11 Número de publicación: Int. Cl.: 72 Inventor/es: Thomson, Axel Andreas. 74 Agente: Urizar Anasagasti, José Antonio

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 31/43 (06.01) A61K 31/498 (06.01) A61K 31/17 (06.01) A61P 3/00 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Protección a pacientes de posibles efectos adversos de la inhibición de la vía de señalización de SHH mediante la supresión de testosterona. Prioridad: GB Titular/es: MEDICAL RESEARCH COUNCIL Park Crescent London W1B 1AL, GB 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Thomson, Axel Andreas 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Urizar Anasagasti, José Antonio ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Protección a pacientes de posibles efectos adversos de la inhibición de la vía de señalización de SHH mediante la supresión de testosterona. La presente invención se relaciona con la evitación de potenciales efectos colaterales indeseables cuando se utilizan inhibidores de la señalización por SHH, tales como la ciclopamina o sus derivados. También se relaciona con el uso de estos compuestos en combinación con un compuesto que suprime la testosterona en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades proliferativas, tales como el cáncer. La vía de señalización del HEDGEHOG SÓNICO (SHH) regula las interacciones epitelio-mesenquimales durante el desarrollo de muchos órganos. La proteína SHH se sintetiza en las células epiteliales y, en muchas situaciones, actúa como factor paracrino a través de su receptor PATCHED (PTC), que se expresa en las células mesenquimales adyacentes (Bitgood y McMahon, 199; Roelink et al., 1994; Stone et al., 1996). La disrupción de la señalización del SHH ha proporcionado evidencias de sus importantes y numerosos roles en la organogésis. Los ratones knockout para el Shh muestran numerosos defectos del desarrollo, que incluyen ciclopia, defectos del tubo neural y ausencia de estructuras distales de los miembros (Chiang et al., 1996). La inhibición de la señalización del SHH utilizando ciclopamina (Cy) ha demostrado mejor el papel de la señalización del SHH en el desarrollo del tubo neural (Roelink et al., 1994), el tracto gastrointestinal (Ramalho-Santos et al., 00; Sukegawa et al., 00), el páncreas (Kim y Melton, 1998), y en la morfogénesis de los folículos pilosos (Chiang et al., 1999). La señalización del SHH es necesaria además para la morfogénesis de las ramificaciones en el pulmón (Bellusci et al., 1997ª; Pepicelli et al., 1998). Se ha reportado la expresión del transcrito de Shh en el epitelio del seno urogenital (UGS) (Bitgood y McMahon, 199), donde es necesario para la formación de los genitales externos (Haraguchi et al., 01; Perriton et al., 02), y puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de la próstata (Podlasek et al., 1999). La organogénesis de la próstata es un proceso dependiente de andrógeno que involucra la señalización recíproca entre el epitelio y el mesénquima, pero se conoce poco acerca de los mediadores moleculares que controlan dichas interacciones epitelio-mesenquimales. Shh se expresa en el epitelio del seno urogenital (UGS) y se ha demostrado su importancia en el crecimiento de la próstata, mediante el bloqueo de SHH por anticuerpos, que redujeron el crecimiento de la próstata a partir de tejido UGS de machos trasplantado a ratones macho receptores (Podlasek et al., 1999). Podlasek et al informaron también que se incrementó la expresión del transcrito de Shh en machos en respuesta a los andrógenis, con lo que concluyeron que la expresión de Shh en la UGS inducida por andrógeno es necesaria para la inducción prostática. Sin embargo, BMP4, un posible efector de la señalización de la vía de señalización de SHH (Bitwood y McMahon, 199), se expresa en el mesénquima del UGS de manera independiente de la acción de los andrógenos (Lamm et al., 01). Esta discrepancia sugirió que el andrógeno quizás no regule a Shh en la próstata en crecimiento, motivándonos a reexaminar este asunto en detalle. Hemos analizado el papel de la señalización de SHH en la organogénesis de la próstata, mediante el examen detallado de la expresión de los transcritos de Shh y Ptc, y mediante la disrupción de la vía de señalización de SHH en la próstata ventral (VPs) cultivada in vitro. Nuestros resultados sugieren que la expresión de los transcritos de Shh y Ptc no depende de los andrógenos y que la señalización de SHH es necesaria para el crecimiento de la VP. Además, demostramos que la inhibición de la señalización de SHH durante el crecimiento de la VP afecta el crecimiento, el desarrollo del patrón y la diferenciación del epitelio, y produce conductos epiteliales prostáticos reminiscentes de la neoplasia intraepitelial prostática cribiforme humana (PIN). Por tanto, el trabajo descrito sugiere por primera vez que en el uso de compuestos que inhiben la vía de señalización de SHH para el tratamiento médico de pacientes resulta importante eliminar a los andrógenos o sus efectos. WO 99/34 describe el uso de derivados de alcaloides esteroideos como inhibidores de las vías de señalización de hedgehog. Las Patente US Nos B1 y WO 01/2713 describe a los reguladores de la vía de hedgehog. WO 02/462 describe a los antagonistas de hedgehog. Un primer aspecto de la invención se relaciona con el uso de un compuesto que suprime a testosterona o sus efectos en la producción de un medicamento para la protección de un paciente de posibles efectos adversos de un tratamiento que involucra la inhibición de la vía de señalización de SHH en el paciente. Por tanto, la invención incluye el uso de la supresión de la testosterona o sus efectos en un paciente con el objetivo de proteger al paciente contra posibles efectos adversos de la inhibición de la vía de señalización de SHH sobre la próstata del paciente. Se sugiere la inhibición de la señalización de SHH utilizando, por ejemplo, los compuestos que se describen en más detalles más adelante, para el tratamiento de varias enfermedades y estados. Por ejemplo, WO 02/462 (incorporado aquí como referencia) indica que varios de tales compuestos (como se discute después en más detalle) son útiles para la inhibición de la angiogénesis y para el tratamiento o la prevención de la proliferación celular indeseada, se describe la inhibición de la señalización de SHH para el tratamiento de enfermedades o dolencias asociadas con la angiogénesis, incluyendo la enfermedad ocular neovascular, la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética, la retinopatía o la prematuridad, el rechazo de injerto de la córnea, el glaucoma neovascular, la fibroplasia retrolental, la queratoconjuntivitis epidérmica, la deficiencia de vitamina A, el sobreuso de lentes de 2

3 contacto, la queratitis atópica, la queratitis límbica superior, el pterygium queratitis sicca, el sjogrens, el acné rosacea, la filectenulosis, la sífilis, las infecciones por micobacterias, la degeneración lipídica, las quemaduras químicas, las úlceras bacterianas, las úlceras fúngicas, las infecciones por Herpes simplex, las infecciones por Herpes zoster, las infecciones protozoarias, el sarcoma de Kaposi, la úlcera de Mooren, la degeneración marginal de Terrien, la queratosis marginal, la artritis reumatoidea, el lupus sistémico, el trauma poliarteritis, la sarcoidosis de Wegeners, la escleritis, la enfermedad de Steven Jonson, la ceratotomía radial perifigoide, el rechazo de injerto de córnea, la artritis reumatoidea, la osteoantritis, la inflamación crónica (p.e., colitis ulcerativa, o enfermedad de Crohn), el hemangioma, la enfermedad de Osler-Weber-Rendu y la telangiectasia hemorrágica hereditaria. La angiogénesis también es importante en determinados cánceres y metástasis, incluyendo tumores sólidos, tales como el rabdomiosarcoma, el retinoblastoma, el sarcoma de Swing, el neuroblastoma y el osteosarcoma, y tumores benignos tales como el neuroma acústico, el neurofibroma, la traconia y los granulomas piogénicos. Se sugiere también tratar otras enfermedades, tales como las enfermedades proliferativas de la piel, incluyendo la soriasis y el carcinoma de célula escamosa, y la hiperplasia benigna de próstata (BPH) mediante inhibidores de la señalización de SHH. Para evitar dudas, en este documento se incorporan todas las enfermedades que se tratan con un inhibidor de la señalización SHH, como se describe en WO 02/462. De manera similar, todas las enfermedades que se tratan con un inhibidor de la señalización de SHH descritas en US B1, WO 01/2713 o WO 99/34 se incorporan como referencia en este documento. Se prefiere de manera particular utilizar la supresión de la testosterona o sus efectos cuando un paciente se encuentra sometido a tratamiento por cáncer que involucra la inhibición de la vía de señalización de SHH. Por tanto, un segundo aspecto de la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de la vía de señalización de SHH en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente al cual se le administra un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Un tercer aspecto de la invención se relaciona con el uso de un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa como el cáncer en un paciente al que se le administra un inhibidor de la vía de señalización de SHH. Un cuarto aspecto de la invención se relaciona con el uso de un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa como el cáncer, en un paciente. La vía de señalización de SHH incluye a SHH, PTC, Smoothened, Gli-1, Gli-2 y Gli-3. SHH es el ligando que se une a un complejo receptor formado por PTC y Smoothened. Se cree que Smoothened es el que transduce la señal y es un elemento clave en la vía de señalización de SHH. Gli-1, Gli-2 y Gli-3 son factores de transcripción. Se puede encontrar más información acerca de la vía de señalización de SHH, por ejemplo, en WO 02/462. Por lo regular, los inhibidores de la vía de señalización de SHH causan cambios en el crecimiento y/o la diferenciación. Por lo regular, un inhibidor de la vía de señalización de SHH inhibe la producción de PTC y/o BMP-4 (proteína morfogénica de huesos 4), como respuesta a una señal de SHH. Se prefieren los compuestos que inhiben SHH o inhiben Smoothened o modulan PTC, o que inhiben la función de los Glis. En relación a los métodos de la invención, la vía de señalización de SHH se puede inhibir mediante cualquier inhibidor apropiado. WO 99/34, que se incorpora como referencia a este documento, señala que durante la biosíntesis, SHH sufre una reacción de autoclivaje, mediada por su dominio carboxi terminal, la que produce un fragmento amino terminal modificado por un lípido, el cual es responsable de toda la actividad señalizadora conocida de SHH. El autoprocesamiento de SHH provoca la unión covalente de colesterol al extremo C terminal del fragmento N terminal de SHH. WO 99/34 describe compuestos que inhiben la vía de señalización de SHH mediante, por ejemplo, la disrupción de la modificación mediante la unión de colesterol, de las proteínas de hedgehog y/o, la inhibición de la bioactividad de las proteínas de hedgehog. En particular, los alcaloides esteroideos y sus análogos pueden utilizarse para interferir las señales paracrinas y/o autocrinas producidas por SHH, en particular, las formas de la proteína que se encuentran modificadas por colesterol. Como se describe en más detalles en WO 99/34, el compuesto jervina, derivado de Veratrum inhibe dicha señal y la respuesta biológica concomitante de la célula. La capacidad de la jervina y otros alcaloides esteroideos de inhibir la señalización de SHH puede deberse a la capacidad que poseen dichas moléculas para interactuar con la vía de transducción de señales mediada por PTC o smoothened. Por ejemplo, los inhibidores pueden interactuar con el dominio o dominios de detección de esteroles del receptor de SHH, PTC, o al menos, interferir con la capacidad de SHH de interactuar con su receptor u otras moléculas asociadas con el receptor u otras proteínas involucradas en la transducción de señales mediada por SHH. Además de ello, o de manera alternativa, los efectos de la jervina sobre la señalización de SHH pueden ser resultado de disrupciones de la homeostasis del colesterol que afecten el autoprocesamiento mediado por colesterol de la proteína SHH y/o la actividad o estabilidad de la proteína. Por tanto, otras moléculas pequeñas, esteroideas y no esteroideas 3

