Hemoglobinuria paroxística nocturna

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1 REVSÓN Hemoglobinuria paroxística nocturna Pilar M. Hernández-Campo, Julia Almeida y Alberto Orfao Servicio General de Citometría. Centro de nvestigación del Cáncer (BMCC-USAL/CSC). Hospital Universitario de Salamanca. Departamento de Medicina. Universidad de Salamanca. Salamanca. España. La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal adquirida que afecta a la célula hematopoyética pluripotencial. Se origina por una mutación somática en el gen PG-A (glucosilfosfatidilinositol de clase A), que codifica para una proteína involucrada en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GP). Esta molécula actúa como anclaje a la membrana citoplásmica de numerosas proteínas, cuya expresión será total o parcialmente deficiente en pacientes con HPN. En la actualidad se reconoce que la constatación de esta deficiencia por citometría de flujo constituye el método de elección para el diagnóstico de la enfermedad. Entre las moléculas deficitarias en la HPN se encuentran las proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59, cuya deficiencia es responsable de la hemólisis intravascular característica de la enfermedad. Además, los pacientes presentan predisposición a desarrollar fenómenos trombóticos e infecciones, y un grado variable de insuficiencia medular. En este trabajo se revisan los avances más recientes en el conocimiento de la patogenia de la enfermedad y los métodos de diagnóstico y seguimiento de los pacientes con HPN. Palabras clave: Hemoglobinuria paroxística nocturna. PG-A. Glucosilfosfatidilinositol. Citometría de flujo. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is an acquired clonal hematopoietic disorder characterized by the existence of somatic mutations in the PG-A (phosphatidylinositolglycan complementation class A) gene, which encodes for a protein involved in the biosynthesis of the glycosyl phosphatidylinositol (GP) molecule that serves as an anchor for many cell surface proteins. This genetic alteration translates into a total or partial deficiency in the PNH clone of surface proteins attached to the cell by a GP anchor. Evaluation of deficient expression of GP-associated proteins is currently used for the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Among other proteins, deficiency of CD55 and CD59 leads to an increased susceptibility of PNH cells to complement-mediated cell lysis. Variable degrees of cytopenia, an increased susceptibility to infections and recurrent thrombotic events are other symptoms of the disease. n this paper we review the recent advances in the knowledge about the pathogenic mechanisms of the disease and the current approaches for the diagnosis and monitoring of PNH patients. Key words: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. PG-A gene. Glycosylphosphatidiylinositol. Flow cytometry. Correspondencia: Prof. A. Orfao. Servicio General de Citometría. Hospital Universitario de Salamanca. P.º San Vicente, Salamanca. España. Correo electrónico: orfao@usal.es Recibido el ; aceptado para su publicación el La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal adquirida. Se origina por una mutación somática en el gen PG-A (glucosilfosfatidilinositol de clase A), que se localiza en el brazo corto del cromosoma X y que codifica para una proteína involucrada en la síntesis del glucosilfosfatidilinositol (GP) 1,2, molécula esencial para el anclaje de una gran variedad de proteínas de la membrana citoplásmica. La mutación se produce en una célula madre hematopoyética pluripotencial y da lugar a una deficiencia total o parcial de la proteína pig-a, con la consiguiente alteración en la síntesis del GP y del anclaje de las proteínas asociadas al GP a la membrana citoplásmica; como resultado, una parte de las células sanguíneas derivadas de la diferenciación y maduración de la progenitora hematopoyética afectada serán deficientes en las proteínas que se unen a la membrana citoplásmica a través de GP 3,4. Antecedentes históricos La primera referencia inequívoca a la HPN la realizó William Gull en , pero no fue hasta 1882 cuando Paul Strübing 6 identificó la enfermedad como una entidad diferente de la hemoglobinuria paroxística desencadenada por el frío y la asociada a la marcha. Este autor demostró que el pigmento que oscurece la orina de estos pacientes es la hemoglobina procedente de la destrucción de los hematíes, hecho que atribuyó al paso de éstos por el riñón. Casi medio siglo más tarde, en 1928, Ennekin acuñó de forma definitiva el nombre de HPN. En 1911 Hijmans van den Bergh 7 demostró que la acidificación con dióxido de carbono de sueros de pacientes con HPN inducía la lisis de los eritrocitos, hecho que no ocurría con sueros de personas sanas. Posteriormente Ham relacionó este hallazgo con un aumento de la susceptibilidad de estas células a la lisis mediada por las proteínas del sistema del complemento 8, además de crear una prueba hemolítica sencilla para el diagnóstico de la HPN, que se ha empleado desde entonces para el diagnóstico de la enfermedad. Tras un análisis detallado de la lisis eritrocitaria cuando empleaban el test de Ham en pacientes con HPN, Rosse y Dacie 9,10 constataron que había una importante heterogeneidad en lo que hacía referencia a la sensibilidad de los hematíes de estos pacientes a la lisis mediada por el complemento. De esta forma identificaron 3 poblaciones de hematíes de acuerdo con su sensibilidad al complemento: hematíes de tipo, y, con una sensibilidad normal, moderada y alta, respectivamente 9. Con anterioridad DeSandre 11 había referido que los eritrocitos de pacientes con HPN no expresaban acetilcolinesterasa. Unos años más tarde, se identificaron otras moléculas cuya expresión era deficiente en la membrana de los eritrocitos de estos pacientes; entre ellas figuraban la fosfatasa alcalina 12, el factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF, de decay accelerating factor, o CD55) 13 y el inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MRL o CD59) 14. Todas estas proteínas tienen en común el estar ancladas a la membrana celular a través de GP, y en 1992 se demostró que en la HPN había un defecto en la síntesis de esta molécula 15,16. La demostración del defecto fenotípico llevó a la identificación de la alteración genética subyacente a la HPN en 1993 por Miyata et al 17, quienes clonaron el gen PG-A y demostraron su participación en la Med Clin (Barc). 2008;131(16):

