Eliminación de virus entéricos y/o sistemas modelo víricos en productos alimenticios

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1 Eliminación de virus entéricos y/o sistemas modelo víricos en productos alimenticios Informe final para: Dirección de Innovación y Desarrollo Tecnológico, Viceconsejería de Política e Industria Alimentaria, Dpto. Agricultura, Pesca y Alimentación, Eusko Jaurlaritza - Gobierno Vasco Sukarrieta, 14 de enero de 2008

2 Tipo documento Titulo documento Informe final Fecha 14/01/2008 Proyecto Código Cliente Avances en Eliminación de virus entéricos y/o sistemas modelo víricos en productos alimenticios VIREL : Eliminación de virus entéricos y/o de sistemas modelo víricos en productos alimenticios IA Dirección de Innovación y Desarrollo Tecnológico, Viceconsejería de Política e Industria Alimentaria, Dpto. Agricultura, Pesca y Alimentación, Eusko Jaurlaritza - Gobierno Vasco Equipo de proyecto: Nerea Casas Iñigo Martínez de Marañón Responsable proyecto Nerea Casas Maeso Informe final 2/14 AZTI Tecnalia 2005

3 1. INTRODUCCION PRINCIPALES AVANCES REALIZADOS BENEFICIOS GENERADOS...7 ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 2.1ESTADO DEL ARTE 7 ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 2.2 RESULTADOS MÁS IMPORTANTES Y UTILIDAD DE ESTOS.7 ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 2.3 PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACION PLAN DE DIFUSION...9 ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA-INTERES DE EMPRESAS PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS Y OTRAS ACCIONES FORMACIÓN DE PERSONAL Y DEL GRUPO DEL TRABAJO ENTREGABLES Y OTROS INFORMES CONCLUSIONES. ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO BIBLIOGRAFÍA... ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO...14 Informe final 3/14 AZTI Tecnalia 2005

4 1. INTRODUCCION El origen de este proyecto se basa en que en los últimos años ha habido un incremento importante de enfermedades víricas como hepatitis infecciosa y gastroenteritis transmitidas por alimentos que se consumen crudos o insuficientemente cocinados. Los alimentos más frecuentemente implicados son moluscos bivalvos (ej. almejas, ostras, berberechos y mejillones) dado que son concentradores naturales y utilizan la filtración como sistema de alimentación y acumulan, de esta manera, partículas en suspensión como bacterias y virus. Otros alimentos involucrados son los vegetales regados por aguas contaminadas fecalmente. Entre los virus de mayor relevancia destacamos el virus de la Hepatitis A y el virus Norwalk. Estos virus patógenos para el humano se encuentran relacionados con materias fecales y las vías de transmisión más frecuentes son a través de aguas contaminadas fecalmente o bien a través de manipuladores de alimentos infectados. Recientemente, Bosch et al. (2001) estudiaron un brote de hepatitis que afectó a 183 personas en Valencia y que se asoció al consumo de almejas. En nuestra comunidad, en el año 2000 se registró un brote de hepatitis A transmitida por almejas contaminadas. Este hecho, junto a la importancia de las industrias de moluscos bivalvos (depuración y cultivo almejas) en el País Vasco, ha despertado un gran interés en este campo. El control sanitario de estos alimentos basado en la determinación de indicadores bacterianos de contaminación fecal en las muestras no es fiable con respecto a la contaminación por virus. El VHA y otros virus entéricos Informe final 4/14 AZTI Tecnalia 2005

5 patógenos se han detectado en muestras de moluscos bivalvos cultivados en zonas libres de contaminación y que cumplían la Normativa Europea en referencia a los niveles de indicadores bacterianos de contaminación fecal. Por todo lo anteriormente expuesto, la preocupación está aumentando tanto desde el punto de vista epidemiológico, metodológico (estandarización de métodos de detección y cuantificación) como de seguridad alimentaria (riesgos asociados al consumo de alimentos crudo, poco cocinados o mal manipulados). Para garantizar la calidad virológica de los productos alimenticios que salen al mercado y proteger al consumidor, se requiere, por tanto, de metodologías de detección y/o infectividad así como de tecnologías de inactivación efectivas para asegurar la inocuidad de dicho producto sin alterar sus características organoléticas. En Azti, se ha empezado a trabajar en el año 2004 sobre este tema, empezando la puesta a punto de metodología de detección de VHA y agente Norwalk en el año Sin embargo, y visto la complejidad del tema, todos los recursos en el año 2005 se están centrando en este campo y en el desarrollo de protocolos para el empleo de otros virus (indicadores no patógenos) como posibles agentes víricos de más fácil uso y permitir, de esta manera, la evaluación de los diferentes procesos de inactivación. El proyecto estará centrado en desarrollar métodos que permitan detectar la presencia de virus antes y después de la aplicación de procesos de descontaminación y en evaluar el impacto de éstos sobre la inactivación de virus entéricos (Hepatitis A, norwalk, y/o surrogates) y/o bacteriófagos Informe final 5/14 AZTI Tecnalia 2005