4 que, de manera similar, interfieran con los aspectos dependientes de colesterol de la actividad de PTC, inhibirán las señales mediadas por SHH. 3 Los antagonistas de hedgehog y los compuestos que, como ejemplo, se describen en las páginas 28 a 38 de WO 99/34 se incorporan, de este modo, al presente documento mediante referencia, como compuestos que inhiben la vía de señalización de SHH. Se prefiere que el compuesto que inhibe la vía de señalización de SHH sea uno de los compuestos representados por las Fórmulas I, Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII y VIIa de WO 99/34, todos los cuales se incorporan como referencia al presente documento, incluyendo la definición y las preferencias por los sustituyentes. Al menos algunos de los compuestos se derivan de análogos de alcaloides de los tipos Solanum o Veratrum, y los compuestos incluyen derivados de la jervina, la ciclopamina, la cicloposina, la mukiamina, la veratramina, la verticina y la zigacina, la solanidina y la caconina. WO 02/462, incorporado en este documento mediante referencia, describe también los inhibidores de la vía de señalización de SHH. Estos, así como los compuestos que, como ejemplos, se describen en las páginas 33 a 112 de WO 02/462, se incorporan al presente documento, mediante referencia, como compuestos que inhiben la vía de señalización de SHH. Se prefiere que el compuesto que inhibe la vía de señalización de SHH sea cualquiera de los compuestos representados mediante las Fórmulas I, Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII, VIIa, VIII, VIIIa, IX, IXa, X, Xa, XI, XIa, XII, XIIa, XIII, XIIIa, XIV, XIVa, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV y XXV de WO 02/462, todos los cuales se incorporan mediante referencia al presente documento, incluyendo la definición y preferencias por los sustituyentes. Los mutantes de antagonistas de hedgehog que se describen en las páginas 93 y siguientes, y los antagonistas de anticuerpos, que se describen en la página 2 y siguientes, y los oligonucleótidos antisentido, ribozima y triplex, que se describen en la página 3 y siguientes se incorporan también mediante referencia al presente documento. De manera similar, los antagonistas de anticuerpos, los oligonucleótidos antisentido ribozima y triplex que inhiben cualquier parte de la vía de señalización de SHH, tales como los que se encuentran dirigidos contra PTC, Smoothened, o Gli-1, Gli-2, o Gli-3, pueden también resultar de utilidad. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas están disponibles en GenBank como sigue: Números de Acceso U43148 (PTC humano); L3818 (SHH humano); US41 (Smoothened humano); AF31673 (Gli-1 humano); AB (Gli- 2 humano); y M79 (Gli-3 humano), todas incorporadas al presente documento como referencia. Las secuencias pueden emplearse en el diseño y producción de anticuerpos, ácidos nucleicos antisentido, ribozimas y oligonucleótidos triplex, como se conoce bien en la técnica. Los antagonistas hedgehog preferidos incluyen el AY9944, el triparanol, la jervina, la ciclopamina y la tomatidina (Figura 9), el compuesto A (Figura ) y el compuesto B (Figura 11). WO 01/2713, incorporado aquí mediante referencia, describe también inhibidores de la vía de señalización de SHH Los compuestos que se describen como ejemplos en las páginas 32 a 49, incluyendo los de Fórmulas I, Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII y VIIa, se incorporan de manera específica en el presente documento mediante referencia. De manera similar, los compuestos descritos en las páginas 98 a 133, hasta el punto en que inhiben la vía de señalización de SHH, se incorporan al presente documento como referencia y, en particular, los derivados de la ciclopamina y la jervina. La patente US No B1, incorporada mediante referencia al presente documento también describe inhibidores de la vía de señalización de SHH. Los compuestos descritos en las columnas 27 a 3, incluyendo los de Fórmulas I, Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII y VIIa se incorporan específicamente mediante referencia al presente documento. Los compuestos llamados SANT-1, SANT-2, SANT-3 y SANT-4, como se describen en la Figura 3A de Chen et al (02) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, son antagonistas de Smoothened (Smo) y, por tanto, son inhibidores de la vía de señalización de SHH. Estas estructuras se han incorporado mediante referencia al presente documento. Por lo regular, la vía de señalización de SHH se inhibe mediante la administración de ciclopamina o un derivado de la misma al paciente. La vía de señalización de SHH puede ser inhibida por agentes que interfieren con la transcripción de la vía. Por tanto, el agente puede ser una secuencia antisentido. Las secuencias antisentido, que constituyen agentes para ser usados en la invención son capaces de hibridizar con la secuencia nucleotídica. El término secuencia antisentido incluye oligonucleótidos antisentido, tales como los que poseen entre y nucleótidos de longitud, así como secuencias de mayor longitud. Una persona versada en la técnica puede diseñar secuencias antisentido, mediante referencia a las secuencias nucleotídicas que codifican para SHH, PTC, Smoothened, Gli-1, Gli-2, Gli-3. 4

5 El término hibridización como se utiliza en el presente documento incluye el proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria mediante apareamiento de bases así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo in las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presente invención también abarca el uso de secuencias nucleotídicas que son capaces de hibridizar con las secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas en este documento, o cualquier derivado, fragmento, o derivado del mismo. El término variante también comprende secuencias que son complementarias a las secuencias capaces de hibridizar con las secuencias nucleotídicas presentadas en esta invención. De preferencia, el término variante comprende secuencias que son complementarias a secuencias capaces de hibridizar bajo condiciones astringentes (pe, 0ºC y 0,2xSSC {1xSSC = 0, M de NaCl, 0,0 M de Na 3 citrato ph 7.0}) con las secuencias nucleotídicas presentadas en esta invención. Con mayor preferencia, el término variante comprende secuencias que son complementarias a secuencias capaces de hibridizar bajo condiciones de elevada astringencia (pe, 6ºC y 0,1xSSC {1xSSC = 0, M de NaCl, 0,0 M de Na 3 citrato ph 7.0}) con las secuencias nucleotídicas presentadas en esta invención. La vía de señalización de SHH puede inhibirse mediante un anticuerpo que se une a SHH, PTC, Smoothened, Gli- 1, Gli-2, o Gli-3. El anticuerpo tal como se utiliza en esta invención incluye, pero no se limita, a policlonales, monoclonales, quiméricos, cadenas simples, fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una librería de expresión Fab. Tales fragmentos incluyen fragmentos de anticuerpos completos que retienen su actividad de unión por una sustancia blanco, fragmentos Fv, F(ab ) y F(ab )2, así como anticuerpos de una única cadena (scfv), proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que contienen el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Además los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, como se describe en US-A Los anticuerpos neutralizantes, o sea, aquellos que inhiben la actividad biológica de los polipéptidos, se prefieren de manera especial para el diagnóstico y la terapia. Los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas estándar, tales como la inmunización con la sustancia de la invención o mediante la utilización de una librería de fagos Si se desean anticuerpos policlonales se inmuniza un mamífero seleccionado (pe, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico que contenga un epítope obtenible a partir de un agente y/o sustancia identificado de la presente invención. En dependencia de la especie receptora, se pueden utilizar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el de Freund, los geles minerales tales como el hidróxido de aluminio, y las sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. El BCG (Bacilos Calmette-Guerin) y el Corunebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles, que pueden utilizarse si el polipéptido purificado se administra a individuos inmunológicamente comprometidos con el propósito de estimular las defensas sistémicas. Se colecta el suero de los animales inmunizados y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si un suero que contiene anticuerpos policlonales contra un epítope obtenible a partir de agente y/o sustancia identificado de la presente invención contiene además anticuerpos contra otros antígenos, se puede purificar el anticuerpo policlonal mediante cromatografía de inmunoafinidad. Se conocen en la técnica los procedimientos para la producción y procesamiento de antisueros policlonales. Para producir tales anticuerpos, la invención también proporciona polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos haptenizados a otro polipéptido para su utilización como inmunógenos en animales o humanos. Personas versadas en la técnica pueden también producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes particulares. La metodología general para producir anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas es bien conocida. Se pueden crear líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos mediante fusión de células, y también mediante otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico, o transfección con virus de Epstein-Barr. Se pueden analizar con respecto a varias propiedades paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epítopes órbita; pe, en busca de afinidad isotópica y epitópica. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan, a la técnica de hibridomas, descrita originalmente por Koehler y Milstein (197 Nature 6: ), la técnica de hibridoma de célula B (Kosbor et al (1983) Inmunol Today 4: 72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 26-) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al (198) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96). Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos, el splicing de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos de humano para obtener una molécula con especificidad antigénica y biológica adecuadas (Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81: ; Neuberger et al (1984) Nature 312: 4-8; Takeda et al (198) Nature 314: 42-44). De manera alternativa, se pueden adaptar técnicas descritas para

6 la producción de una única cadena de anticuerpos (patente US No ) para la producción de una única cadena de anticuerpos contra la sustancia específica También se pueden producir anticuerpos mediante la inducción de la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante el análisis de librerías de inmunoglobulina recombinante o paneles de reactivos de elevada especificidad de unión, como se muestra en Orlando et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: ), y Winter G y Milstein (1991; Nature 349: ). También se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para la sustancia. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos F(ab )2 que se pueden generar mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y de los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab )2. De manera alternativa, se pueden construir librerías de expresión de Fab para permitir la rápida y fácil identificación de los fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD et al (1989) Science 6: ). Dentro de la supresión de la testosterona o sus efectos en el paciente se incluye la reducción de los niveles endógenos de testosterona (por ejemplo, mediante la inhibición de su producción), la inhibición de la conversión de testosterona a dihidrotestosterona (por ejemplo, mediante la inhibición de la testosterona α reductasa), y mediante el bloqueo del receptor de andrógeno (pe, mediante el uso de un antagonista de andrógeno). Por tanto, se bloquea la vía de señalización de testosterona. También puede resultar posible bloquear la vía de señalización de la testosterona, por ejemplo, con el empleo de una molécula que suprime la producción del receptor de andrógeno (AR), tal como una molécula antisentido específica para el AR. Son bien conocidos en la técnica los agentes capaces de suprimir la testosterona o sus efectos, y pueden considerarse como agentes químicos de castración masculina. Se puede suprimir la testosterona mediante castración quirúrgica del macho, pero esto es menos preferido. En la castración química y quirúrgica de los machos se reducen los niveles de andrógenos, pero puede mantenerse un bajo nivel de andrógenos producidos por las glándulas adrenales. Por lo regular, los niveles de castración de la testrosterona se encuentran alrededor de 2 nmol/l (o 0, ng/ml) en comparación con los machos saludables que poseen valores normales de 3, a,0 ng/ml. Se prefiere de manera particular que el nivel de testosterona se suprima a los niveles de castración. De preferencia, el nivel de testosterona, o sus efectos, se suprimen mediante la administración al paciente de cualesquiera uno o más antagonistas de GnRH (LHRH), un agonista de GnRH (LHRH), un antagonista de la testosterona (andrógeno) o un inhibidor de la α reductasa. Los agonistas de GnRH (LHRH) incluyen la leuprorelina (Prostap suministrada por Wyeth, que puede administrarse, por lo regular a un nivel de 3,7 mg cada 4 semanas s.c./i.m. o 11, mg cada 3 meses s.c.); la buserelina (Suprefact suministrada por Shire) que se administra, por lo regular, a un nivel de 0, mg s.c. cada 8 horas ó 0,2 mg seis veces al día, por vía intranasal; la goserelina (Zoladex suministrada por Astra Zeneca) que se administra por lo regular como un implante s.c. de 3,6 mg cada 28 días, o implantes s.c. de,8 mg cad 12 semanas; la triptorelina (Decapeptyl sr, suministrada por Ipsen) que se administra por lo regular a un nivel de 3 mg cada 4 semanas; la nafarelina (Synarel suministrada por Searle); la deslorelina (Somagard suministrada por Shire); y la histrelina/supprelina (Ortho Pharmaceutical Corp/Shire). Los antagonistas de GnRH incluyen al teverelix (conocido también como antarelix); el abarelix (Plenaxis suministrado por Praecis Pharmaceuticals Inc); el cetrorelix (Cetrotide suministrado por ASTA Medica) que se administra por lo regular a un nivel de 0,-0,3 mg s.c. diarios; el ganirelix (Orgalutran suministrado por Organon) que se administra por lo regular a un nivel de 0, mg diarios s.c. Los antagonistas de la testosterona (andrógenos) incluyen a las ciproteronas, como el acetato de ciproterona, (Androcur suministrado por Schering Health) y administrado, por lo regular, a un nivel de 0-0 mg dos o tres veces al día p.o.; la bicalutamida (Carodex suministrada por Astra Zeneca) que se administra por lo regular a un nivel de 0-0 mg por día p.o.: y la flutamida (Drgenil suministrada por Schering-Plough) que se administra por lo regular a un nivel de 0 mg tres veces al día p.o. Los inhibidores de la testosterona α reductasa incluyen a la finasterida (Proscar suministrada por MSD) que se administra por lo regular a un nivel de mg diarios p.o. Para no dejar dudas, s.c. significa vía subcutánea; p.o. es peroral; e i.m. significa por vía intramuscular. 6 Se prefiere que el paciente sea de sexo masculino. Se prefiere, de modo particular, que el paciente sea un representante del sexo masculino post-pubescente. 6