2 síntesis del primer compuesto intermedio en la ruta de síntesis de GP. Asimismo, estos autores identificaron una mutación somática que ocasionaba la pérdida de la función del gen PG-A 18 y determinaron que la HPN afectaba de igual modo a varones y mujeres 18. Actualmente se sabe que la mutación en el gen PG-A es condición necesaria pero no suficiente para el desarrollo de la HPN, puesto que se han descrito mutaciones de este gen en personas sanas 19, lo que induce a pensar que para la expansión del clon mutado podrían ser necesarios otros factores 20. Glucosilfosfatidilinositol (GP) Estructura La molécula de GP tiene una estructura altamente conservada a lo largo de la evolución, siendo muy similar en los organismos unicelulares más sencillos y en los mamíferos Consta de una molécula de fosfatidilinositol, un núcleo glucano formado por una molécula de N-glucosamina y 3 manosas, y una molécula de fosfoetanolamina 1,24 (fig. 1). La unión a la membrana se realiza a través de la molécula de fosfatidilinositol, que se inserta en la bicapa lipídica mediante los ácidos grasos situados en los carbonos 1 y 2 del glicerol. El primero de ellos se une a través de un enlace éter 25, mientras que el segundo suele ser un ácido graso altamente insaturado, como el ácido araquidónico, que se une como radical acilo. En los mamíferos hay un tercer ácido graso, generalmente ácido palmítico, que se une al inositol 26. Esta estructura proporciona a la molécula de GP resistencia frente a la fosfolipasa C producida por bacterias como Bacillus thuringiensis 27 y Staphylococcus aureus 28. El núcleo glucano de GP está formado por una molécula de N-glucosamina que se une mediante un enlace (1-6) al inositol. Éste, a su vez, está unido a 3 manosas a través de diferentes enlaces alfaglucosídicos 1. La manosa terminal está unida, a través de su sexto carbono, a una molécula de fosfoetanolamina, cuya amina reacciona con el grupo carboxilo terminal de la proteína que va a ser anclada a la membrana 29,30. Aunque la estructura del núcleo glucano de la molécula de GP es similar en organismos unicelulares sencillos y en mamíferos, puede haber diferencias en las moléculas que se unen como «cadenas laterales». Así, el grupo hidroxilo del C-2 de la manosa que se une a glucosamina puede estar unido a una molécula de fosfoetanolamina que no forma enlace con ninguna cadena polipeptídica. Además, el grupo hidroxilo del C-4 de esa misma manosa aparece unido a N-acetilgalactosamina o a oligosacáridos 2. Finalmente, en el C-2 de la manosa terminal puede haber una o más manosas unidas al grupo hidroxilo 31. Proteína O C NH 2 (CH 2 ) 2 O Fosfoetanolamina O = P O R O 2 Man Man Man GLcN R 1 R 5 R 3 R 4 Ácidos grasos OH CH O OH R 6 O O = P O O CH 2 CH 2 CH 2 Biosíntesis La síntesis de GP comienza en la cara externa del retículo endoplásmico 32 y se completa en la cara interna del aparato de Golgi. El primer paso de la síntesis (fig. 2) consiste en la unión de N-acetilglucosamina (GlcNAc) a fosfatidilinositol por acción de la enzima glucosiltransferasa, que utiliza uridina difosfato-glcnac como sustrato 33 ; el producto resultante de esta unión se desacetila para obtener glucosamina-fosfatidilinositol (GlcN-P) 34. A continuación la dolicol-fosfato-manosa y la fosfatidil-etanolamina actúan como donadores de manosa y fosfoetanolamina, respectivamente 35,36. Luego se forma un complejo que se compone de proteínas que se combinan con el precursor de GP sintetizado y que es transportado al aparato de Golgi, donde las proteínas sufren una modificación de su unión a la molécula de GP para insertarse finalmente en la membrana plasmática como proteínas ancladas a GP maduras. Con el fin de identificar los genes implicados en las rutas de síntesis de GP se han empleado como modelo las eucario- Fosfatidilinositol Posibles cadenas del núcleo glicano R 1 : manosa R 2 : fosfoetanolamina R 3 : fosfoetanolamina R 4 : Gal4 R 5 : N-acetilgalactosamina R 6 : ácido graso Membrana celular Fig. 1. Estructura bioquímica de la molécula de glucosilfosfatidilinositol (GP). GlcN: glucosamina; Man: manosa. 618 Med Clin (Barc). 2008;131(16):617-30

3 P UDP-GlcNAc GlcNac-P UDP GlcN-P Aciltransferasa GlcN-(acil)P V Desacilación de inositol Man GlcN-(acil)P PE V no de-ac Man GlcN-(acil)P V Dol P Man Unión a proteína Man Man GlcN-(acil)P Fig. 2. Esquema representativo de la ruta de síntesis de la molécula de glucosilfosfatidilinositol (GP). Dol-P-Man: dolicol-fosfato-manosa; EtN: etanolamina; GlcN: glucosamina; GlcNAc: N-acetilglucosamina; P: fosfatidilinositol; UDP: uridina difosfato. X Complejo transamidasa Man Man Man GlcN-(acil)P P P P EtN EtN EtN PE P EtN V Man Man Man GlcN-(acil)P P V PE EtN Man Man Man GlcN-(acil)P P P EtN EtN tas. Hasta la fecha, el grupo de Kinoshita ha identificado cerca de 20 genes relacionados con las enzimas y proteínas que intervienen en la síntesis de GP en mamíferos La enzima implicada en el primer paso de la ruta de síntesis de GP es la GP-N-acetilglucosaminiltransferasa, que se localiza en el retículo endoplásmico y se compone de al menos 6 subunidades (proteínas) diferentes (fig. 3): pig-a, pig-c, pigh, gpi1, pig-p y dpm2 38,40,41, de las que pig-a es la responsable de la actividad catalítica de la transferasa y cuyo gen ha sido el primer gen clonado de este complejo 17. En una segunda etapa, la reacción de síntesis de GP es catalizada por pig-l, mientras que la unión de las manosas (fig. 3) está mediada por pig-m y pig-b 38. La reacción entre la fosfoetanolamina y el primer y tercer residuos de manosa se produce gracias a pig-n y pig-f, y a pig-o, respectivamente. Por último, se han identificado 4 proteínas diferentes que intervienen en la unión de la molécula de GP a la proteína que va a ser anclada en el paso X: gaai, gp18, pig-s y pig-t 42. Gen PG-A El ADN complementario del gen PG-A consta de pares de bases (pb), con un marco de lectura abierto de pb, y codifica una proteína de 484 aminoácidos 17,43. El gen PG-A abarca 17 kb del cromosoma X (Xp22.1) y consta de 5 intrones y 6 exones. El exón 1 (23 pb) se corresponde con la región 5 no traducida, mientras que el exón 2 (777 pb) contiene casi la mitad de la región codificante. A su vez, los exones 3 (133 pb), 4 (133 pb) y 5 (207 pb) contienen parte de la región codificante; el exón 6 dpm2 pig-a pig-p pig-c gpi1 pig- Dolicol-fofato-manosa Fosfatidiletanolamina -V V pig-m Retículo endoplásmico pig-b V Proteína Fig. 3. Esquema representativo de la ruta de síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GP) y de las enzimas implicadas en ella. dpm2: polipéptido 2 de dolicol-fosfato-manosiltransferasa; gaa1: proteína-1 asociada al anclaje GP; gp18: glucoproteína-18; pig: proteína glucosilfosfatidilinositol. pig-t pig-s gp18 gaa1 X pig-o pig-n pig-f V Med Clin (Barc). 2008;131(16):

4 TABLA 1 Funciones y distribución celular de proteínas asociadas a glucosilfosfatidilinositol Enzimas Acetilcolinesterasa: hematíes CD73: subpoblaciones de linfocitos B y T CD157: monocitos y neutrófilos Fosfatasa alcalina del neutrófilo: neutrófilos ADP-ribosiltransferasa: subpoblaciones de linfocitos T y neutrófilos Moléculas de adherencia celular CD48: linfocitos CD58: todas las células hematopoyéticas CD66b y CD66c: neutrófilos Proteínas de superficie reguladoras de la actividad del complemento CD55: todas las células hematopoyéticas CD59: todas las células hematopoyéticas Receptores CD16: neutrófilos y células dendríticas relacionadas con monocito; en forma transmembranaria se expresa en linfocitos citolíticos CD14: monocitos y macrófagos CD87: monocitos y granulocitos CD90: célula madre y subpoblaciones de linfocitos T Sistemas de antígenos sanguíneos eritrocitarios Cromer: hematíes Cartwright/Yt: hematíes John Milton Hagen: hematíes Dombrock: hematíes Holley-Gregory: hematíes Antígenos del neutrófilo NA1\NA2: neutrófilos NB1\NB2: neutrófilos Otras CD52: linfocitos, monocitos