6 Los objetivos específicos son: 1. Identificación de virus no patógenos para el hombre que puedan ser usados como indicadores a la hora de evaluar la eficacia de las diferentes tecnologías de descontaminación 2. Desarrollo de nuevas metodologías de detección y/o evaluación de infectividad que permitan validar y/o evaluar la eficacia de procesos de descontaminación de aguas y/o moluscos y/o vegetales. 3. Selección de tecnologías o procesos aplicables a la inactivación de virus y/o de modelos víricos en aguas y/o en moluscos y/o en vegetales. 4. Evaluación técnica de procesos de descontaminación (agua y productos alimenticios). 5. Evaluación de otras posibles aplicaciones de las metodologías (virus, bacteriófagos, células hosperadoras, detección e infectividad) y procesos desarrollados (tratamiento de aguas y/o productos alimenticios) 6. Implementar una metodología de trabajo en AZTI para validar y evaluar la eficacia de procesos frente a agentes bióticos no convencionales (patógenos emergentes) presentes en alimentos. Informe final 6/14 AZTI Tecnalia 2005

7 2. PRINCIPALES AVANCES REALIZADOS-BENEFICIOS GENERADOS 2.1. ESTADO DEL ARTE Se ha progresado en la recopilación y análisis de la literatura sobre nuevas metodologías de evaluación de infectividad de diversos agentes patógenos, y se ha mantenido un seguimiento de los avances en el área, con especial atención a las aportaciones en el área de biología celular y metodologías moleculares. Se han estudiado las publicaciones aparecidas en el área de nuevas tecnologías de inactivación que puedan aplicarse en alimentos para la eliminación de virus y/o sistemas modelo. Se ha recopilado información relacionada con la utilización de bacteriófagos como posibles agentes líticos de bacterias entéricas implicadas en infecciones de origen alimentario como Listeria monocytogenes, Salmonella spp etc RESULTADOS MÁS IMPORTANTES Y UTILIDAD DE ESTOS Primeramente se seleccionó el virus no patógeno Calicivirus felino como indicador de los procesos de descontaminación en diversas matrices alimentarias. Dada su facilidad de cultivo, rapidez de crecimiento y similitud con respecto a otros virus patógenos como Norovirus y virus de la hepatitis A en relación a su estabilidad y supervivencia en diversos alimentos, el Calicivirus felino es un virus modelo de interés y relevancia para diversos estudios de inactivación en alimentos mediante tecnologías de descontaminación. Con respecto al objetivo 2, se puso a punto la metodología de detección molecular RT-PCR cuantitativa mediante la selección de cebadores y sondas Informe final 7/14 AZTI Tecnalia 2005

8 para la detección del Calicivirus felino. Esta detección se realizó tanto por el método SYBR Green como mediante la utilización de sondas MGB marcadas con fluorocromos. Paralelamente, se optimizó la metodología de cultivos celulares mediante ensayos de infectividad para la evaluación de la viabilidad/infectividad de dichas partículas víricas modelo. Para ello, se compararon dos metodologías de cuantificación: el método Reed-Muench y el método de ensayos de calvas. Se seleccionó el segundo método por su simplicidad y rapidez en obtener los resultados de cuantificación. Dentro del objetivo 3, realizó una vigilancia tecnológica con respecto a las tecnologías o procesos aplicables a la inactivación de virus y/o de modelos víricos en aguas y/o en moluscos y/o en vegetales. Se seleccionaron dos tecnologías de descontaminación no térmicas: la aplicación de agua ozonizada, una tecnología química que se basa en el gran poder oxidante del ozono para inactivar microorganismos patógenos como bacterias y virus. En segundo lugar, se seleccionó una tecnología física basada en la aplicación de pulsos de luz. Ambas tecnologías se aplicaron primeramente en soluciones modelo y, seguidamente, se evaluaron en la inactivación de vegetales inoculados con Calicivirus felino. Con respecto al objetivo 4, primeramente hemos evaluado la aplicación de agua ozonizada para la inactivación del Calicivirus felino en soluciones modelo. Para ello, hemos contemplado los siguientes parámetros: tiempo de contacto con el agua ozonizada, el efecto de la agitación en la efectividad del tratamiento y tª del agua ozonizada durante su aplicación. Seguidamente y con el objetivo de evaluar dicha tecnología de descontaminación en vegetales inoculados, hemos optimizado un método para la extracción de virus entéricos (Hepatitis A, norwalk, y/o surrogates) en este tipo de alimentos. Primeramente, hemos comparado dos métodos de concentración de virus Informe final 8/14 AZTI Tecnalia 2005