7 Cuando se utiliza la invención en el tratamiento del cáncer, puede tratarse de cualquier cáncer, pero se prefiere que el cáncer tratado sea un cáncer en el que la vía de señalización de SHH desempeñe un papel en su crecimiento y diferenciación Los cánceres en los que se encuentra la vía de señalización de SHH incluyen el carcinoma escamoso de pulmón humano, el adenocarcinoma, el carcinoma de célula basal, el méduloblastoma, el meningioma, el hemangioma, el rabdomiosarcoma, el glioblastoma, el sarcoma, el carcinoma renal, el carcinoma de tiroides, el cáncer de huesos, y los tumores de mamas, riñón, vejiga, uréteres, próstata, glándula adrenal, estómago e intestinos. Se contempla el tratamiento del cáncer de próstata, pero no se prefiere. En relación con todos los métodos de tratamiento de la invención, la inhibición de la vía de señalización de SHH puede tener lugar antes o después, o al mismo tiempo, que la supresión de la testosterona o sus efectos en el paciente. Por tanto, el inhibidor de la vía de señalización de SHH puede administrarse al paciente antes, durante o después de que al paciente se la administre un compuesto que suprima la testosterona o sus efectos. Se prefiere que la testosterona o sus efectos se supriman antes de que se administre al paciente el inhibidor de la vía de señalización de SHH. Se administra al paciente una o varias dosis apropiadas del inhibidor de la vía de señalización de SHH y el compuesto que suprime la testosterona o sus efectos con el objetivo de proporcionar un efecto terapéutico. Los regímenes terapéuticos convenientes, incluyendo la dosificación y determinación del momento de la administración pueden prepararse para el paciente de modo que le sea administrada una cantidad adecuada de los compuestos terapéuticos y en el momento apropiado para ejercer el efecto terapéutico deseado. Un médico puede preparar regímenes terapéuticos adecuados para el paciente. Por lo regular, las dosis y los tiempos de administración son los mismos que cuando se utiliza el compuesto terapéutico en solitario. Por tanto, se pueden emplear regímenes conocidos de castración química, y se puede utilizar una dosis y un régimen de tratamiento terapéuticamente efectivos para el inhibidor de la vía de señalización de SHH, en dependencia de la enfermedad o dolencia que se esté tratando. Se pueden administrar los compuestos antes mencionados para su utilización en la invención (o sea, el inhibidor de la vía de señalización de SHH o el compuesto que suprime la testosterona o sus efectos) o una formulación de los mismos por medio de cualquier método convencional, incluyendo la inyección oral y la parenteral (p.e. subcutánea o intramuscular). El tratamiento puede consistir en una única dosis o una pluralidad de dosis en el curso de cierto período de tiempo. De preferencia, la formulación es una dosis unitaria que contiene una dosis o unidad diaria, una subdosis diaria o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente activo. Normalmente los compuestos para el uso en la invención se pueden administrar oralmente o por cualquier ruta parenteral, en forma de una formulación farmacéutica que contenga el ingrediente activo, opcionalmente, en la forma de una sal de adición no tóxica, orgánica o inorgánica, ácida o base, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. En dependencia del síndrome y el paciente de que se trate, así como de la vía de administración, se pueden administrar las composiciones en dosis variables. En la terapia humana, los compuestos para uso en la invención pueden administrarse solos, pero, por lo general, se administrarán en una mezcla con un excipiente farmacéutico apropiado, o un transportador seleccionado con respecto a la vía de administración que se pretende utilizar y a la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, los compuestos para uso en la invención pueden administrarse por vía oral, bucal o sublingual, en forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elíxires, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes colorantes o saborizantes, para aplicaciones de liberación inmediata, demorada o controlada. Los compuestos de la invención también pueden administrarse por medio de una inyección intravenosa. Tales tabletas pueden contener excipientes tales como la celulosa microcristalina, la lactosa, el citrato de sodio, el carbonato de calcio, el fosfato dibásico de calcio y la glicina, desintegrantes como el almidón (de preferencia, almidón de maíz, patata o tapioca), glicolato de almidón de sodio, sodio croscaramelosa y ciertos silicatos complejos, y adherentes de granulación, tales como la polivinilpirrolidona, la hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), la hidroxipropil celulosa (HPC), la sacarosa, la gelatina y la acacia. De manera adicional, se pueden incluir agentes lubricantes, tales como el estearato de magnesio, el ácido esteárico, el behenato de glicerilo y el talco. Se pueden emplear también composiciones sólidas de tipo similar como llenadores en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos en este sentido incluyen la lactosa, el almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilén glicoles de alto peso molecular. Para las suspensiones acuosas y/o elíxires, los compuestos de la invención pueden combinarse con varios agentes endulzantes o saborizantes, agentes colorantes o tinciones, con agentes emulsificantes y/o suspensores y con diluyentes tales como el agua, el etanol, el propilén glicol, y la glicerina, así como combinaciones de los mismos. Los compuestos para uso en la invención pueden también administrarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intrameníngea, intraventricular, intranodular, intracraneal, intramuscular, o 7

8 subcutánea, o pueden administrarse mediante técnicas de infusión. La mejor forma de utilizarlos es como soluciones acuosas estériles que pueden contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer la solución isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben ser tamponeadas de manera apropiada (de preferencia a ph desde 3 hasta 9), si fuese necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar, que son bien conocidas para las personas versadas en la técnica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril que pueden ser acuosas o no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del pretendido receptor; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes que aumentan la densidad. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitarias o múltiples dosis, por ejemplo, ámpulas y viales sellados, y pueden almacenarse en condiciones de congelación-secado (liofilización), que requiere solo la adición del transportador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su utilización. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas de los tipos antes descritos. Para la administración oral y parenteral a los pacientes humanos, el nivel de dosis diaria de los compuestos para uso en la invención será, por lo regular, de 1 a 000 mg por adulto (o sea, de alrededor de 0.0 a 7 mg/kg), administrados en una dosis única o dosis divididas. Así, por ejemplo, las tabletas o cápsulas del compuesto para uso en la invención pueden contener desde 1 mg hasta 0 mg de compuesto activo para su administración en solitario, o dos ó más a un tiempo, según sea apropiado. El médico, en cualquier caso, determinará la dosis real que resultará más adecuada para cada paciente individual y que variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente específico. Las dosis anteriores son ejemplos del caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales que ameriten el uso de dosis superiores o inferiores y tales casos se encuentran dentro del alcance de esta invención. Los compuestos para uso en la invención pueden ser administrados también por vía intranasal o mediante inhalación y son convenientemente suministrados en forma de un inhalador de polvo seco, o como presentación en un spray de aerosol en un contenedor presurizado, una bomba, un spray o nebulizador con la utilización de un impulsor apropiado, p.e., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como el 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3) o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse mediante la provisión de una válvula para proporcionar una cantidad medida. El contenedor presurizada, la bomba, el spray o nebulizador pueden contener una solución o suspensión de un compuesto activo, p.e. usando una mezcla de etanol y el impulsor como solvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, p.e., trioleato de sorbitán. Se pueden formular las cápsulas y cartuchos (hechas, por ejemplo, de gelatina) para uso de un inhalador o insuflador, de manera que contengan una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una base de polvo apropiada, tal como lactosa o almidón. Las formulaciones de aerosol o polvo seco, de preferencia, se preparan de modo que cada dosis medida o golpe contenga al menos 1 mg de un compuesto para uso en la invención para su suministro al paciente. Se apreciará que la dosis diaria completa que se administra a un paciente variará de un paciente a otro y puede administrarse en una única dosis o, más usualmente, en dosis divididas a lo largo del día. Alternativamente, los compuestos para uso en la invención pueden administrarse en forma de un supositorio o pesario, o pueden aplicarse tópicamente, en forma de una loción, solución, crema, pomada o polvo. Los compuestos para uso en la invención pueden también administrarse transdérmicamente, por ejemplo, mediante el uso de un parche de piel. También pueden administrarse por vía ocular, en particular para el tratamiento de enfermedades del ojo. Para uso oftálmico, los compuestos para el uso en la invención pueden formularse como suspensiones micronizadas salinas estériles, isotónicas, con ph ajustado o, de preferencia, como soluciones salinas estériles, isotónicas, con ph ajustado, de modo opcional en combinación con un preservante tal como el cloruro de benzalconio. De manera alternativa, se pueden formular en una pomada como el petrolato. Para aplicación tópica a la piel, los compuestos para uso en la invención pueden formularse como una pomada apropiada que contenga el compuesto activo suspendido o disuelto en ella, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilén glicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsificante, y agua. De manera alternativa, se pueden formular como una loción o crema apropiada, suspendidos o disueltos en ella, por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilén glicol, parafina líquida, polisorbato, cera de ésteres de cetilo, alcohol de cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol benzílico, y agua. Las formulaciones apropiadas para la administración tópica en la boca incluyen las pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o goma tragacantos; pastillas que contienen el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y lavados bucales que contienen el ingrediente activo en un transportador líquido apropiado. 8

9 3 4 0 Por lo general, en humanos, la administración oral o tópica de los compuestos de la invención, es la vía preferida, siendo la más conveniente. En circunstancias en las que el receptor padece de desórdenes al tragar o de impedimento de la absorción de fármacos tras la administración oral, se puede administrar el fármaco parenteralmente, p.e., por vía sublingual o bucal. Un tercer aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto que suprime la testosterona o su efecto en la fabricación de un medicamento para proteger a pacientes de sexo masculino de los posibles efectos adversos de un tratamiento que involucra la inhibición de la vía de señalización de SHH en el paciente. Un cuarto aspecto de la invención proporciona el uso de un inhibidor de la vía de señalización de SHH en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, tal como el cáncer en un paciente al que se le administra un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Un quinto aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente al que se administra un inhibidor de la vía de señalización de SHH. En relación con los aspectos tercero, cuarto o quinto de la invención, el orden de administración puede no resultar crítico. Por tanto, al paciente se le puede haber administrado el inhibidor de la vía de señalización de SHH antes de la administración del compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente, o se administra el inhibidor de la vía de señalización de SHH al mismo tiempo que el inhibidor del compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente, o se administra el inhibidor de la vía de señalización de SHH después de la administración del compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Sin embargo, es preferible que la testosterona o sus efectos se supriman en el paciente antes de la administración del inhibidor de la vía de señalización de SHH. Un sexto aspecto de la invención proporciona el uso de una combinación de un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa tal como el cáncer, en un paciente. Un séptimo aspecto de la invención proporciona un sistema terapéutico para el tratamiento de une enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente, cuyo sistema comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Un octavo aspecto de la invención proporciona una composición que comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Un noveno aspecto de la invención proporciona una composición que comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente para el uso en medicina. Por tanto, la composición se empaqueta y se presenta para el uso en medicina, por ejemplo, como un medicamento. La composición puede utilizarse en humanos o en medicina veterinaria; preferentemente, se utiliza en medicina humana. Por lo regular, la composición comprende además un transportador farmacéuticamente aceptable. Por tanto, una composición farmacéutica (o, formulación, como se le puede llamar) que comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH, un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente y un transportador farmacéuticamente aceptable, resulta útil en la puesta en práctica de la invención. El transportador o los transportadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con la composición de la invención y no ser deletéreo para el receptor de la misma. Por lo regular, los transportadores serán agua o solución salina que estarán estériles y libres de pirógenos. Por tanto, un décimo aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente y un transportador farmacéuticamente aceptable. Los tipos ed composiciones (o formulaciones) se describieron anteriormente con más detalles. El paciente es, de preferencia, un humano, aunque el paciente puede ser cualquier mamífero, tal como un gato, un perro, un caballo, una vaca, una oveja, un caballo, un cerdo y, por tanto, tiene aplicaciones veterinarias. 6 Para el uso veterinario, un compuesto para uso en la invención se administra como una formulación apropiadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que resultarán más apropiados para el animal específico. En relación con los aspectos segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno y décimo de la invención, los compuestos que se prefieren con respecto al primer aspecto de la invención también se prefieren para dichos aspectos. A continuación se describirá en más detalle la invención, mediante referencia a los siguientes Ejemplos y figuras, de los cuales: La Figura 1 es un análisis de la distribución del transcripto de Shh mediante hibridización in situ. Las ribosondas control sentido y antisentido, marcadas con 33 P se hibridizaron con secciones de UGT de ratas macho P0 embebidas en parafina, de 7 µm. (A) La imagen de campo brillante muestra las vesículas UR, VP y seminales (SV); (B) La imagen de 9