CD24: linfocitos B, neutrófilos CD109: linfocitos T activados, progenitores, células mieloides maduras P50-80: neutrófilos GP500 y GP175: plaquetas ADP: adenosindifosfato. (2.316 pb), además de contener la porción final de la región codificante, incluye la región 3 no traducida. El promotor se encuentra en la región que flanquea el extremo 5 (583 pb) 43. Merece destacarse que en el cromosoma 12 hay además un «seudogén» PG-A inactivo que carece de un intrón 44. C4b CD55 C2a C3b Membrana plasmática CD55 Fig. 4. Esquema representativo del mecanismo de acción de CD55 como proteína reguladora del sistema del complemento. Bb Propiedades generales de las proteínas ancladas a GP Las proteínas ancladas a través de GP a la membrana citoplásmica desarrollan un importante papel en diferentes funciones celulares 45. Prueba de ello es que una síntesis deficiente de la molécula de GP en el ratón resulta letal durante el desarrollo embrionario 46. El hecho de que el núcleo estructural de esta molécula se haya conservado a lo largo de la evolución evidencia también su importancia biológica 23. En este sentido, hoy se reconoce que la función fundamental del anclaje GP consiste en permitir una asociación estable entre las proteínas y la membrana celular. Curiosamente, estas proteínas no tienen una distribución uniforme en la membrana citoplásmica, sino que se sitúan en unos microdominios ricos en esfingolípidos y colesterol denominados «rafts» 47, y el anclaje GP confiere a las proteínas asociadas a él una elevada movilidad lateral sobre la superficie celular. En términos generales hoy se sabe que los rafts donde se localizan las proteínas asociadas a GP están implicados en procesos de señalización celular 48, circulación de proteínas intracelulares 49 y endocitosis independiente de clatrina 50. A pesar de no disponer de dominios intracelulares o de dominios transmembranarios, las proteínas ancladas a GP son capaces de inducir señales intracelulares en las que intervienen segundos mensajeros en el seno del citoplasma 51, los cuales pueden inducir la activación e incluso la proliferación de células hematopoyéticas. Proteínas ancladas a GP en células hematopoyéticas Hasta la fecha se han identificado numerosas proteínas de membrana que se anclan a la superficie de células hematopoyéticas a través de GP (tabla 1). Desde el punto de vista funcional, entre ellas figuran receptores, moléculas de adherencia, enzimas, proteínas transductoras de señal y proteínas reguladoras del sistema del complemento. CD55. También denominada DAF, o factor que acelera la degradación de las covertasas del complemento, es una glucoproteína de 70 kd, compuesta por 4 secuencias repetitivas de 60 aminoácidos, que regula la activación del complemento. Para ello se une a las proteínas C4b o C3b, desplazando a las moléculas C2a y Bb; de esta forma previene la formación de complejos C3-C5-convertasa, esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema del complemento 52,53 (fig. 4). CD55 se expresa en todos los subtipos de leucocitos, eritrocitos y plaquetas. CD59. También llamada MRL (inhibidor de membrana de la lisis reactiva) o protectina, es una proteína de 18 kd que inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-9 de ataque a la membrana 54. Ante la falta de expresión de CD59 en la superficie de la célula, C5b se une a alrededor de 16 moléculas de C9 para constituir el complejo de ataque a la membrana (fig. 5), cuya consecuencia es la formación en ésta de poros que conducen a la entrada de fluidos extracelulares y a la muerte de la célula 55. Al igual que CD55, CD59 se expresa también en todos los subtipos de leucocitos, además de plaquetas y hematíes. CD14. Diversos polisacáridos de la pared celular bacteriana se unen a distintas proteínas séricas para formar complejos que, a su vez, se unirán al receptor CD14, una glucoproteína de 55 kd, que está presente en grandes cantidades en la membrana citoplásmica de los monocitos y macrófagos 56 y, en menor medida, también en la de células dendríticas relacionadas con el monocito 57. La formación de complejos lipopolisacárido (LPS)-proteína-CD14 induce la liberación de citocinas (particularmente factor de necrosis tumoral alfa, interleucina-1 e interleucina-6) 58, que, entre otros efectos, inducen la activación tanto de células endoteliales 59 como de linfocitos T y linfocitos citolíticos. CD16. Dentro del sistema inmunitario, las células con capacidad fagocítica expresan hasta 3 subtipos diferentes de proteínas con capacidad para unirse a la porción Fc de la molécula de inmunoglobulina G: Fc R (CD64), Fc R 620 Med Clin (Barc). 2008;131(16):617-30

5 C9 MAC CD59 CD59 C5b-8 C5b-8 C5b-8 Fig. 5. Esquema representativo del mecanismo de acción de CD59 como proteína reguladora del sistema del complemento. HPN: hemoglobinuria paroxística nocturna; MAC: complejo de ataque a la membrana. Célula normal Célula HPN (CD32) y Fc R (CD16). La expresión de esta última (CD16) en la membrana citoplásmica puede realizarse a través del anclaje GP como ocurre en los neutrófilos, o bien como proteína transmembranaria en el caso de linfocitos citolíticos y macrófagos A pesar del importante papel que tiene CD16 en la respuesta inmunitaria, la deficiencia en su expresión que se observa en los neutrófilos de pacientes con HPN 63 no conlleva una deficiencia funcional, ya que este efecto se ve compensado por la expresión en las mismas moléculas de receptores Fc R, capaces de suplir la función de la proteína deficiente 64. CD24. Es una sialoglucoproteína anclada a GP que contiene 33 aminoácidos 65. nterviene en la activación y diferenciación de los linfocitos B para producir inmunoglobulinas, así como en la producción de peróxido de hidrógeno en neutrófilos 66. No se ha identificado expresión de CD24 en otras líneas celulares hematopoyéticas. CD48. Es una glucoproteína de kd asociada a la activación y adherencia linfocitarias 67, que tiene como ligandos conocidos CD2 y 2B4 (CD244) 68. CD52. Es una proteína de unos 18 aminoácidos, portadora del epítopo antigénico diana del anticuerpo CAMPATH-1, que se emplea en el tratamiento de diferentes neoplasias linfoides. Está presente en linfocitos, monocitos y neutrófilos 69,70, y los anticuerpos que reaccionan con CD52 son capaces de activar el complemento, con lo que se produce la lisis de la célula. Este hecho indica que las células deficientes en CD52 deberían de ser más resistentes a la acción del complemento que las normales en presencia de anticuerpos anti-cd CD58. Es una proteína de 25 kd que desarrolla un importante papel en la regulación de la respuesta inmunitaria 72. La unión con su ligando, la molécula de adherencia CD2, desencadena la activación de los linfocitos T 73,74. CD58 se expresa en la superficie de las células nucleadas bien como proteína transmembrana, bien como anclada a GP 75. CD66b. Pertenece a un grupo de proteínas relacionadas entre sí, al que también pertenece el antígeno carcinoembrionario 76. La estimulación de neutrófilos se asocia habitualmente a un aumento de expresión de esta proteína en la membrana citoplásmica de estas células 77, mientras que la inducción de apoptosis de dichas células se relaciona