los campos de fructificación era utilizada así: Las plantas 1ª generación ex vitro recolectadas a finales de Octubre de 1992 en el vivero de altura fueron almacenadas en cámara frigorífica a ºC hasta finales de Abril de 1993 y posteriormente utilizadas como plantas madre en el mismo vivero de Quintana del Puente (Palencia). Las plantas 1ª generación ex vitro del vivero de bajura se mantuvieron sin parada vegetativa en la misma parcela hasta finales de Abril de 1993, siendo a continuación replantadas en el mismo vivero a nivel del mar en Chipiona (Cádiz).

104 Segundo año. Campo de Fructificación. A finales de Octubre de 1993 fueron recolectadas las plantas hijas del material micropropagado en los 3 viveros y parte de él fue transportado al campo de fructificación en Huelva (Finca Experimental El Cebollar). Se realizaron 5 tratamientos: MCO.- Material micropropagado (2ª generación ex vitro) procedente del vivero de altura de la Cooperativa CORA. MCHI.-Material micropropagado (2ª generación ex vitro) procedente del vivero de bajura del CIFA-Chipiona (Cádiz). MVC.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del vivero de altura de Viveros California S.L. CORA.- Material estándar propagado en el vivero de altura de la Cooperativa CORA, a partir de plantas madre "purple tag" procedentes de Lassen Canyon (California). Utilizado como control e idéntico al material empleado por los socios de dicha Cooperativa para la campaña

105 CALI.-Material estándar propagado en el vivero de altura de Viveros California. Este material era planta certificada procedente del programa de colaboración INSPV-IVIA-Viveristas, y que incluía: 1) Selección masal, 2) Macropropagación y saneamiento de plantas seleccionadas (F 0 ), 3) Multiplicación en malla anti insectos (F 1 ) planta pre-base, 4) Primera multiplicación en vivero de altura (F 2 ) planta base, 5) Segunda multiplicación en vivero de altura, planta certificada y entrega a clientes. El diseño experimental fue de bloques al azar con 3 repeticiones, con una dotación de 630 plantas por parcela elemental. La plantación se realizaba entre el 28 y el 29 de Octubre de 1993.

106 Resultados y conclusiones. Viveros. En todas las plantaciones realizadas en vivero, tanto en el primero como en el segundo año, en altura, o a nivel del mar, no se han detectado plantas hijas procedentes de material micropropagado (1ª y 2ª generación ex-vitro), aberrantes, fuera de tipo, cloróticas y/o variegadas. El crecimiento vegetativo fue normal, y no diferente del observado en el material estándar propagado, utilizado como control.

107 Campos de fructificación. Primer año. Finca Experimental El Cebollar (Moguer). Ensayo El Cebollar. Resultados acumulados finales (Hasta 10 de Mayo). Producción (g/planta) Calibre (g/fruto) Tratam. 1ª cat. Comercial 1ª cat. 2ª cat. SA 414,3 a(*) 517,2 a 24,7 a 11,8 a MA 374,3 a 470,5 a 23,6 a 11,8 a MB 377,6 a 457,3 a 25,3 a 11,9 a (*)P < 0.05 No se observaron plantas fuera de tipo a lo largo del desarrollo del cultivo. El porcentaje de supervivencia osciló entre el 97,64% del material MA y el 98,95% del SA, sin diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos. Se realizaron 20 cosechas durante el período comprendido entre 22 de Enero y 10 de Mayo de 1993.

108 Campos de fructificación. Primer año. Finca Granja-Escuela (San Juan del Puerto) Ensayo Granja-Escuela. Resultados acumulados. Producción comercial (g/planta)hasta fin de: Tratam. Marzo Abril Ensayo (13-Mayo) SA 19,9 a(*) 117,3 a 197,8 a MA 19,5 a 130,2 a 217,5 a MB 17,9 b 70,8 b 142,6 b (*)P < 0.05 No se observaron plantas fuera de tipo a lo largo del desarrollo cultivo. del El tamaño medio del fruto no mostró diferencias significativas al final del ensayo, con 31,6 gramos/fruto para el material SA, 31,8 gramos/fruto para MA y 31,7 gramos/fruto para MB en frutos de 1ª categoría.

109 Campos de fructificación. Segundo año. Finca Experimental El Cebollar (Moguer). Ensayo Resultados acumulados hasta final de Marzo y mediados de Mayo. Producción precoz Producción final Tratam. 1ª cat. Comercial 1ª cat. Comercial CORA 148 a(*) 170 a 413 ab(*) 503 a MCO 138 ab 164 a 492 a 487 a MVC 137 ab 171 a 363 b 471 a CALI 117 bc 155 a 320 c 422 b MCHI 101 c 149 a 291 c 391 b (*)P < 0.05 No se observaron plantas fuera de tipo. El porcentaje de supervivencia osciló entre el 98,30% del material MCHI y el 99,70% del MCO, sin diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos.

110 Ensayo Calibre medio de los frutos de 1ª cat. (en gramos/unidad). 3-Marzo 21-Marzo 18-Abril 13-Mayo CORA 19 a 26 a 26 a 21 a MCO 22 a 23 a 23 a 20 a MVC 21 a 23 a 22 a 23 a CALI 21 a 22 a 24 a 20 a MCHI 19 a 21 a 25 a 23 a

111 RESUMEN DE CONCLUSIONES. Los resultados obtenidos parecieron confirmar nuestras observaciones preliminares; a saber, la inexistencia de diferencias morfológicas y agronómicas entre material de Chandler micropropagado y multiplicado mediante tecnología estándar, en diferentes condiciones de vivero. Las diferencias aparecen precisamente entre las procedencias de vivero con independencia del sistema de multiplicación utilizado. En el ensayo de 1994, los mejores resultados eran los obtenidos por los materiales vegetales CORA y MCO procedentes del vivero que mayor número de horas frío había acumulado (Palencia), seguidos de MVC y CALI producidos en Tordesillas (Valladolid); Los peores resultados se obtuvieron con el material MCHI, multiplicado en vivero a nivel del mar (sin horas-frío). Lo mismo ocurría en el ensayo de Granja-Escuela (1993) con el material MB.

112 Las diferencias habían desaparecido en la primera generación ex vitro (planta pre-base = F 1 ) Y los resultados parecieron indicar que lo mismo ocurría con el material de segunda generación ex vitro (planta base = F 2 ) Material que a nivel comercial no se utiliza en campos de fructificación. Por lo tanto, nuestros resultados apuntaron a que el material tercera generación ex vitro (planta certificada, estándar o la categoría denominada en la Unión Europea CAC, equivalente a la planta comercial española no certificada = F 3 o F 4 ), no se diferenciaría ni agronómica ni morfológicamente del material estándar propagado del mismo origen. El método de micropropagación puesto a punto por nuestro equipo parece un sistema razonable, seguro y eficiente de producción industrial de plantas de fresa; al menos para la variedad entonces dominante en el mercado español Chandler. Dicho método, es, desde hace más de 10 años, un instrumento rutinario en la producción de plantas madre de todas nuestras actividades.

113

114

115 EJEMPLOS DE RECINTOS INSECT-PROOF PARA LA MULTIPLICACION EX-VITRO DE MATERIAL F 0

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126