10 campo oscuro de (A) muestra los transcriptos de Shh en el epitelio uretral (URE) y las yemas epiteliales (VPE) de VP en desarrollo. (C, D) muestran ampliaciones de (A, B) respectivamente. (D) muestra transcriptos de Shh expresados en las VPE. (E) La imagen de campo brillante muestra la UR, VP, la próstata dorsal (DP) y la próstata dorsolateral (DLP); (F) La imagen de campo oscuro de (E) muestran transcriptos de Shh en el URE y la yema epitelial (DPE, DLPE, y VPE) de los lóbulos en desarrollo de DP, DLP y VP. (G, H) muestran ampliaciones de (E, F) respectivamente. Barra de escala, 00 µm. La Figura 2 es un análisis de los transcriptos de Shh y Ptc en UGT, VP, y UR de ratas macho, mediante un ensayo de protección por RNAsa. El RNA se hibridizó con ribosondas marcadas con 32 P para Shc, Ptc y, utilizando la Ciclofilina (Cphn) o 28S como estándares internos. Los niveles de los transcritos se normalizaron a Cphn o 28S. Las figuras que se encuentran debajo de las autorradiografías muestran los % de abundancia de transcriptos, relativos a UGT P0 (A) o VP P0 (B, C), calculados como un promedio de tres experimentos independientes. (A) Niveles de los transcriptos de Shh y Ptc en el UGT en desarrollo de ratas macho. (B) Niveles de los transcriptos de Shh y Ptc en el VP postnatal. (C) Comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre VPs y URs postnatales. La Figura 3 es una comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre los UGTs masculino y femenino, y entre VPs y URs cultivados con -/+T. Las figuras que se encuentran debajo de las autorradiografías muestran los % de abundancia relativa de los transcriptos, relativos al UGT de machos P0 (A) o a -T (B, C), calculados como un promedio de dos experimentos. (A) Comparación de la abundancia de los transcriptos de Shh y Ptc entre los UGTs masculino y femenino. (B) Comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre VPs P0 cultivados in vitro durante seis días con ningún medio medio de suplementación (-T), 8 M de testosterona (+T), o durante cinco días con 8 M de testosterona, seguidos por un tratamiento de un día con 7 M de acetato de ciproterona (+T +CA). (C) Comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre URs de P0 hembras, cultivado durante tres días sin medio de suplementación (-T) o con 8 M de testosterona (+T). La Figura 4 muestra el efecto de inhibición de la vía de señalización de SHH, mediante anticuerpos anti-shh, sobre el crecimiento de VP. Los VPs de P0 se cultivaron en un medio libre de suero durante cinco días en presencia o ausencia de 8 M de T y/o 0 µg ml 1 de anticuerpo anti-shh (E1). (A) Imágenes completas de VPs cultivados. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfico que muestra las áreas bidimensionales promedio de VPs cultivados, relativas a -T +/- s.e.m. La Figura muestra el efecto de la inhibición de la señalización de SHH mediante ciclopamina sobre VPs cultivados in Vitro. Los VPs de ratas P0 se cultivaron en medios libres de suero, durante seis días en presencia o ausencia de 8 M de T y/o 6 M de Cy. (A) Imágenes completas de los VPs al sexto día del cultivo. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfico que muestra las áreas bidimensionales promedio de los VPs cultivados, relativas a -T +/- s.e.m. (C) Gráfico que muestra el número medio de puntas de yemas epiteliales alrededor de la periferia de VPs cultivados, expresado como un cociente relativo al perímetro del órgano (yemas promedio por perímetro de 00 píxeles +/- s.e.m.). (D) Gráfico que muestra el porcentaje promedio de células proliferativas en yemas epiteliales +/- s.e.m. (Se visualizó la incorporación de Inset-BrdU mediante inmunohistoquímica (verde) y se localizó en el epitelio mediante inmunohistoquímica para la pan-citoqueratina (azul); los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo).). La Figura 6 muestra el efecto de la ciclopamina sobre la histología de los ductos epiteliales de la próstata. Las secciones de VPs, cultivadas durante seis días en presencia o ausencia de T y/o Cy se tiñeron con tricromo de Masson. (A, B) órganos cultivados con -T, (C, D) órganos cultivados con -T+Cy; la adición de Cy en ausencia de T no alteró la aparición de puntas de epitelio. (E, F) órganos cultivados con +T; la adición de T provocó la canalización de áreas de los conductos proximales a los UR (flechas). (G, H) órganos cultivados con +T +Cy; la adición de Cy en presencia de T provocó la canalización de los conductos prostáticos a través del órgano, y la aparición de múltiples lúmenes en los conductos alrededor de la periferia (flechas). Barras de escala, 0 µm. La Figura 7 muestra el efecto de Cy sobre la diferenciación de las células del epitelio prostático. Se tiñeron secciones de parafina conteniendo VPs, cultivados durante seis días en presencia o ausencia de T y Cy, con anti-p63 (A, C, E, G), o anticuerpos anti-citoqueratina 14 (B, D, F, H), para examinar la diferenciación epitelial. (A, B) VPs cultivados sin suplementación en el medio (-T) mostraron manchas de p63 (A) y citoqueratina 14 (CK14) (B) a través de las puntas del epitelio distal. La expresión de p63 (C) y CK 14 (D) fue similar en los VPs cultivados con -T +Cy (C, D) y en los VPs cultivados con -T (A, B). (E, F) VPs cultivados con +T contenían una mezcla de puntas de epitelio distal, donde la expresión de p63 (E) y CK 14 (F) estuvo confinada a la capa basal de células en todas las puntas. La expresión de CK 14 (H) se redujo de manera significativa en los VPs cultivados con -T +Cy. Barra de escala, 0 µm. La Figura 8 muestra la inmunotinción con p63 de la enfermedad prostática humana. Se tiñeron secciones de parafina que contenían biopsias de aguja de próstata humana con anti-p63 para visualizar las células del epitelio basal. (A) Conductos normales (asterisco) o ligeramente hiperplásicos, que muestran solo pequeñas discontinuidades de la capa basal. (B) Expansión de la capa basal de células (flecha) en hiperplasia epitelial benigna. (C) Hiperplasia cribiforme benigna con múltiples lúmenes (asteriscos), expansión focal de células basales y hendiduras localizadas. (D) PIN de grado elevado, con un patrón cribiforme mucho más compleja, expansión del tamaño del conducto y hendiduras regulares en la capa basal. El sarcoma invasivo adyacente (flecha) es p63-negativo. Barra de escala, 0 µm.

11 La Figura 9 muestra la inducción prostática en el UGT de ratones y ratas Shh null, cultivadas in Vitro con ciclopamina. (A) UGT completo de e17, de ratón macho Shh null, que muestra seno urogenital (UGS), vejiga (BL) y el intestino posterior (HG). UGS de e17, de ratón macho Shh null antes (B) y después (C), cultivado in vitro durante días; las flechas muestran las yemas prostáticas. UGS de e16, de rata macho cultivado in vitro durante 7 días, sin medio suplementado (D), +T (E) o +T +Cy (F); las flechas muestran las yemas prostáticas. Las barras de escala mostradas tienen 1 mm. La Figura muestra el efecto de la proteína SHH recombinante exógena sobre VPs cultivados in vitro. Los VPs de ratas P0 se cultivaron in vitro durante 3 días -/+ T -/+ SHH recombinante. (A) Imágenes completas de VPs en el tercer día del cultivo. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfica que muestra las áreas bidimensionales promedio de VPs relativas a -T +/- s.e.m. (C) Gráfico que muestra el número medio de yemas epiteliales alrededor de la periferia de VPs cultivados, expresado como cociente respecto al perímetro del órgano (yemas promedio por perímetro de 00 píxeles +/- s.e.m.). (D) Gráfico que muestra el porciento promedio de células proliferativas en las yemas del epitelio distal (a los 3 días) y el mesénquima que lo rodea (a los 2 días) +/- s.e.m. La Figura 11 muestra la estructura del AY9944, el triparanol, la jervina, al ciclopamina, la formatidina y el colesterol. La Figura 12 muestra la estructura del Compuesto A de WO 02/462. La Figura 13 muestra la estructura del Compuesto B de WO 02/462. Ejemplo 1 El hedgehog sónico regula el crecimiento de la próstata y la diferenciación epitelial Resumen 3 4 La vía de señalización de SONIC HEDGEHOG (SHH) media la señalización entre el epitelio y el mesénquima en varios tejidos, durante el desarrollo y la enfermedad. La organogénesis de la próstata depende tanto de los andrógenos como de la señalización epitelio-mesenquimal, y hemos investigado el papel de al señalización de SHH en el desarrollo de la próstata ventral (VP) de la rata. Nuestros datos sugieren que la señalización de SHH es importante para el crecimiento, la ramificación, y la mitogénesis de la VP y para la diferenciación del epitelio prostático. Hemos demostrado que la expresión de Shh y Ptc en la VP no está regulada por los andrógenos. La señalización de SHH se interrumpió mediante anticuerpos anti-shh o mediante ciclopamina, y ambos tratamientos inhibieron el crecimiento de la VP in vitro. La inhibición de la señalización de SHH provocó un incremento del número de puntas de conductos, y una reducción de la mitogénesis del epitelio de las puntas de los conductos. En presencia de testosterona, la disrupción de la señalización de SHH aceleró la canalización de los conductos del epitelio prostático, y provocó la ocurrencia de conductos que mostraban algunas similitudes con la neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Se examinó la diferenciación epitelial utilizando p63 y citoqueratina 14 (CK 14) como marcadores, que probaron la ocurrencia de una diferenciación precoz y aberrante de las células epiteliales de las puntas distales. En conclusión, mostramos que es necesaria la señalización de SHH para el crecimiento prostático, y que el crecimiento estimulado por andrógenos en ausencia de señalización de la vía de SHH provoca una diferenciación epitelial aberrante reminiscente del PIN. Materiales y Métodos Aislamiento de ARN 0 6 Se micro-disecaron tractos urogenitales (UGTs) enteros, VPs y URS tanto de ratas Wistar no singénicas, como de ratones Shh null, o sus contrapartes salvajes en un fondo CD 1 no singénico (Chiang et al (1996) Nature 383, 7-413), donde el día de la observación de la unión copulatoria se tomó como e0. y el día del nacimiento se designó P0. El ARN total se preparó como está descrito (Chomczynski y Sacchi, 1987). Ensayos de Protección a RNasa Se sintetizaron moldes de ADN para las ribosondas de Shh y Ptc mediante RT-PCR a partir del ADNc de UGT de P0 y se subclonaron en plásmidos pbluescript KSII+ (Stratagene, USA). Se diseñaron cebadores de PCR utilizando las secuencias de DANc publicadas en GenBank (Shh: No. de Acceso de GenBank NM_017221; Cebadores: L- ACCGCAGCAAGTATGGCA (ID SEC No 1), R-TCCAGGAAGGTGAGGAAG (ID SEC No 2); Ptc No. de Acceso de GenBank AF079162; Cebadores: L-GCATTGGCAGGAGGAGTTGATTGTG (ID SEC No 3), R-CCACTCGGAT GACACTGACA (ID SEC No 4)). Los moldes de AFN para las ribosondas de Ciclofilina (Cphn) y 28S procedían de Ambion, Inc., USA. Se transcribieron las ribosondas antisentido marcadas con 32 P, y se llevaron a cabo los ensayos de protección a la RNAsa como se describió en detalle anteriormente (Thomson et al., 1997). Los productos protegidos contra la RNasa obtenidos a partir de las ribosondas de Shh, Ptc, Cphn y 28S tenían 296 nucleótidos (nt), 322 nt, 3 nt y nt respectivamente. Se revelaron los geles utilizando un fósforoimagenólogo (Molecular Dynamics, USA) y se determinó la abundancia de transcriptos a partir de las intensidades de las bandas, calculadas utilizando ImageQuant V.1.2 (Molecular Dynamics, USA). Las abundancias de los transcriptos se normalizaron a los estándares internos de 11