con una disminución de su expresión 78. CD87. Desde el punto de vista funcional, es el receptor para el factor activador del plasminógeno tipo urocinasa, que cataliza la transformación de plasminógeno en plasmina en el inicio de la fibrinólisis 79. Como consecuencia de ello, CD87 tiene un papel esencial en el reclutamiento de leucocitos al foco inflamatorio, en la angiogenia y en el desarrollo de metástasis tumorales 80,81. CD109. Es una glucoproteína monomérica de 170 kd, perteneciente a la familia de las alfa-2-macroglobulinas, que se expresa en células T activadas, progenitores y células maduras de línea mieloide (monocitos, granulocitos y plaquetas), y que está ausente en precursores linfoides. Además, CD109 se expresa también en células endoteliales de venas y arterias 82,83. CD157. Es una ectoenzima de 45 kd que pertenece a la familia de CD38. Presenta 2 dominios: uno implicado en la actividad enzimática de la molécula y otro con propiedades de adherencia y señalización Otras proteínas asociadas a GP, así como su distribución celular y funciones principales, se muestran en la tabla 1. Hemoglobinuria paroxística nocturna Características clínicas La HPN es una enfermedad poco frecuente, con una incidencia de 2-6 casos por millón de habitantes 87. Afecta con igual frecuencia a varones y mujeres, y puede manifestarse a cualquier edad. Aunque no se ha observado predisposición familiar ni racial, la HPN se describe con mayor frecuencia en algunos países del sudeste asiático, al igual que ocurre con la anemia aplásica 88. Es una enfermedad crónica, cuya supervivencia desde el diagnóstico se estima en años y puede incluso descender hasta 8 años en pacientes no tratados 89. En estos pacientes, la muerte se produce principalmente por trombosis (en general venosas y mucho más raramente arteriales) o complicaciones derivadas de citopenias progresivamente más marcadas. La transformación a leucemia aguda es poco frecuente (< 5% de los casos) y se ha descrito la remisión espontánea de la HPN con recuperación de un estado de normalidad en alrededor de un 15% de los casos 89. Desde el punto de vista clínico, la hemólisis intravascular es la principal manifestación de la enfermedad y genera hemoglobinuria en la cuarta parte de los pacientes. Las exacerbaciones nocturnas que dan nombre a la enfermedad se deben al incremento de la hemólisis durante el sueño por la acidificación del suero asociada a la ralentización de la función respiratoria 90. Med Clin (Barc). 2008;131(16):

6 La tromboembolia venosa constituye una de las complicaciones más temidas de la HPN 91 y su frecuencia oscila entre un 12 y un 40% de los casos 89,92. Ello se debe a que los fenómenos tromboembólicos constituyen el factor pronóstico adverso de mayor impacto en la supervivencia de estos pacientes. La mayoría de las trombosis son intraabdominales y afectan principalmente a la vena hepática (síndrome de Budd-Chiari) 93,94. Estudios recientes realizados en una cohorte relativamente grande de pacientes muestran que aquellos que presentan un porcentaje de neutrófilos deficientes en GP superior al 50% tienen un riesgo mayor de trombosis 95,96. Merece destacarse, por lo tanto, la importancia clínica de la determinación precisa del tamaño del clon HPN en la población de granulocitos. La estrecha relación entre la HPN y la hipoplasia medular fue descrita por primera vez por Dacie y Lewis en ,98. De hecho, en un elevado porcentaje de casos de HPN se detecta cierto grado de citopenia, que puede afectar sólo a una línea celular o asociarse a una insuficiencia medular grave con pancitopenia. ncluso cuando el recuento celular en sangre es normal, el examen de médula ósea y el cultivo de progenitores hematopoyéticos revelan una acentuada disminución de la hematopoyesis Recientemente se han establecido 3 subgrupos diagnósticos de HPN 102 : 1. HPN clásica. Se caracteriza por la presencia de hemólisis intravascular, un porcentaje elevado de granulocitos deficientes en GP y una población mayoritaria de hematíes tipo (completamente deficientes en proteínas asociadas a GP). 2. HPN asociada a otras hemopatías. Estos pacientes presentan hemólisis intravascular asociada a otra hemopatía, como puede ser anemia aplásica o síndrome mielodisplásico. 3. HPN subclínica. No hay evidencias clínicas de hemólisis, pero pueden detectarse pequeños clones de células hematopoyéticas deficientes en GP al realizar un análisis por citometría de flujo. En la actualidad el único tratamiento verdaderamente curativo de la HPN es el trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos, que se realiza con éxito en algunos pacientes Sin embargo, esta modalidad terapéutica sólo está indicada en un número reducido de casos debido a las restricciones de edad y a la disponibilidad de donantes, además de los riesgos que conlleva para la vida. Asimismo, merece destacarse la remisión completa y espontánea de la enfermedad en una proporción significativa (15%) de pacientes 89. Ante esta situación, el tratamiento de la HPN ha sido durante décadas fundamentalmente sintomático, enfocado a controlar las posibles complicaciones de la enfermedad, con especial relieve de la anticoagulación profiláctica para prevenir la trombosis 95 y de las transfusiones en los pacientes con hemólisis grave 106. El avance más importante producido en los últimos años en el tratamiento de la HPN es la reciente introducción del eculizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado que inhibe la activación del complemento bloqueando la proteína C5a 107,108. Ensayos clínicos en fase han demostrado muy recientemente la utilidad de este fármaco para reducir de forma significativa los episodios de hemoglobinuria y hemólisis intravascular , así como los episodios tromboembólicos 111. Diagnóstico de laboratorio Durante muchos años el test de Ham 8,112,113, o prueba de la hemólisis ácida, ha sido el método de elección para el diagnóstico de la HPN. Esta prueba de laboratorio se fundamenta en el principio de que los hematíes de pacientes con HPN son más sensibles a la acción de las proteínas del sistema del complemento cuando se activan en un medio ácido. En este ensayo, el efecto hemolítico del suero disminuye con el calentamiento y las células normales no se lisan. La prueba es específica, ya que, aunque también es positiva en la anemia eritroblástica multinuclear asociada a test del suero acificado positivo o HEMPAS (del inglés hereditary erytroblastic multinuclearity positive acidified serum lysis test) 114, en las células de pacientes con este último síndrome sólo se produce hemólisis cuando los hematíes se incuban en presencia de suero normal compatible y acidificado, pero no en presencia del suero propio 115. Algunas modificaciones de este test permiten identificar diferentes poblaciones de hematíes de acuerdo con su sensibilidad a la lisis mediada por el complemento: hematíes tipos, y, correspondientes a una sensibilidad normal, moderada y alta, respectivamente 116. En contrapartida, la principal limitación de esta técnica reside en que su sensibilidad es relativamente baja, sobre todo en pacientes que han recibido con anterioridad transfusiones de concentrados de hematíes, pues presentan