9 (Calicivirus felino) en este tipo de matriz alimentaria: la ultraconcentración a xg y la precipitación con polietilen glycol (PEG-6000). Para ello, hemos evaluado y comparado ambas metodologías con respecto al porcentaje de virus recuperado, su simpleza y rapidez. Seguidamente, hemos comprobado que los extractos finales obtenidos a partir de la metodología elegida son compatibles con su análisis por RT-PCR a tiempo real para la detección del Calicivirus felino. Con respecto al objetivo 5, se ha establecido un contacto con la empresa EBI Food Safety, empresa productora de bacteriofagos. Tras varias conversaciones y cartas cruzadas, se espera firmar un convenio de colaboración con ellos para que AZTI sea un centro de validación de su tecnología. El primer borrador del acuerdo ha sido ya enviado a AZTI por parte de la empresa, borrador sobre el que se ha aportado alguna modificación y se está a la espera de obtener el documento final. Con respecto al objetivo 6, se han puesto a punto varias herramientas/metodologías de trabajo tanto a nivel interno, incluyendo también la incorporación de un equipo (microscopio invertido) necesario para el trabajo, como a nivel externo (relaciones con Hospital de Donostia e Inbiomed) PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACIÓN-PLAN DE DIFUSION Los resultados de este trabajo se han difundido a través de publicaciones técnicas y científicas, así como mediante presentaciones en congresos y/o jornadas, tal como se indica a continuación: Publicaciones Casas, N., Amarita, F., Martínez de Marañón., I. (2007). Evaluation of an extracting method for the detection of Hepatitis A virus in shellfish by SYBR- Informe final 9/14 AZTI Tecnalia 2005

10 Green Real-time RT-PCR. International Journal of Food Microbiology 120 (1-2), Casas, N. y Martínez de Marañón., I. (2007). Desarrollo de un método de detección de virus entéricos patógenos en moluscos bivalvos. Productos del mar , Contribuciones a congresos Casas, N., Montes, M., Amarita, F., Franco, J., Vicente, D. and Iñigo Martínez de Marañón (2006). Norovirus and hepatitis A virus RNA detection by reverse transcription-nested PCR in shellfish. Poster participation. FEMS Madrid, Spain. Casas, N., Amarita, F., Montes, M., Vicente, D., Franco, J., and Iñigo Martínez de Marañón (2006). Development of an extracting for the detection of Norovirus and Hepatitis A virus RNA in shellfish by RT-PCR. Oral participation. Food Micro. Bologna, Italy POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA-INTERES DE EMPRESAS El reglamento CE 2073/2005 ha propuesto recientemente incluir parámetros víricos como NoV en el control sanitario de moluscos bivalvos para garantizar su calidad microbiológica. Por esta razón, la obtención de una metodología rápida y eficaz para la detección molecular de virus patógenos de interés resulta de gran relevancia para las empresas agroalimentarias. Una empresa importante del Pais Vasco se ha puesto ya en contacto con nosotros para tener información de las metodologías desarrolladas en AZTI y para ver la posibilidad de adaptar éstas a sus laboratorios. Tras varias reuniones con ellos, se ha decidido en AZTI modificar algo la metodología previamente desarrollada para adaptarse a algunas de las necesidades Informe final 10/14 AZTI Tecnalia 2005

11 planteadas por dicha empresa u otros planteamientos que pudiesen surgir de otras empresas PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS y OTRAS ACCIONES Los resultados obtenidos en este estudio han permitido además la generación de nuevos proyectos y la preparación de propuestas para futuros proyectos de investigación: -Se ha presentado, en el marco del convenio de colaboración susrito entre el Dpto de Agricultura, Pesca y Alimentación y la Fundación Azti, el proyecto CULTICEL, Desarrollo de cultivos celulares para la validación/evaluación de tecnologías de descontaminación de agentes biológicos en aguas y/o alimentos. Este proyecto hace uso de conocimientos generados en el transcurso del proyecto VIREL, y está centrado en evaluar el impacto de diferentes procesos de descontaminación sobre agentes biológicos de diversa naturaleza mediante cultivos celulares. -Se ha establecido un contacto para una colaboración futura con la empresa EBI Food Safety para que AZTI sea un centro de validación de la tecnología emergente de bioconservación mediante la utilización de bacteriofagos líticos de bacterias patógenas como Listeria monocytogenes. -Se mantiene la colaboración con el Hospital Donostia con el fin de plantear futuras propuestas relacionadas con la incidencia de virus entéricos en el País Vasco FORMACION DE PERSONAL Y DEL GRUPO DE TRABAJO Informe final 11/14 AZTI Tecnalia 2005