12 Cphn o 28S (28S se utilizó como estándar interno en las muestras postnatales, ya que se encontró que la expresión de Cphn disminuía considerablemente con la edad). Hibridización In Situ Se llevó a cabo la hibridización in situ en secciones embebidas en parafina de 7 µm utilizando un procedimiento ligeramente modificado a partir de protocolos anteriormente descritos (Forman et al., 1990; Thomson y Cunha, 1999). Se sintetizaron ribosondas antisentido y sentido, control marcadas con 33 P, utilizando el mismo molde de ADN de Shh y el mismo método que para la protección de RNasa. Se sumergieron las láminas en emulsión G. (Ilford, UK) y se revelaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se examinaron utilizando microscopía de campo brillante y de campo oscuro. Cultivo de órganos Se llevó a cabo un cultivo de órganos libre de suero de VPs de rata Wistar P0, como se describió anteriormente (Sugimura et al., 1996). Se suplementó el medio de cultivo con 8 M de testosterona y/o 1 µm, µm, o µm de ciclopamina, o 0 µg ml 1 de anticuerpo anti-shh (clon E1, Developmental Studies Hybridoma Bank, University de Iowa, o 0.2 µg/ml de proteína SHH recombinante (Research Diagnostics, USA)). Se determinó el área bidimensional y el perímetro de los órganos a partir de imágenes capturadas en vivo utilizando el software de imágenes del NIH. Histología e Inmunohistoquímica Se examinó la histología de secciones mediante tinción por tricromo (Masson, 1929), o mediante tinción inmunohistoquímica. Para la tinción con CK14 y p63, con detección por diaminobenzamide (DAB), se cocinaron a presión las secciones, en mm de ácido cítrico, a ph 6.0 durante 2 minutos, antes de seguir un protocolo publicado con anterioridad (Thomson et al., 02). El anticuerpo anti-ck14 se diluyó 1:0 y el anticuerpo anti-p63 (Santa Cruz Biotechnologies Inc., USA) se diluyó 1:00. Se llevó a cabo la localización inmunohistoquímica de BrdU y pancitoqueratina como se ha descrito con anterioridad (Thomson et al., 02), utilizando una dilución1:0 del anticuerpo anti-brdu (Fitzgerald Industries Internacional Inc., USA) y una dilución 1:0 del anticuerpo anti-pancitoqueratina (Sigma, UK). Se detectó BrdU mediante Alexofluor 488 (Molecular Probes Inc., USA) y se detectó la pancitoqueratina con Cy (Amersham Biosciences, UK). Se calcularon los índices mitóticos mediante el conteo del número de células epiteliales positivas para pancitoqueratina que eran también positivas para BrdU. Resultados Distribución del UNAM de Shh en el UGT masculino Se localizaron los transcriptos de Shh en el epitelio uretral (URE), y los epitelios de la próstata ventral en desarrollo (VPE), la próstata dorsal (DPE) y la próstata dorsolateral (DLPE) de UGTs de machos P0, mediante hibridización in situ (Fig. 1.). No se observaron los transcriptos de Shh en el estroma del UGT. No se observó ninguna señal usando una ribosonda sentido control (datos no mostrados). Se examinaron los patrones de expresión temporal de los ARNm de Shh y Ptc, mediante el ensayo de protección de RNasa (Fig. 2). Los trancriptos de Shh y Ptc eran más abundantes a e18, en el UGT de machos (Fig. 2A). Los niveles de los transcritos fueron bajos entre e19. y e21., pero se elevaron a P0. Los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc fueron más elevados en el VP que en el UGT a P0, lo que puede haberse debido a variación en las proporciones de epitelio en estos tejidos. No pudo practicarse el análisis de los transcriptos de Shh y Ptc en el VP antes de P0 debido a dificultades en la microdisección de VP, ya que el rudimento del órgano es pequeño y difícil de separar del UR. En la VP postnatal los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc decrecieron al incrementarse la edad (Fig. 2B). Los ARNm de Shh y Ptc fueron más abundantes a P0 y P2, pero a la altura de P6, dichos niveles eran cuatro veces menores que en P0. Los transcriptos de Shh y Ptc eran casi indetectables a P, cuando el crecimiento de la VP se desacelera rápidamente, y están ausentes en adultos. Una comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre la VP y la UR de ratas macho postnatales mostraron que los transcriptos eran más abundantes en la VP que en la UR de P0 a P2, pero que a la altura de P4 esta situación se había revertido (Fig. 2C). A diferencia de lo que sucede en la VP, la expresión en la UR se mantuvo más allá de P, separando las vías de desarrollo de estas estructuras. La expresión del ARNm de Shh no está regulada por andrógeno en la VP Dado que el desarrollo de la próstata solo ocurre en los machos, y se ha reportado regulación positiva específica para los machos del ARNm de Shh en el UGS de ratón (Podlasek et al., 1999), se compararon los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre los UGTs de ratas machos y hembras (Fig. 3A). El análisis de RPA mostró que la expresión de ARNm de Shh y Ptc era aproximadamente dos y media veces mayor en las hembras que en los machos a e17., mientras que a P0 y P6, los niveles de los transcriptos eran similares en ambos sexos. A P, la expresión de los transcriptos de Shh y Ptc era mínima en los machos, pero se mantenía aun en las hembras. 12

13 Los RPAs se llevaron a cabo para analizar los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc en las VPs y los URs cultivados in Vitro. Las VPs se cultivaron durante seis días, en presencia o ausencia de T; o durante cinco días con T, seguidos por un tratamiento de un día con el antagonista de AR acetato de cipropterona (Fig. 3B). No se observaron diferencias significativas en la abundancia de transcripto para Shh ni para Ptc. De manera similar, en lo cultivos de corto plazo de VPs (durante siete horas o tres días) no se observaron cambios en los niveles de transcriptos (datos no mostrados). El análisis de los niveles de transcriptos en los URs microdisecados a partir de UGTs femeninos, cultivados durante tres días en presencia o ausencia de T, mostraron un incremento de dos veces y media en los niveles de los transcriptos de Shh (Fig. 3C), aunque no se observaron cambios significativos en los niveles de los transcriptos de Ptc. La inhibición de la señalización de SHH reduce el crecimiento de la VP Se cultivaron VPs P0 in Vitro durante cinco días en presencia (+) o ausencia (-) de T y con (+) o sin (-) 0 µg ml 1 de anticuerpo anti-shh (E1) (Fig. 4A), después de lo cual se midieron sus áreas bidimensionales (Fig. 4B). La adición de E1 a los cultivos redujo el crecimiento de la VP en %, tanto en -T, como en +T (o con un control de IgG no específico, datos no mostrados). Estos datos proporcionan evidencias que apuntan a un rol directo de la señalización de SHH en el crecimiento de la VP, y demuestra que es probable que la señalización a través de PTC/SMO dependa de SHH como ligando (en la VP). Dado que resultaba poco práctico obtener grandes cantidades del anticuerpo E1, un estudio más abarcador de la señalización por SHH en el crecimiento de la VP se llevó a cabo utilizando el alcaloide esteroideo ciclopamina (Cy), que bloquea la señalización a través de PTC/SMO (Incardona et al., 1998). Las VPs P0 se cultivaron durante seis días -/+T, y -/+Cy (Fig. A), y se midieron sus áreas bidimensionales (total de 0 VPs de cada uno de los cuatro grupos de tratamiento, y 21 experimentos independientes) (Fig. B). Los experimentos de respuesta a la dosis mostraron que al concentración óptima de Cy para la inhibición del crecimiento era 1 µm. Los cultivos llevados a cabo utilizando 0,1 µm de Cy mostraron poco o ningún efecto, mientras que µm de Cy, aparentemente resultaba tóxico, provocando una muerte prematura de los órganos (datos no mostrados). La disrupción de la señalización por SHH con Cy inhibió de manera significativa el crecimiento de la VP en presencia y ausencia de T. La adición de Cy a órganos cultivados con -T provocó una reducción del crecimiento de 16% (-T vs. -T+Cy; t de Student, P = 3,0e 14 ), y Cy redujo el crecimiento de las VPs cultivadas con +T en un 27% (+T vs. +T+Cy; t de Student, P = 1,4e 34 ). Por tanto, al usar ciclopamina, la inhibición de la señalización por SHH tuvo un efecto mayor sobre la VP cultivada en presencia de T. Tanto el anticuerpo E1 anti-shh, como Cy causaron una reducción de 0% en el crecimiento inducido por T en las VPs. Señalización por SHH y crecimiento epitelial Decidimos llevar a cabo el análisis del efecto de Cy sobre los epitelios prostáticos de VPs cultivadas in vitro. Se contaron las puntas de las yemas epiteliales situados en la periferia de las VPs (total de VPs de cada uno de cuatro grupos de tratamiento y 16 experimentos independientes) y se expresaron como el cociente con respecto al perímetro del órgano, para tomar en cuenta los cambios en el tamaño del órgano después de los tratamientos (Fig. C). La adición de Cy a los órganos cultivados con -T provocó un incremento significativo en el número de puntas periféricas por unidad de perímetro (-T =,16 +/- 0,97 puntas de yemas promedio por unidad de perímetro, contra -T+Cy = 74,47 +/- 1,07; t de Student, P = 1,31e 17 ). El incremento en el número de puntas observadas en -T+Cy fue similar al observado solo con +T (+T = 71,8 +/- 0,83), sin embargo, la adición tanto de T como de Cy a los cultivos no tuvo un efecto aditivo sobre en número de puntas periféricas (+T+Cy = 69,84 +/- 1,13). Es posible que el número de puntas inducidas por T o por Cy fuera el máximo para el sistema in vitro, por tanto, los efectos aditivos pueden no resultar evidentes debido a las limitaciones del sistema. La adición de Cy a los órganos cultivados con +T redujo de modo ligero el número de puntas periféricas, en comparación con las VP cultivadas solo en +T. Sin embargo, dicha reducción mostró baja significación estadística (t de Student, P = 0,08). Un incremento en el número de puntas periféricas se observó también en las VPs cultivadas con el anticuerpo anti-shh (E1) en ausencia de T (-T = 62,13 +/- 0,82 vs. -T +E1 = 93,03 +/- 1,08), con un número similar de puntas periféricas observado entre las VPs cultivadas con +T y las cultivadas con +T+E1 (+T = 74,32 +/- 0,69 vs. +T+E1 = 79,21 +/- 1,28). Se utilizó la incorporación de BrdU para identificar la proliferación de células epiteliales en VPs cultivadas con -/+T y -/+Cy, y para calcular un índice mitótico (Fig. D). Se añadió BrdU a las VPs (cuatro experimentos, nueve organismos en cada grupo de tratamiento) al sexto día del cultivo, y se visualizó su incorporación mediante inmunohistoquímica. Se confirmó la localización de BrdU en el epitelio mediante inmunohistoquímica para pancitoqueratina (Fig. D, interior). El porcentaje de células proliferativas se obtuvo a partir de tres imágenes de las puntas periféricas de los órganos (distal), y tres imágenes de los conductos más cercanos a la uretra (proximal), totalizando 27 conteos distales y proximales para cada grupo de tratamiento. Se observó una reducción significativa en la proliferación en las puntas epiteliales distales de los órganos cultivados con +Cy, tanto -T como +T (-T = 18,92% +/- 1,48% de núcleos mitóticos, vs. -T+Cy = 13,48% +/- 0,93%, t de Student, P = 0,002; +T = 23,24% +/- 1,86% vs. +T+Cy = 16,28% +/- 0,74%, t de Student, P = 0,000). No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de células proliferativas en los conductos proximales a la UR en respuesta a Cy (datos no mostrados). También se demostró que aunque T incrementó la proliferación de las puntas distales, se redujo la proliferación en los conductos proximales. Concluimos que la inhibición de la señalización por SHH reduce la velocidad de la proliferación de las células epiteliales en las puntas de crecimiento de la VP. Por tanto, el número incrementado de puntas distales que se observa en el grupo que recibió el tratamiento -T+Cy no se debió a una proliferación incrementada de las células epiteliales, sin, con mayor probabilidad, a un aumento de la ramificación. 13