pequeños clones de hematíes HPN, lo que da lugar a falsos negativos 117,118. Una prueba alternativa al test de Ham, basada también en el incremento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento, es la prueba de la sacarosa 112,119,120. Mediante esta prueba se evalúa la mayor o menor sensibilidad de los hematíes a ser lisados por el sistema del complemento en presencia de solutos de baja fuerza iónica (sacarosa) que inducen la unión de complemento sérico a la membrana eritrocitaria y que, en el caso de hematíes HPN, facilitarán su hemólisis 121. El grado de hemólisis observado con el test de la sacarosa puede variar muchísimo de unos pacientes a otros (entre un 10 y un 80% de hemólisis) y se han descrito falsos positivos, como en la mielofibrosis idiopática. Además, al igual que ocurre con la prueba de Ham, no proporciona una información cuantitativa acerca de la magnitud con la que el clon HPN está representado en la muestra. Otras pruebas basadas en el citado aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento, cuyo uso no está tan extendido, son la prueba de la inulina, descrita por Brubaker et al 122 en 1973, y la prueba de la trombina (test de Crosby). En ambas se favorece la lisis mediante la adición de activadores como la inulina y la trombina, respectivamente 123. El análisis por citometría de flujo de la expresión de proteínas ancladas a GP surgió como un método complementario a los tests anteriores. Comenzó a utilizarse en 1985 y desde entonces se ha aplicado satisfactoriamente en el estudio de muestras de pacientes con HPN 117, , hasta convertirse en el método de elección para el diagnóstico de laboratorio de esta enfermedad 109,127,128. Sin embargo, un análisis detallado de los resultados obtenidos hasta la fecha pone de manifiesto la existencia de diferencias sustanciales entre distintos autores en cuanto al tipo de muestra analizada, el conjunto de anticuerpos empleados, los protocolos de marcaje y las estrategias de análisis de los datos obtenidos 112,117,127, En la actualidad el diagnóstico inequívoco de HPN requiere la demostración de la deficiencia de al menos 2 proteínas ancladas a GP en al menos 2 poblaciones celulares diferentes, con el fin de excluir los casos que presentan deficiencias congénitas de un solo antígeno y obviar algunos problemas técnicos 133,134. Desde el punto de vista práctico, la sensibilidad de la citometría de flujo es claramente superior a la de las técnicas tradicionales em- 622 Med Clin (Barc). 2008;131(16):617-30

7 pleadas para el diagnóstico de HPN. Un análisis multiparamétrico en el que se combinan la información sobre las características de dispersión de luz y la expresión de al menos 3 proteínas (fluorescencias) permite, de forma relativamente sencilla, identificar subpoblaciones de leucocitos deficientes en proteínas asociadas a GP en sangre periférica 135. Esto es especialmente importante cuando la población de hematíes deficientes en proteínas ancladas a GP es pequeña, como ocurre en la HPN subclínica o en pacientes transfundidos en los que los hematíes circulantes son mayoritariamente del donante. De todas las proteínas asociadas a GP, las más empleadas para este fin son CD55 y CD59, ya que se expresan tanto en leucocitos como en hematíes y plaquetas. Sin embargo, el análisis simultáneo de la expresión de estas proteínas en las diferentes poblaciones de células hematopoyéticas presentes en sangre periférica hematíes, plaquetas y leucocitos presenta varias limitaciones técnicas, debido a las grandes diferencias existentes en la frecuencia relativa de estas poblaciones celulares y en la intensidad con que en ellas se expresan ambas moléculas. En este sentido, de acuerdo con resultados publicados recientemente por nuestro grupo, el empleo de una técnica de inmunofenotipificación en la que la eliminación de los hematíes de la muestra se realiza mediante la introducción de un paso de lisis seguido de un lavado, antes del marcaje de los leucocitos, con anticuerpos frente a las proteínas CD55 y CD59, permite optimizar el marcaje simultáneo de ambas proteínas en las subpoblaciones leucocitarias mayoritarias de sangre periférica 136. Asimismo, la combinación de 3 anticuerpos monoclonales (CD64, CD45 y CD61) conjugados con 2 fluorocromos diferentes en un protocolo de marcaje, en ausencia de lisis y lavado, permite el análisis simultáneo de la expresión de CD55 y CD59 en hematíes, plaquetas y en las 3 poblaciones mayoritarias de leucocitos circulantes (monocitos, linfocitos y granulocitos neutrófilos), y representa un nuevo método, rápido, simple y reproducible para el rastreo diagnóstico de HPN en muestras de sangre periférica 136. Sin embargo, si bien el uso combinado de CD55 y CD59 resulta muy útil para el diagnóstico de HPN en sangre periférica, su utilidad no es óptima para identificar el clon HPN en algunas subpoblaciones de leucocitos y en las plaquetas, donde la expresión normal de ambos marcadores es débil 137. De acuerdo con los resultados obtenidos recientemente por nuestro grupo, la mejor combinación de marcadores para el rastreo diagnóstico de HPN incluiría la evaluación de CD14 en monocitos y de CD16 en neutrófilos, ya que ambos marcadores permiten la identificación inequívoca de células HPN en todos los pacientes analizados y, además, el mayor porcentaje de células afectadas corresponde de forma sistemática a estas 2 poblaciones celulares. En todo caso, debe mantenerse el análisis de las moléculas CD55 y CD59, pues la observación de una expresión deficitaria en estas proteínas por parte de otras poblaciones celulares (como, por ejemplo, los hematíes) tiene un interés clínico adicional. Por otra parte, merece destacarse que habitualmente es desaconsejable realizar el rastreo de HPN en muestras de médula ósea, ya que la expresión de proteínas ancladas a GP depende del estadio madurativo de las diferentes series hematopoyéticas, lo que complica de forma innecesaria el análisis 138,139. En la última década se ha descrito, como método alternativo a los estudios inmunofenotípicos, una nueva técnica de citometría que se basa en la evaluación de muerte celular en presencia de aerolisina. La aerolisina es una toxina secretada por la bacteria Aeromonas hydrophila, capaz de unirse a GP 140,141 ; tras su unión a éste, forma poros en la membrana celular que la hacen permeable a colorantes y fluorocromos vitales 140. A diferencia de las células hematopoyéticas normales, las células de pacientes con HPN son resistentes a la toxina, ya que presentan una expresión deficiente de su molécula diana (GP) 142,143. La aerolisina puede utilizarse no sólo para identificar células del clon HPN, sino también para seleccionar pequeñas poblaciones de estas células deficitarias en GP. Más recientemente se ha producido una variante de la proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluoresceinated proaerolysin variant) que mantiene la capacidad de unión a GP sin formar poros en la membrana y que puede emplearse junto con la citometría de flujo para el diagnóstico de la HPN 144. Por lo tanto, mediante la citometría de flujo actualmente es posible analizar todas las poblaciones celulares mayoritarias de sangre