12 Se está formando y especializando un grupo de personas de esta Unidad, y así acometer actividades de mayor alcance y rigor científico-técnico. Concretamente se ha asistido a los siguientes congresos y Symposium con el objetivo de profundizar en tecnologías emergentes de descontaminación como ozono y sus aplicaciones así como conocer el procedimiento correcto para la validación de nuevas tecnologías de descontaminación de alimentos. Asistencia a XII Internacional Ozone Congress, Valencia. Noviembre Asistencia a Food Safety: Novel foods: Barcelona. Noviembre ENTREGABLES Y OTROS INFORMES Trabajamos en la redacción de protocolos donde se describen la metodología desarrollada. Por ejemplo: Protocolos de extracción de Norovirus y Virus de la hepatitis A de diversas matrices alimentarias como vegetales y moluscos. Protocolos de detección molecular de Calicivirus Felino por RT-PCR a tiempo real. Protocolo de detección de infectividad/viabilidad de Calcivirus felino por técnicas de cultivo celular. Protocolo de evaluación de la eficacia de las tecnologías de inactivación seleccionadas (agua ozonizada y pulsos de luz) mediante técnicas de cultivo celular y herramientas moleculares. Informe final 12/14 AZTI Tecnalia 2005

13 3. CONCLUSIONES Como resultado del trabajo realizado a lo largo de este proyecto, se ha optimizado la aplicación del Calicivirus felino como indicador a la hora de evaluar la eficacia de las diferentes tecnologías de descontaminación. Para ello, se ha puesto a punto su detección por herramientas moleculares y se ha optimizado una metodología para su extracción a partir de diversas matrices alimentarias. Asimismo, se ha conseguido introducir en AZTI-Tecnalia una metodología de trabajo basada en cultivos celulares para la detección de virus infectivos/viables presentes en alimentos frecuentemente implicados en transmisión de enfermedades víricas. La implantación de un sistema de cultivos celulares permitirá la evaluación de la eficacia de aquellas tecnologías de descontaminación en la eliminación de diversos agentes biológicos no convencionales de transmisión alimentaria para la posterior validación de dichas tecnologías emergentes. Informe final 13/14 AZTI Tecnalia 2005

14 4. BIBLIOGRAFÍA Bosch, A. (1998) Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Int Microbiol. 1, Casas, N. and Suñen, E. (2001) Detection of enterovirus and hepatitis A virus RNA in mussels (Mytilus spp.) by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Appl Microbiol. 90, Casas, N. and Suñen, E. (2002) Detection of enteroviruses, hepatitis A virus and rotaviruses in sewage by means of an immunomagnetic capture reverse transcription-pcr assay. Microbiol Res. 157, 1-7. Fuhrman, JA. (1999) Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Lancet 399, Lees, DN. (2000) Viruses and bivalve shellfish. Int J Food Microbiol. 59, Leoni, E; Bevini, C; Degli Esposti, S and Graziano, A. (1998) An outbreak of intrafamiliar hepatitis A associated with clam consumption: epidemic transmission to a school community. Eur J Epidemiol. 14, Lodder, WJ; Vinje, J; van De Heide, R; Husman, AM; Leenen, EJ; Koopmans, MP. (1999) Molecular detection of Norwalk-like caliciviruses in sewage. Appl Environ Microbiol. 65, Metcalf, TG. (1982) Viruses in self-growing waters. Environ Intern. 7, Straub, TM; Pepper, IL; Gerba, CP. (1995) Comparison of PCR and cell culture for detection of enteroviruses in sludge-amended field soils and determination of their transport. Appl Environ Microbiol. 61, Suñen, E., Casas, N. Moreno, B., Zigorraga, C. Azpiri, M. (2004). Comparison of two methods for the detection of hepatitis A in clam samples (Tapes spp.) by reverse transcription-nested PCR Int J Food Microbiol. 91, Wait, DA. and Sobsey, MD. (2001) Comparative survival of enteric viruses and bacteria in Atlantic Ocean seawater. Wat Sci Technol. 43, Wyn-Jones, AP. and Sellwood J. (2001) Enteric viruses in the aquatic environment.j Appl Microbiol. 91, Informe final 14/14 AZTI Tecnalia 2005