14 La inhibición de la señalización por SHH afecta la canalización y al diferenciación de los conductos epiteliales prostáticos Los conductos prostáticos crecen, al comienzo, como cuerdas sólidas, que luego canalizan, dando como resultado conductos que contienen lúmenes. La canalización ocurre en una dirección de proximal a distal (o sea, de la UR hacia afuera), y puede ser el resultado de la diferenciación de las células epiteliales (Hayward et al., 1996). Después del crecimiento in Vitro, los lúmenes se encontrarían normalmente presentes en los conductos proximales a la UR (Fig. 6E), pero no en las puntas distales. Se observaron lúmenes en los conductos proximales de las VPs en todos los grupos de tratamiento, pero las VPs cultivadas con +T+Cy también presentaban lúmenes en las puntas distales (Fig. 6G,H). También se observó que la morfología de los conductos no era normal en las VPs cultivadas con +T+Cy. Los conductos prostáticos normales en las ratas constan de células luminales secretoras con células basales subyacentes, formando un lumen único. La arquitectura de los conductos periféricos de las VPs cultivadas con +T+Cy era más compleja, con entrecruzamientos epiteliales que producían la apariencia de múltiples lúmenes y algunas expansiones en el conducto. Esta apariencia cribiforme solo se encontraba presente de manera focal en las VPs de los otros grupos de tratamiento. Las células epiteliales indiferenciadas de la próstata en las puntas de crecimiento expresan de manera uniforme la citoqueratina 14 (CK14) (Hayward et al., 1996) y la p63 (Parsons et al., 01; Wang et al., 00). A medida que las células epiteliales se diferencian la expresión de CK14 (Hayward et al., 1996) y p63 (Parsons et al., 01; Wang et al., 00) queda confinada a la capa basal de células. Investigamos la localización de CK14 y p63 en VPs cultivadas in vitro con -/+T y -/+Cy (Fig. 7). La expresión de p63 era abundante en el tejido epitelial de las puntas distales de los órganos cultivados con -T (Fig. 7A), con -T+Cy (Fig. 7C) y con +T (Fig. 7E). La mayoría de las puntas epiteliales distales en estos órganos mostraron una tinción uniforme para p63, característica del estado indiferenciado, en tanto que en otras hubo un incremento en el número de células p63 positivas hacia la membrana inferior. En contraste, en las VPs cultivadas con +T+Cy, la expresión de p63 estaba confinada a la capa basal de células de todas las puntas distales (Fig. 7G). La expresión de p63 estaba localizada en la capa basal de células epiteliales en los conductos proximales de las VPs de todos los grupos de tratamiento La expresión de CK14 mostró similitudes con la de p63, aunque aparecieron menos células basales CK14 positivas que p63 positivas. La mayoría de las puntas distales de las VPs cultivadas en -T (Fig. 7B) y -T+Cy (Fig. 7D) expresaron ampliamente CK14, al igual que las células epiteliales indiferenciadas. Se observaron puntas distales tanto con expresión uniforme de CK14 como con una capa definida de células basales que expresaban CK14 en las VPs cultivadas con +T (Fig. 7F). Las VPs cultivadas con +T+Cy mostraron muy pocas células CK14 positivas en las puntas distales (Fig. 7H), en contraste con la abundancia relativa de células p63 positivas. La expresión de CK14 estuvo confinada a la capa basal de células en los conductos proximales de las VPs de todos los grupos de tratamientos. Se tiñeron biopsias de aguja de próstatas humanas con una variedad de lesiones benignas, premalignas y malignas, con anticuerpos anti-p63 para comparar con nuestras VPs cultivadas (Fig. 8). Los conductos prostáticos humanos normales tenían una única capa de células basales p63 positivas y células luminales p63 negativas, que formaban un único lumen (Fig. 8A). La tinción anti-p63 mostró una expansión del compartimiento de las células basales en la hiperplasia epitelial benigna (Fig. 8B). Los conductos prostáticos humanos que mostraban evidencias de una PIN de alto grado presentaban una única capa discontinua de células basales p63 positivas. Las células luminales del conducto formaban un patrón complejo, cribiforme de entrecruzamiento epitelial que daba la apariencia de múltiples lúmenes, y expandía el conducto (Fig. 8C). No había células basales p-63 positivas en el adenocarcinoma invasivo (Fig. 8D). Se notaron similitudes entre la morfología de las VPs cultivadas en +T+Cy (Fig. 7G) y la PIN humana de alto grado (Fig. SC). No se requiere la señalización de HH para la inducción prostática. Se microdisecaron los UGTs de ratones Shh null e17,; los UGTs de ratones Shh null eran más pequeñas que las de sus contrapartes de tipo salvaje (no mostrado), y el intestino posterior era continuo con la vejiga (Fig. 9A). Dado que la próstata no se encontraba bien desarrollada en los machos mutantes (Fig. 9B) ni en los de tipo salvaje en este período, se cultivaron explantes de UGS tanto de ratones Shh null como de sus contrapartes, in vitro para determinar si se podía inducir la gemación prostática (n = 3). Se presentaron las yemas prostáticas al cabo de 3 días y aparecieron aumentadas después de días tanto en los explantes provenientes de Shh null, como en los de sus contrapartes (no mostrado). El Indian hedgehog (Ihh) se expresa en la VP a niveles mucho más bajos que Shh, mediante RT-PCR (datos no mostrados) y resultaba posible que un incremento de Ihh (u otro miembro de la familia Hh) pudiese haber compensado la ausencia de SHH en los explantes de UGT de ratones Shh null. Por tanto, se cultivaron in vitro explantes de UGS de ratas e16, durante 7 días -/+T y con -/+ 1 µm, µm o µm de ciclopamina (Cy) (n = 4), que bloquea la vía de señalización a través de Smoothened y, por tanto, a todos los ligandos de la familia Hh (Chen et al (02) Genes Dev 16, ; Incardona et al (1998) Development 1, ). No se observaron yemas prostáticas en los explantes cultivados en -T (Fig. 9D); los buds prostáticos estaban presentes en explantes cultivados con +T (Fig. 9E) y con +T+1 µm de Cy (Fig. 9F) a niveles similares. También estaban presentes yemas prostáticas en explantes cultivados con +T + µm Cy y con +T + µm Cy (datos no mostrados), aunque estas concentraciones de Cy eran tóxicas y provocaban la muerte prematura de los órganos. Efecto del SHH exógeno sobre el crecimiento y la ramificación de la VP. Se examinaron los efectos de añadir SHH recombinante a VPs cultivadas in vitro (Fig. ). Se cultivaron VPs durante 3 días con -/+T y -/+ proteína SHH 14

15 recombinante (n = 6). La adición de SHH a los cultivos provocó la expansión del mesénquima alrededor de la periferia de las VPs, tanto -T, como +T (Fig. A). La medición del área bidimensional de las VPs cultivadas (n = 6, 14 VPs de cada grupo de tratamiento) mostró que la adición de SHH provocó una ligera reducción en el crecimiento general de la VP, tanto en -T, como en +T, que mostró baja significación estadística (-T vs. -T+SHH % área = 0 +/- 3,6 vs. 90,12 -/+,26, t de Student, P=0,07; +T vs. +T+SHH % área = 127,0 +/-,12 vs. 123,03 +/- 6,7, t de Student, P = 0,32) (Fig. B). Se contó el número de puntas de yemas periféricas de las VPs cultivadas, y se expresó como un cociente con respecto al perímetro (Fig C). La adición de SHH a los cultivos redujo de manera significativa el número de puntas de yemas periféricas, tanto en -T, como en +T, teniendo, por tanto, un efecto opuesto a la inhibición de la señalización de HH con Cy (-T vs. -T+SHH promedio de puntas de yemas por perímetro de 00 píxeles = 68,6 +/- 2,62 vs 48,09 +/- 3,3, t de Student, P = 3,13e ; +T vs. +T+SHH = 83,92 +/- 2, vs. 68,34 +/- 2,7, t de Student, P =,37e ). Se calculó el índice proliferativo de los compartimientos celulares del epitelio y el mesénquima para las VPs cultivadas con -/+T y con -/+SHH después de la adición de BrdU (Fig. D). Se calculó el índice de marcado epitelial el tercer día del cultivo, mientras que el índice de marcado mesenquimal se calculó el segundo día del cultivo, dado que nuestros datos indicaban que los efectos sobre la proliferación del mesénquima eran más pronunciados el día 2 en comparación con el día 3. En las VPs cultivadas con -T, el SHH redujo la proliferación celular epitelial en un tercio (-T vs. -T+SHH % de núcleo proliferativos = 27,9% +/- 1,% vs. 18,62% +/- 2,06%, t de Student, P = 1,84e 4 ), pero solo en un 6% en las VPs cultivadas en +T, lo que no resultó estadísticamente significativo (+T vs. +T+SHH % de núcleos proliferativos = 32,4% +/- 1,6% vs.,46% +/- 1,72%, t de Student, P = 0,19). En el mesénquima, el SHH estimuló la proliferación en presencia o ausencia de T (-T vs. -T+SHH % de núcleos proliefrativos = 14,96% +/- 0,89% vs. 19,4% +/- 1,12%, t de Student, P = 0,002; +T vs. +T+SHH % de núcleos proliferativos = 17,1% +/- 1,22% vs.,47% +/- 1,07%, t de Student, P = 0,06). Discusión Hemos demostrado aquí que la señalización de SHH regula el crecimiento de la próstata, el epitelio prostático y la diferenciación epitelial. La inhibición de la señalización por SHH retardó el crecimiento de las VPs cultivadas in vitro, y redujo la mitogénesis, e incrementó el número de puntas de conductos en los epitelios prostáticos en crecimiento. En presencia de T, la inhibición de la señalización por SHH produjo diferenciación aberrante en los epitelios prostáticos. Proponemos que la señalización por SHH es un regulador esencial de las interacciones epitelio-mesénquima en la próstata. Las interacciones recíprocas epitelio-mesénquima desempeñan un rol esencial en el direccionamiento del crecimiento de la próstata durante el desarrollo y la enfermedad (Cunha y Chung, 1981; Gao et al., 01; Olumi et al., 1999). Bajo condiciones de desarrollo normales, el crecimiento epitelial es controlado mediante la señalización regulada por andrógeno proveniente del mesénquima (Cunha y Chung, 1981), aunque el mecanismo exacto de esto permanece oscuro. Este control paracrino del crecimiento epitelial se mantiene en la próstata adulta normal, aunque en el cáncer de próstata aparentemente el control androgénico del epitelio es autocrino (Gao et al., 01). Por el contrario, la señalización paracrina del epitelio determina el patrón de diferenciación estromal durante el desarrollo de la próstata, y mantiene el mesénquima/estroma en la próstata adulta normal (Cunha et al., 1996; Hayward et al., 1998). Se propone como hipótesis, que los carcinomas de próstata poseen señalización paracrina alterada desde el epitelio, dado que las células epiteliales parecen incapaces de inducir/mantener la diferenciación del mesénquima/estroma (Cunha et al., 1996). Hasta el momento, las vías de señalización identificadas para regular las interacciones epitelio-mesénquima en el crecimiento prostático, no son específicas de la próstata. La vía de señalización de SHH regula las relaciones epiteliomesénquima durante el desarrollo de muchos órganos. En el UGT de los ratones, la Shh se expresa en el epitelio del UGS (Bitgood y McMahon, 199; Podlasek et al., 1999) y es esencial para la formación de los genitales externos (Haraguchi et al., 01; Perriton et al., 02). También se ha demostrado que la inhibición de la señalización de SHH mediante el bloqueo por anticuerpos abroga la morfogénesis de las ramificaciones de la próstata (Podlasek et al., 1999). El patrón de expresión espacial y temporal de Shh en el UGT de ratas machos sugería un rol para Shh en el crecimiento y desarrollo de la VP. Los transcriptos de Shh se localizaron en el epitelio uretral y en las yemas epiteliales de los lóbulos prostáticos en desarrollo de machos P0, en concordancia con estudios anteriores de la distribución de transcriptos de Shh (Bitgood y McMahon, 199; Podlasek et al., 1999). Los RPAs mostraron que los transcriptos de Shh y Ptc eran más abundantes en e18,, en correlación con el sobrecrecimiento visible del epitelio uretral hacia la almohadilla mesenquimal ventral (VMP), que define el comienzo del desarrollo de la VP. Los niveles de transcriptos de Shh y Ptc eran nuevamente elevados a P0, asociados al aumento del crecimiento y la ramificación de la VP que ocurre en el período neonatal. Se encontró que el patrón de expresión temporal de Shh y Ptc en el UGT de machos reflejaba el de Bmp4. Bmp4, un posible efector downstream de la señalización de Shh (Bitgood y McMahon, 199) se expresa en el mesénquima que rodea las yemas epiteliales de la próstata (Lanun et al., 01). Se ha demostrado la coexpresión de Shh y Bmp4 en varios sitios de interacción epitelio mesénquima, incluyendo el UGS (Bitgood y McMahon, 199). En la VP perinatal, se observaron elevados niveles de transcriptos de Shh y Ptc en el período de crecimiento y ramificación neonatal temprano. Estos niveles decaían después de P6, de manera que los transcriptos se hacían prácticamente indetectables hacia P, cuando el crecimiento de la VP se desacelera significativamente hasta