periférica, incluidos los hematíes, las plaquetas y los leucocitos. Al mismo tiempo, los estudios de citometría permiten realizar una evaluación cuantitativa de la expresión de distintas proteínas asociadas a GP e identificar pequeñas poblaciones celulares pertenecientes al clon HPN 117, Todo ello ha conducido a que actualmente esté indicada la realización de rastreo de HPN en pacientes que presentan anemia aplásica, citopenias periféricas de origen desconocido, infecciones de repetición y/o fenómenos tromboembólicos sin causa aparente que los explique 124, Además de estas aplicaciones en el diagnóstico de la HPN, en los últimos años se viene utilizando también la citometría de flujo como método de elección para comprobar el tamaño del clon HPN en ensayos clínicos en los que se evalúa la utilidad del tratamiento con anticuerpos anti-c5 (Soliris TM ) en estos pacientes ,149,150. Alteraciones en la expresión de proteínas ancladas a GP en células hematopoyéticas de pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna Un déficit en la síntesis de GP conlleva una degradación anormalmente incrementada en el retículo endoplásmico de las proteínas que se anclan a la membrana a través de esta molécula 151, con la consiguiente disminución o ausencia de expresión de estas proteínas en la membrana citoplásmica de la célula afectada, excepto en el caso de proteínas que, como CD16 o CD58, pueden expresarse también como proteínas transmembranarias 75,152. En muchos pacientes se observa un déficit prácticamente total de GP, mientras que en otros las células son capaces de sintetizar pequeñas cantidades de esta molécula; como consecuencia de ello las diferentes proteínas asociadas a GP sintetizadas compiten por unirse a los residuos disponibles de GP, lo que da lugar a patrones de expresión de proteínas asociadas a GP en los que se observa un déficit total de unas y parcial de otras. Este fenómeno se observa principalmente en hematíes y permite subdividirlos en 3 tipos de acuerdo con su reactividad por citometría de flujo para proteínas asociadas a GP, como CD : los que presentan una expresión normal de proteínas ancladas a GP pertenecerían al tipo ; los de tipo muestran una expresión reducida pero claramente detectable de estas proteínas, y los de tipo son completamente deficientes en su expresión. Los pacientes que presentan HPN clásica con crisis hemolíticas suelen tener una proporción mayor de hematíes tipo, mientras que aquellos en quienes la HPN se asocia con aplasia medular presentan hematíes tipo, asociados o no a pequeños clones de tipo 154. Desde hace tiempo se reconoce la existencia de una clara asociación entre las manifestaciones clínicas de la HPN y el déficit de expresión de algunas proteínas ancladas a Med Clin (Barc). 2008;131(16):

8 GP. La más característica es la hemólisis intravascular, producida por la ausencia o disminución acentuada de las proteínas reguladoras del complemento CD55 y, especialmente, CD59 133,155. Además, la deficiencia de CD59 se ha relacionado también con la aparición de episodios trombóticos. En personas sanas el complejo C5b-9, cuya formación está inhibida por CD59, induce la liberación de vesículas de la superficie de las plaquetas que favorecen la formación del complejo enzimático de la protrombinasa 156. En ausencia de CD59, este proceso puede verse amplificado en plaquetas de pacientes con HPN en respuesta a la activación del complemento 157, aumentando la producción de trombina. Además, la ausencia de CD87 en las plaquetas de pacientes con HPN, junto con un aumento de CD87 soluble, puede contribuir al desarrollo de trombosis por inhibición de la actividad fibrinolítica 158,159. Por otra parte, la expresión deficitaria de determinadas proteínas (p. ej., CD58 y CD66b) en la superficie de los granulocitos neutrófilos tiene como consecuencia una alteración en su capacidad de adherencia y migración 160,161. Asimismo, estudios recientes han demostrado que los granulocitos neutrófilos que carecen de expresión de proteínas ancladas a GP presentan mayor capacidad fagocítica asociada a una menor actividad oxidativa 162, hallazgos que se han relacionado con la mayor susceptibilidad a las infecciones que presentan los pacientes con HPN. Aunque los pacientes con HPN suelen presentar también linfocitos deficientes en la expresión de proteínas ancladas a GP , con frecuencia su proporción es pequeña. Respecto a la distribución de las diferentes subpoblaciones mayoritarias de linfocitos, en la mayoría de los casos las células B suelen verse afectadas en mayor porcentaje que los linfocitos T 166. A su vez, el número de linfocitos T y B alterados es significativamente menor que el de granulocitos neutrófilos y monocitos, y está directamente relacionado con la duración de la enfermedad. Esta menor afectación de linfocitos T se debe a que éstos tienen una vida media muy larga respecto a los granulocitos neutrófilos y monocitos, que permanecen en la circulación periférica entre 24 y 48 h; de esta forma, los linfocitos T deficientes en proteínas ancladas a GP, además de ser menos frecuentes en el momento del diagnóstico, también persisten en la circulación sanguínea más allá de la remisión completa de la enfermedad y la desaparición de células del clon HPN pertenecientes a otras líneas hematopoyéticas 89,167. Al contrario de lo que ocurre con otras series, el impacto funcional que la expresión alterada de proteínas ancladas a GP tiene en los linfocitos es poco conocido. Estudios previos han señalado que los linfocitos T deficitarios en estas proteínas tienen una respuesta menor a la presentación antigénica in vitro 166,168,169, lo que podría ayudar a explicar por qué la mayoría de los linfocitos de sangre periférica de estos pacientes presentan un fenotipo normal con expresión de CD45RA y CD197 (CCR7), en ausencia de CD45RO 166, Estudios recientes apuntan además a que determinadas subpoblaciones de linfocitos T citotóxicos pueden tener un papel relevante en la patogenia de la HPN 173,174, como se detalla más adelante. En el caso de los monocitos, la proteína deficitaria más característica es CD14 el receptor de LPS, molécula encargada, entre otras funciones, de regular el aclaramiento de LPS durante la sepsis 56,175. Esta deficiencia teóricamente produce un aumento de la cantidad de LPS circulante, lo que empeora los síntomas de la sepsis. Sin embargo, en la HPN se ha observado un aumento de la cantidad de CD14 soluble con una funcionalidad similar en cuanto al aclaramiento de LPS 176. En este sentido, este mecanismo podría contribuir a mejorar los síntomas de los pacientes con HPN, ya que ésta parece estar directamente relacionada con la activación del complemento por el LPS absorbido en el intestino 90. Durante muchos años el diagnóstico de la HPN por citometría de flujo se ha centrado en el análisis de la expresión de las proteínas ancladas a GP en la superficie de los hematíes 177,178. Esto se debe fundamentalmente a que la manifestación clínica más característica de la enfermedad es la hemólisis intravascular y a que las técnicas empleadas con anterioridad a la citometría (como el test de Ham o la prueba de la sacarosa) estaban dirigidas de forma específica a la