16 alcanzar la quiescencia en la adultez (Sugimura et al., 1986). El patrón de expresión temporal de Shh y Ptc en la VP se correlaciona con el de Fgf, que se expresa en el mesénquima alrededor de los buds epiteliales en crecimiento (Thomson y Cunha, 1999) Se compararon los niveles de los transcriptos de Shh y Ptc entre la VP y la UR de machos postnatales. Mientras los niveles de los transcriptos decrecieron en la VP a medida que se aproximaba la adultez, la expresión de UR se mantuvo a niveles similares a todo lo largo del desarrollo. Por tanto, las vías del desarrollo de la VP y la UR aparentemente son separadas. Estos datos sugieren que la señalización de SHH es necesaria para el crecimiento y la ramificación de la VP, y proponemos que puede ser necesaria la señalización de SHH mantenida para el continuado elongamiento de la UR en la adultez, o para la formación de las glándulas uretrales. Nuestros datos sugieren también que los altos niveles de trasncriptos de Shh reportados en el UGS de ratones macho postnatales (Podlasek et al., 1999) puede haberse originado en la UR. Las comparaciones de los niveles de transcriptos entre el UGT masculino y femenino demostraron que en este último existen niveles dos y media veces superiores de los ARNm de Shh y Ptc que en el primero, a e17,. Los niveles de los transcriptos fueron similares a P0 y P6, pero a P había significativamente más transcriptos de Shh y Ptc en la hembra que en el macho. El nivel elevado de los transcriptos en las hembras P con respecto a los machos puede ser el reflejo de las diferencias anatómicas en nuestra definición del UGT. Aquí, definimos el UGT femenino como UGS (o sea, UR) solamente, y el UGT masculino, como UGS más lóbulos prostáticos y SVs acompañantes. Por tanto, nuestras muestras de ARN de UGTs femeninos contienen una proporción superior de ARN uretral que nuestras muestras de ARN de los UGTs masculinos. Dado que la UR mantiene la expresión de los ARNm de Shh y Ptc hasta al menos P (Fig. 2C), los niveles más elevados de transcriptos de Shh y Ptc en una muestra de UGT femenino podrían deberse a una proporción relativa superior de ARN uretral. Se encontró que nuestros datos contradecían los de Podlasek et al (1999) que reportaron una expresión siete veces superior de Shh en el UGS masculino que el femenino de ratones e19 (Podlasek et al., 1999). La inclusión de la vagina en desarrollo dentro del UGT, con la consiguiente dilución de la abundancia de los transcriptos de Shh en la muestras de ARN femenino, en el estudio de Podlasek et al (1999), podría explicar estas discrepancias. Para determinar si la señalización de SHH era regulada por andrógenos en la VP, se compararon los niveles de transcriptos de Shh y Ptc entre VPs cultivadas in vitro durante seis días en -/+T, o durante cinco días en +T seguido por un día con el antagonista de AR, acetato de ciproterona. No se observó ninguna diferencia significativa en los niveles de los transcriptos en este período de tiempo, o entre órganos tratados con -/+T durante siete horas o tres días (datos no mostrados). Esto indicó que es poco probable que la expresión de ARNm de Shh y Ptc dependa de los andrógenos en la VP. En un estudio anterior demostramos que FGF también actúa de manera independiente de la acción del andrógeno en el crecimiento de la VP (Thomson y Cunha, 1999). Esto sugiere que, mientras que se conoce que el desarrollo de la próstata depende de los andrógenos, el mecanismo puede ser indirecto sobre algunas vías de señalización. Recientemente hemos demostrado que las interacciones epitelio-mesénquima durante la inducción prostática pueden ser reguladas por andrógenos que controlan la diferenciación de la capa de musculatura lisa (Thomson et al., 02). Podlasek et al., reportaron un incremento de cinco veces en los transcriptos de Shh en explantes de UGS de ratones macho e, cultivados durante tres días con dihidrotestosterona. Esto podría ser específico para el UGS, dado que la expresión del receptor de andrógeno (AR) no aparece en las yemas epiteliales prostáticas hasta el nacimiento (Hayward et al., 1996). En concordancia con esto, reportamos un incremento de dos veces y media de los transcriptos de Shh en respuesta a T en las URs de los UGTs femeninos. Esto no era igualado por el incremento de Ptc, lo que ponía en entredicho el significado funcional de la observación. Se ha observado que los ratones Shh null no expresan Nkx3.1 en el UGS (Schneider et al., 00). Mkx3.1 es el marcador más temprano conocido del epitelio prostático prospectivo, y se expresa exclusivamente en el UGS masculino, en regiones en las que aparecen las yemas prostáticas a partir de los UGS (Bathia-Gaur et al., 1999). No se requiere Nkx3.1 para la inducción prostática, dado que mutantes Nkx3.1 null aun tienen próstata (Bathia-Gaur et al., 1999; Schneider et al., 00), pero se requiere su expresión para la diferenciación del epitelio durante el desarrollo, y el correcto funcionamiento de la próstata durante la adultez (Bathia-Gaur et al., 1999). Dado que Nkx3.1 solo se expresa en el UGT masculino, resulta probable que sea regulado por andrógeno, y dado que la expresión ocurre antes de que aparezca el AR funcional en el epitelio, es probable que esta regulación por andrógeno sea mediada a través del mesénquima (Bathia-Gaur et al., 1999). La literatura actual quisiere que los andrógenos incrementan la expresión de Shh en los machos (Podlasek et al., 1999), lo que a su vez induce la expresión de Nkx3.1. Dado que encontramos transcriptos de Shh tanto en el UGS masculino como femenino, y que no existe un incremento específico de la expresión de Shh, proponemos que Shh es un factor más bien permisivo que inductivo, para la expresión de Nkx3.1 en el UGS masculino. Se demostró que SHH posee en rol en el crecimiento y desarrollo de la VP, mediante la inhibición de la vía de señalización de SHH. El bloqueo de la señalización de SHH utilizando tanto anticuerpos anti-shh como Cy provocó una reducción del crecimiento de las VPs. La reducción del crecimiento resultado del bloqueo por anticuerpos confirmó que, durante el crecimiento y desarrollo de la VP, la señalización a través de PTC/SMO depende de SHH como ligando. Se observaron en la VP los transcriptos de Ihh, pero no los de Dhh, mediante RT-PCR, pero los niveles de Ihh eran muy inferiores a los de Shh (datos no mostrados). Se ha demostrado que SHH es un péptido más potente que IHH (Pathi et al., 01), y proponemos que SHH es el regulador principal de la señalización a través de PTC/SMO en la VP. Nuestros resultados coinciden con experimentos que muestran que la implantación de una cuenta en el inicio 16

17 prostático del UGS de ratones e, injertado debajo de la cápsula renal de un receptor masculino, abrogó el crecimiento y desarrollo de la próstata (Podlasek et al., 1999) La inhibición de la señalización de SHH incrementó el número de puntas de buds epiteliales alrededor de la periferia de las VPs a pesar de la reducción de la proliferación de las células epiteliales, lo que sugiere que el incremento se debió al incremento de la ramificación. En explantes de pulmón libres de mesénquima, no se requiere el incremento de la proliferación de las células epiteliales para la ramificación, pero sí se requiere para al elongación (Nogawa et al., 1998). Si los efectos mitogénicos de SHH tanto sobre el epitelio como sobre el mesénquima de pulmón (Bellusci et al., 1997b) operan también en la próstata, la señalización a través de SHH puede actuar para promover la mitogénesis e inhibir la ramificación, lo que permitiría la elongación de las puntas de las yemas epiteliales. Se ha observado también un incremento significativo del número de puntas de conductos y puntos de ramificación en las VPs de ratones Bmp4 haploinsuficientes (Lamm et al., 01). Se postula que Bmp4 inhibe la ramificación lateral, permitiendo de esa manera la elongación de los conductos del epitelio prostático (Lamm et al., 01). Shh y Bmp4 se encuentran coespresados en diferentes sitios de la interacción epitelio-mesénquima durante el desarrollo (Bitgood y McMahon, 199), y se ha demostrado que Shh puede modular la expresión de Bmp4 (Haraguchi et al., 01). Sugerimos que Shh puede operar upstream de Bmp4 en una vía que inhibe la formación de ramificaciones en la próstata. Los conductos epiteliales prostáticos inicialmente crecen como cuerdas sólidas que luego sufren canalización. La canalización comienza en el extremo uretral del conducto prostático (proximal) y continúa hacia la porción distal del conducto (Hayward et al., 1996). Observamos que la canalización había ocurrido en las puntas distales de las VPs cultivadas en +T+Cy, mientras que en las VPs cultivadas en -T, -T+Cy y +T, al canalización solo era evidente en los conductos proximales, siendo esta más avanzada en las VPs cultivadas en +T. Esto sugería que en presencia de T, la inhibición de la señalización de SHH aceleraba la canalización, pero que la disrupción de la señalización de SHH por sí solo no era suficiente. Proponemos que la señalización de SHH inhibe la canalización de los conductos epiteliales prostáticos in vivo, y, de esa manera, desempeña un papel opuesto a la T, que promueve la canalización (Hayward et al., 1996). La morfología de las puntas distales de las VPs cultivadas en +T+Cy era compleja, con un patrón cribiforme bien desarrollado, y múltiples lúmenes. En la enfermedad humana, este patrón cribiforme puede observarse en las formas severas de las hiperplasias epiteliales benignas y en la PIN de alto grado, el precursor del carcinoma invasivo. Una de las características usadas en el diagnóstico diferencial es la presencia de núcleos normales en la hiperplasia, que contrasta con los núcleos agrandados, variables, con nucléolos visibles en la PIN. Sin embargo, las últimas características también se ven en modelos de desarrollo de próstata y fueron una característica consistente en todos nuestros experimentos. Otra característica de la hiperplasia significativa de las células luminales es que frecuentemente va acompañada por una expansión correspondiente del compartimiento basal (Epstein, 1992), lo que puede demostrarse bien mediante inmunotinción por p63 (Fig. 8B). Por otro lado, en lesiones de PIN existe por lo general una única capa de células basales, frecuentemente, con grandes brechas (Fig. 8C), como en nuestras VPs cultivadas en +T+Cy (Fig. 7G). Por último, la hiperplasia epitelial benigna, no conduce, por regla general, a una expansión del conducto, a diferencia de lo que sucede en la PIN cribiforme (Fig. 8C) y en nuestras VPs cultivadas en +T+Cy (Fig. 7G). Estas observaciones sugieren que los epitelios prostáticos de nuestras VPs, cultivadas in vitro en +T+Cy recapitulan algunas de las características de la PIN. Existe una clara relación espacial y temporal entre la canalización de los conductos prostáticos y la diferenciación de las células epiteliales (Hayward et al., 1996). La diferenciación de las células epiteliales de los conductos prostáticos inmaduros en las células luminales y basales que se encuentran en los conductos maduros está marcada por cambios en la expresión de CK y p63 (Hayward et al., 1996; Wang et al., 00). Las células epiteliales prostáticas indiferenciadas expresan de manera uniforme CK, CK8, CK14, CK18 y p63. Las células basales mantienen la expresión de CK y CK14 y p63, y pierden la expresión de CK8 y CK18, mientras que las células luminales mantienen la expresión de CK8 y CK18, y pierden la expresión de CK, CK14 y p63 (Hayward et al., 1996; Wang et al., 00). La inmunohistoquímica de p63 mostró que las células epiteliales de todas las puntas distales de las VPs cultivadas en +T+Cy habían sufrido diferenciación. En las VPs de todos los demás grupos de tratamientos se presentaba una mezcla de puntas distales, que contenían células epiteliales indiferenciadas o células basales diferenciadas. Esto sugirió que la inhibición de la señalización de SHH en presencia de T aceleraba la diferenciación de las células epiteliales. El patrón de expresión de CK14 era similar al de p63, con la excepción de que la mayoría de las células en las puntas distales de VPs cultivadas en +T+Cy no expresaban CK14, aunque las que sí lo hacían eran más basales, lo que resultaba un indicador de diferenciación. La ausencia de una capa completa de células basales Ck14 positivas está bien reconocida en la próstata humana, donde están bien descritas variaciones en la expresión de subtipos de queratina (Abrahams et al., 02; Freeman et al., 02). Se desconoce la significación funcional de estas variaciones en el perfil de queratina. No obstante, por lo general se ven menos células CK positivas en la PIn que en las glándulas normales ((Bostwick y Brawer, 1987), observación personal, P. H.), y la escasez relativa de las células CK14 positivas en las VPs cultivadas en +T+Cy nuevamente, resulta reminiscente de la PIN. La pérdida completa de las células basales se considera, desde hace mucho tiempo, como una característica intrínseca del adenocarcinoma prostático (Totten et al., 193). Esta es una de las características clave explotada por los patólogos dedicados al diagnóstico para diferenciar las lesiones atípicas, pero benignas del adenocarcinoma prostático, ya que la demostración de la existencia de células basales excluye la posibilidad de enfermedad invasiva. La capa basal resulta frecuentemente atenuada y difícil de identificar mediante la morfología estándar, de ahí el valor de los marcadores inmunohistoquímicos (Wojno y Epstein, 199). Nuestros datos sugieren que p63 puede ser expresada de modo más consistente que las queratinas, y esto puede tener valor en el diagnóstico patológico. Nuestros resultados han mostrado que la señalización de SHH 17

18 probablemente es independiente de la acción de los andrógenos sobre el crecimiento de la VP. Sin embargo, se infiere la involucración conjunta de la señalización de SHH y los andrógenos durante la diferenciación del epitelio prostático; la inhibición de la señalización de SHH tiene efectos diferentes sobre la diferenciación de las puntas epiteliales distales en presencia y ausencia de T. Esto puede estar relacionado con la mayor velocidad de crecimiento de las VPs en presencia versus ausencia de T. Hemos demostrado que las células epiteliales de las puntas distales proliferan más rápidamente en presencia de T (Fig. B), por tanto, tal vez el efecto de la inhibición de la señalización de SHH solo muestra efecto sobre las células de crecimiento más rápido. No se observó un efecto obvio sobre la diferenciación en los conductos proximales de las VPs, cuyas células se dividen mucho más lentamente que las células de las puntas distales después de seis días en cultivo. Proponemos que cualquier interacción entre la señalización de SHH y los andrógenos durante la diferenciación del epitelio prostático tiene elevada probabilidad de ser indirecta y compleja, y sobre la base de la evidencia actual no estamos en condiciones de proponer un mecanismo mediante el cual esta podría ocurrir. La activación inapropiada de la vía de señalización de SHH ha sido implicada en varios tipos de tumor (revisado en (Ruiz Altaba et al., 02)). Nuestros datos son novedosos en el hecho de que la inactivación de la vía de señalización de SHH durante el crecimiento resulta en lesiones que sugieren enfermedades. La vía de señalización de SHH puede controlar otros genes implicados en las enfermedades de la próstata. Ya hemos discutido que Shh puede ser un factor permisivo para la expresión de Nkx3.1 durante el crecimiento del epitelio prostático. Además de los defectos del desarrollo, los ratones mutantes de Nkx3.1 desarrollan lesiones reminiscentes de PIN (Bathia-Gaur et al., 1999; Kim et al., 02), como en nuestras VPs cultivadas en +T+Cy. Mediante la disrupción de la señalización de SHH hemos demostrado que la señalización de SHH es necesaria para el crecimiento de la próstata, y puede inhibir la morfogénesis de las ramificaciones. La inhibición de la señalización de SHH durante el crecimiento provoca diferenciación precoz y aberrante de las células epiteliales, que resultan en lesiones semejantes a PIN humana cribiforme. Este trabajo proporciona información nueva acerca de los efectos sobre el desarrollo de la disrupción de la señalización de SHH durante el crecimiento, y presta evidencias a la teoría de que la regulación inapropiada de las vías de señalización activas durante el crecimiento puede estar implicada en procesos de enfermedades. Ejemplo 2 Tratamiento de carcinoma de célula basal 3 4 A un paciente de sexo masculino que prestaba carcinoma de célula basal se le administró leuprorelin (3,7 mg cada cuatro semanas, por vía intramuscular) hasta que se alcanzaron niveles de testosterona de castración (0, ng/ml). Luego, se le administró ciclopamina al paciente en un régimen de dosificación para mejorar el carcinoma de célula basal. Ejemplo 3 Tratamiento de glioblastoma A un paciente de sexo masculino, que presentaba glioblastoma se le administró flutamida (0 mg tres veces al día peroralmente) para suprimir los efectos de la testosterona. Al paciente luego se le administró un inhibidor de la vía de señalización de SHH en un régimen de dosificación para mejorar el glioblastoma. Referencias 0 6 Abrahams, N. A., Ormsby, A. H. and Brainard, J. (02). Validation of cytokeratin /6 as an effective substitute for keratin 903 in the differentiation of benign from malignant glands in prostate needle biopsies. Histopathology 41, Bellusci, S., Furuta, Y., Rush, M. G., Henderson, R., Winnier, G. and Hogan, B. L. (1997a). Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development 124, Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N. and Hogan, B. L. (1997b), Fibroblast growth factor (FGF) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development 124, Bhatia-Gaur, R., Donjacour, A. A., Sciavolino, P. J., Kim, M., Desai, N., Young, P., Norton, C. R., Gridley, T., Cardiff, R. D., Cunha, G. R. et al. (1999). Roles for Nkx3.1 in prostate development and cancer. Genes Dev 13, Bitgood, M. J. and McMahon, A. P. (199). Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell-cell interaction in the mouse embryo. Dev Biol 172, Bostwick, D. G. and Brawer, M. K. (1987). Prostatic intra-epithelial neoplasia and early invasion in prostate cancer. Cancer- 9,

19 Chiang, C., Litingtung, Y., Lee, E., Young, K. E., Corden, J. L., Westphal, H. and Beachy, P. A. (1996). Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature 383, Chiang, C., Swan, R. Z., Grachtchoulc, M., Bolinger, M., Litingtung, Y., Robertson, E. K., Cooper, M. K., Gaffield, W., Westphal, H., Beachy, P. A. et al. (1999). Essential role for Sonic hedgehog during hair follicle morphogenesis. Dev Biol, 1-9. Chomezynski, P. and Sacchi, N. (1987). Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162, 6-9. Cunha, G. R. and Chung, L. W. (1981). Stromalepithelial interactions--i. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J Steroid Biochem 14, Cunha, G. R., Hayward, S. W., Dahiya, R. and Foster, B. A. (1996). Smooth muscle-epithelial interactions in normal and neoplastic prostatic development. Acta Anat, Epstein, J. I. (1992). Differential diagnosis in pathology: urologic disorders. New York: Igaku-Shoin. 3 4 Freeman, A., Treurnicht, K., Munson, P., Miller, K. and Parkinson, M. C. (02). A comparison of basal cell markers used in the prostate. Histopathology, Frohman, M. A., Boyle, M. and Martin, G. R. (1990). Isolation of the mouse Hox-2.9 gene; analysis of embryonic expression suggests that positional information along the anterior-posterior axis is specified by mesoderm. Development 1, Gao, J., Arnold, J. T. and Isaacs, J. T. (01). Conversion from a paracrine to an autocrine mechanism of androgenstimulated growth during malignant transformation of prostatic epithelial cells. Cancer Res 61, Haraguchi, R., Mo, R., Hui, C., Motoyama, J., Makino, S., Shiroishi, T., Gaffield, W. and Yamada, G. (01). Unique functions of Sonic hedgehog signaling during external genitalia development. Development 128, Hayward, S. W., Baskin, L. S., Haughney, P. C., Cunha, A. R., Foster, B. A., Dahiya, R., Prins, G. S. and Cunha, G. R. (1996). Epithelial development in the rat ventral prostate, anterior prostate and seminal vesicle. Acta Anat, Hayward, S. W., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R. and Cunha, G. R. (1998). Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation 63, Incardona, J. P., Gaffield, W., Kapur, R. P. and Roelink, H. (1998). The teratogenic Veratrum alkaloid cyclopamine inhibits sonic hedgehog signal transduction. Development 1, Kim, M., Bhatia-Gaur, R., Banach-Petrosky, W., Desai, N., Wang, Y., Hayward, S. W., Cunha, G. R., Cardiff, R. D., Shen, M. M. and Abate-Shen, C. (02). Nkx3.1 Mutant Mice Recapitulate Early Stages of Prostate Carcinogenesis. Cancer Res 62, Kim, S. K. and Melton, D. A. (1998). Pancreas development is promoted by cyclopamine, a hedgehog signaling inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA 9, Lamm, M. L., Podlasek, C. A., Barnett, D. H., Lee, J., Clemens, J. Q., Hebner, C. M. and Bushman, W. (01). Mesenchymal factor bone morphogenetic protein 4 restricts ductal budding and branching morphogenesis in the developing prostate. Dev Biol 232, Masson, P. (1929). Some histological methods. Trichrome staining and their preliminary techniques. Bull Int Assoc Med. 12, 7. Nogawa, H., Morita, K. and Cardoso, W. (1998). Bud Formation Precedes the Appearance of Differential Cell Proliferation During Branching Morphogenesis of Mouse Lung Epithelium In Vitro. Dev Dyn 213, Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D. and Cunha, G. R. (1999). Carcinomaassociated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res 9, Parsons, J. K., Gage, W. R., Nelson, W. G. and De Marzo, A. M. (01). p63 protein expression is rare in prostate adenocarcinoma: implications for cancer diagnosis and carcinogenesis. Urology 8, Pathi, S., Pagan-Westphal, S., Baker, D. P., Garber, E. A., Rayhorn, P., Bumcrot, D. A., Tabin, C. J., Blake Pepinsky, R. and Williams, K. P. (01). Comparative biological responses to human Sonic, Indian and Desert hedgehog. Mech Dev 6,

20 Pepicelli, C. V., Lewis, P. M. and McMahon, A. P. (1998). Sonic hedgehog regulates branching morphogenesis in the mammalian lung. Curr Biol 8, Perriton, C. L., Powles, N., Chiang, C., Maconochie, M. K. and Cohn, M. J. (02). Sonic hedgehog Signaling from the Urethral Epithelium Controls External Genital Development. Dev Biol 247, Podlasek, C. A., Barnett, D. H., Clemens, J. Q., Bak, P. M. and Bushman, W. (1999). Prostate development requires Sonic hedgehog expressed by the urogenital sinus epithelium. Dev Biol 9, Ramalho-Santos, M., Melton, D. A. and McMahon, A. P. (00). Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development 127, Roelink, H., Augsburger, A., Heemskerk, J., Korzh, V., Norlin, S., Ruiz i Altaba, A., Tanabe, Y., Placzek, M., Edlund, T., Jessell, T. M. et al. (1994). Floor plate and motor neuron induction by vhh-1, a vertebrate homolog of hedgehog expressed by the notochord. Cell 76, Ruiz i Altaba, A., Sanchez, P. and Dahmane, N. (02). Gli and Hedgehog in Cancer: Tumours, Embryos and Stem Cells. Nat Rev Cancer 2, Schneider, A., Brand, T., Zweigerdt, R. and Arnold, H. (00). Targeted disruption of the Nkx3.1 gene in mice results in morphogenetic defects of minor salivary glands: parallels to glandular duct morphogenesis in prostate. Mech Dev 9, Stone, D. M., Hynes, M., Armanini, M., Swanson, T. A., Gu, Q., Johnson, R. L., Scott, M. P., Pennica, D., Goddard, A., Phillips, H. et al. (1996). The tumour-suppressor gene patched encodes a candidate receptor for Sonic hedgehog. Nature 384, Sugimura, Y., Cunha, G. R. and Donjacour, A. A. (1986). Morphogenesis of ductal networks in the mouse prostate. Biol Reprod 34, Sugimura, Y., Foster, B. A., Hom, Y. K., Rubin, J. S., Finch, P. W., Aaronson, S. A., Hayashi, N., Kawamura, J. and Cunha, G. R. (1996). Keratinocyte growth factor (KGF) can replace testosterone in the ductal branching morphogenesis of the rat ventral prostate. Int J Dev Biol, Sukegawa, A., Narita, T., Kameda, T., Saitoh, K., Nohno, T., Iba, H., Yasugi, S. and Fukuda, K. (00). The concentric structure of the developing gut is regulated by Sonic hedgehog derived from endodermal epithelium. Development 127, Thomson, A. A. and Cunha, G. R. (1999). Prostatic growth and development are regulated by FGF. Development 126, Thomson, A. A., Foster, B. A. and Cunha, G. R. (1997). Analysis of growth factor and receptor mrna levels during development of the rat seminal vesicle and prostate. Development 124, Thomson, A. A., Timms, B. G., Barton, L., Cunha, G. R. and Grace, O. C. (02). The role of smooth muscle in regulating prostatic induction. Development 129, Totten, R. S., Heineman, M. W., Hudson, P. B., Sproul, E. E. and Stout, A. P. (193). Microscopic differential diagnosis of latent carcinoma of the prostate. Arch Pathol, Wang, Y., Hayward, S. W., Cao, M., Thayer, K. A. and Cunha, G. R. (00). Cell differentiation lineage in the prostate. Differentiation 68, Wojno, K. J. and Epstein, J. I. (199). The utility of basal cell-specific anti-cytokeratin antibody (34 beta E12) in the diagnosis of prostate cancer. A review of 228 cases. Am J Surg Pathol 19, 1-. 6

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