identificación de la alteración en los hematíes. Sin embargo, la proporción de granulocitos y monocitos anómalos refleja mejor la actividad de la célula madre alterada en la HPN, ya que su vida media es habitualmente corta, tanto en individuos sanos como en la HPN 179 ; por el contrario, la vida media de los hematíes es más larga y está significativamente acortada en los pacientes con HPN 180,181. De este modo, estudios previos han demostrado la utilidad del análisis de la expresión de CD66b, CD16 y/o CD24 en neutrófilos, en combinación o no con CD55 y CD59 3,61,127, para el diagnóstico de la HPN. Por otra parte, el análisis de los monocitos puede resultar especialmente útil en los casos en que el número de neutrófilos sea bajo o haya una proporción elevada de eosinófilos. No existe consenso en cuanto a qué anticuerpos utilizar para realizar el rastreo de células patológicas en esta población, aunque CD14 y CD55 suelen ser los más empleados 125,126,131,132,178. A pesar de afectar a una célula madre hematopoyética, el análisis de la expresión de proteínas ancladas a GP en linfocitos no se recomienda para el diagnóstico de la HPN 127, debido a que la proporción de células afectadas entre los linfocitos puede ser mínima y sumamente variable de unos pacientes a otros 169. No hay acuerdo respecto a qué proteínas ancladas a GP deben analizarse para determinar el tamaño del clon dentro de las distintas subpoblaciones linfocitarias, si bien las más empleadas con este fin son CD55, CD48 y CD59 129,169,182. Alteraciones genéticas en la hemoglobinuria paroxística nocturna Defecto bioquímico. Estudios realizados en líneas celulares de cultivo han demostrado que el defecto en la síntesis de la molécula de GP en pacientes con HPN se encuentra en el primer paso de aquélla , detectándose un déficit en la incorporación de N-acetilglucosamina en la ruta biosintética en 3 grupos de complementación diferentes, todos ellos deficientes en GP (clases A, C y H). La prueba de complementación consiste en combinar los genomas de 2 mutantes y comprobar si se restaura el fenotipo normal. Si 2 mutantes afectan a la función de genes distintos, el fenotipo será normal y se concluye entonces que las mutaciones complementan. Sin embargo, si se produce la pérdida de función de un mismo gen, se considera que ambas mutaciones no complementan y afectan al mismo gen. La realización de pruebas de complementación, en las que células de cultivo (generalmente linfocitos B transformados con virus de Epstein-Barr) 186,187 o granulocitos procedentes de pacientes con HPN se fusionaban con líneas celulares de ratón, demostró que en todos los casos las células de la clase A no complementaban con las células HPN, mientras que las de otras clases sí lo hacían 18,188. De este modo se estableció que el gen alterado en la HPN correspondía a la clase A de complementación. Más tarde, a partir de líneas celulares mutantes, previamente caracterizadas por pertenecer a la clase A, se aisló ADN complementario capaz de restaurar la expresión de proteínas ancladas a GP, y a este 624 Med Clin (Barc). 2008;131(16):617-30

9 gen se le denominó PG-A (de fosfatidilinositolglucano de clase A). Mutaciones del gen PG-A en la hemoglobinuria paroxística nocturna. La síntesis de GP es un proceso complejo, en el que intervienen numerosos genes 189. Sin embargo, en pacientes con HPN no se han identificado mutaciones en ningún gen diferente del PG-A codificado en el cromosoma X. Esto es debido a que los demás genes implicados en la ruta de síntesis de GP se localizan en cromosomas autosómicos. Dado que la HPN es una enfermedad adquirida, causada por una mutación somática, y que la mutación debe producir una pérdida de funcionalidad para que la enfermedad se desarrolle, en el caso de genes autosómicos sería necesario que la mutación se produjera en ambos alelos. Sin embargo, en el caso de genes localizados en el cromosoma X, como PG-A, una sola mutación es suficiente para producir una pérdida en la síntesis de GP y, por lo tanto, una deficiencia en la expresión de proteínas ancladas a través de esta molécula, debido a que las células somáticas son estructural (en los varones) o funcionalmente (en las mujeres) haploides para dichos genes 43,44,190. Hoy se sabe que la mutación en el gen PG-A tiene lugar en la célula madre hematopoyética después de la inactivación del cromosoma X y, por consiguiente, las mutaciones producidas en el alelo inactivo son fenotípicamente silentes 118,190,191, lo que contribuiría a explicar la frecuencia similar de HPN en varones y mujeres. Hasta la fecha se ha identificado más de un centenar de mutaciones diferentes del gen PG-A en pacientes con HPN, y son contadas las que se repiten de forma recurrente en diferentes pacientes 18, Aunque las mutaciones identificadas abarcan todo el gen, son más frecuentes las que afectan al exón 2, debido probablemente a que éste es el de mayor tamaño 201. Predominan las mutaciones que anulan por completo la funcionalidad del gen PG-A, consistentes en pequeñas inserciones o deleciones, de uno o 2 nucleótidos, que producen un cambio en el marco de lectura y tienen como consecuencia la aparición prematura de un codón de terminación 191,202,203. Esto produce una transcripción de ARN mensajero (ARNm) inestable o una proteína truncada, sin actividad enzimática. Con menor frecuencia las mutaciones que modifican el marco de lectura producen un cambio en el punto de corte y unión entre un exón y un intrón, lo que afecta al tamaño y a la estabilidad del ARNm 204. Las mutaciones puntuales debidas a la sustitución de un solo par de bases representan una minoría de las mutaciones del gen PG-A descritas 193 y pueden estar asociadas a cambios en el punto de corte y unión entre exones, a mutaciones sin sentido que dan lugar a un codón de terminación o a mutaciones sustitutivas, que producen cambios en un solo aminoácido. Estas últimas tienden a concentrarse en 2 regiones del exón 2 sumamente preservadas en la evolución y con elevada homología entre el ser humano y organismos unicelulares como levaduras y protozoos 205,206. Algunas mutaciones alteran pero no anulan por completo la función de PG-A ,207. La consecuencia de dichas mutaciones es la expresión reducida de proteínas ancladas a GP en la superficie de la célula, así como una sensibilidad intermedia a la lisis mediada por el complemento (HPN de tipo ) 208. En este caso, generalmente se trata de mutaciones sustitutivas en las que el cambio en un aminoácido afecta a la función de la proteína pig-a 195,209. La deficiencia parcial de esta proteína puede deberse también a una mutación puntual que genere un punto de corte y unión entre exones alternativo, lo que da lugar a una transcripción de ARNm de menor tamaño 210. Todas las mutaciones identificadas en el PG-A son somáticas, excepto una que supone la sustitución de una arginina por un triptófano en el codón ,211. Sin embargo, esta mutación no causa HPN, posiblemente porque los primeros codones del gen no son determinantes en la función de la proteína. En algunos pacientes se observa la coexistencia de diferentes clones, cada uno mutado en una posición diferente del gen PG-A 196,199,210,212. La coexistencia de 2 mutaciones puede dar lugar a la aparición de 2 poblaciones de células que difieren en la expresión de proteínas ancladas a GP y en su sensibilidad a la lisis mediada por el complemento. En líneas celulares de linfocitos B procedentes de un mismo paciente con HPN también se han encontrado 2 alteraciones moleculares diferentes 196. Mecanismos de expansión clonal. Teoría de la patogenia doble. La presencia de una mutación somática en el gen PG-A es condición necesaria, pero no suficiente, para el desarrollo de la HPN 213. De hecho, se ha demostrado la presencia de células precursoras hematopoyéticas deficientes en GP con mutaciones en el gen PG-A en la médula ósea de individuos sanos, que no compiten en proliferación ni muestran una ventaja proliferativa respecto a células normales 214. También se han detectado pequeñas poblaciones de granulocitos deficientes en GP en personas sanas, así como linfocitos deficientes en dicha molécula en pacientes con linfoma tratados con CAMPATH En su conjunto, estos hallazgos apuntan a que la HPN sólo adquiere rasgos de enfermedad clínicamente manifiesta cuando se produce la expansión del clon mutado 216. De acuerdo con lo antes expuesto, Rotoli y Luzzato 213 señalaron que el desarrollo de la enfermedad se producía como consecuencia de 2 factores: a) la mutación somática en el gen PG-A de una célula hematopoyética pluripotencial, y b) la insuficiencia en la médula ósea que permite la ventaja proliferativa del clon mutado respecto a las células normales, de modo que aquél se convierte en dominante en la médula de estos pacientes. Este concepto define la llamada «teoría de la patogenia doble de la HPN». Si se produce una selección positiva de las células patológicas o una selección negativa de las células normales, es una cuestión aún no resuelta. wamoto et al 217 demostraron que células CD34 + de la médula ósea de pacientes con HPN mantenían la hematopoyesis cuando se trasplantaban en ratones inmunodeficientes que habían recibido una irradiación letal, sin necesidad de la administración de citocinas. Por el contrario, los ratones trasplantados con células CD34 + procedentes de individuos sanos requerían de la administración de citocinas para mantener la hematopoyesis. Estos resultados apoyan la hipótesis de la ventaja proliferativa del clon HPN. Sin embargo, otros modelos experimentales indican que la mutación del gen PG-A, por sí misma, no produce una dominancia clonal de las células HPN. En estos pacientes las células mutadas no proliferan como sucede en una leucemia, sino que permanecen estables durante un período de uno a 6 años 218, lo que parece contradecir el concepto de «ventaja proliferativa». Además, las células madre deficientes en GP de pacientes con HPN tienen una tasa proliferativa similar a las células normales, mientras que en las células GP+ (normales) de dichos pacientes es entre 20 y 140 veces inferior 100, lo que implicaría un déficit proliferativo de las células madre GP+ (normales) respecto al clon HPN. En este sentido, resultados publicados recientemente por nuestro grupo muestran la expresión alterada de varias proteínas asociadas a GP en células normales de pacientes con HPN, lo que induce a pensar que el fenotipo de las cé- Med Clin (Barc). 2008;131(16):

10 lulas deficientes podría depender no sólo del tipo de mutación del gen PG-A, sino también de otros factores asociados al microambiente celular 219. La dominancia del clon patológico dentro del microambiente medular estaría influida por diferentes factores 218. Así, Horikawa et al 220 demostraron que los granulocitos neutrófilos de pacientes con HPN presentan una mayor resistencia a la apoptosis, lo cual proporcionaría una ventaja en la supervivencia y dominancia clonal de las células HPN en estados de insuficiencia medular 220,221. De acuerdo con esto, la HPN se ha relacionado a menudo con otras enfermedades del sistema hematopoyético, como la anemia aplásica o los síndromes mielodisplásicos, lo que apuntaría a una posible conexión en la fisiopatología de estas enfermedades 89, En este sentido, tanto la HPN como la anemia aplásica son entidades clínicas de escasa incidencia y ambas cursan con pancitopenia e hipoplasia melular. La frecuente aparición de clones HPN en pacientes con anemia aplásica apoya la teoría de que la aplasia medular puede favorecer el desarrollo de HPN 222,225. En muchos casos de anemia aplásica la insuficiencia medular se produce como consecuencia de un proceso autoinmunitario 226, lo cual podría extrapolarse a la HPN. En este sentido, se han encontrado en estos pacientes alteraciones en el repertorio de linfocitos T 173 que apoyan la hipótesis de que los linfocitos T citotóxicos pueden desarrollar un papel importante en la patogenia de la enfermedad 174,227. En concreto, recientemente se ha visto que en la médula ósea de los pacientes con HPN hay a menudo expansiones oligoclonales de células T CD8 + /CD57 + que podrían intervenir en la destrucción selectiva de las células hematopoyéticas normales residuales GP+, mientras que las células del clon HPN escaparían a este daño autorreactivo, lo cual contribuiría a su supervivencia y expansión 228. Hay otras evidencias que apoyan esta hipótesis: por un lado, en la HPN se han detectado cambios en la frecuencia de linfocitos T circulantes que expresan receptores inhibidores de células citolíticas tipo KR (del inglés killer immunoglobulin-like receptor) 229,230, junto a un aumento de la expresión de marcadores de activación y adherencia (como CD25, HLA-DR y CD54) en estas células de pacientes con HPN 231 ; por otra parte, ensayos in vitro con células formadoras de colonias procedentes de la médula ósea de estos pacientes han puesto de manifiesto que éstas son menos sensibles al interferón gamma y al factor de necrosis tumoral alfa 232. n vivo, tras la realización de un trasplante no mieloablativo de células hematopoyéticas, no se observa una supervivencia predominante de las células HPN 233, lo cual puede deberse, al menos en parte, a que el tratamiento inmunodepresor asociado al régimen preparatorio contribuye a eliminar las células T implicadas en el desarrollo de la enfermedad. Además, el análisis mediante técnicas de micromatrices del ARN de las células CD34 + de pacientes con HPN ha permitido detectar una mayor expresión de genes proapoptóticos en las células GP+ (no HPN) de dichos pacientes, respecto a las células mutadas GP Además, cuando las células CD34 + de individuos sanos se exponen a interferón gamma, en el perfil genético se producen cambios similares a los observados en las células GP+ de los pacientes 235, lo que indicaría una posible relación entre el desarrollo de la enfermedad y la producción de este mediador inmunológico. REFERENCAS BBLOGRÁFCAS 1. Rosse WF. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria as a molecular disease. Medicine (Baltimore). 1997;76: Tomita M. Biochemical background of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Biochim Biophys Acta. 1999;1455: Boccuni P, Del Vecchio L, Di Noto R, Rotoli B. Glycosyl phosphatidylinositol (GP)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. 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