Hiperhomocisteinemia en la fertilidad de las hembras carentes de la enzima cistationina beta sintasa.
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- Monica Flores Espinoza
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1 Hiperhomocisteinemia en la fertilidad de las hembras carentes de la enzima cistationina beta sintasa. Mª Ángeles Navarro Ferrando CP08/00043 I Jornadas Científicas IIS Aragón Zaragoza, 8 de noviembre de 2010
2 La homocisteína es un aminoácido no esencial cuya elevación sanguínea se asocia con el desarrollo de enfermedades de tipo vascular, neurológico y reproductivo Hiperhomocisteinemia En el campo de la reproducción humana se ha visto que la hiperhomocisteinemia (Hhcy) es un factor de riesgo asociado a problemas placentarios como la preclampsia, abrupción, infarto placentario o aborto espontáneo.
3 Remetilación STHM THF Metabolismo de la homocisteína Proteínas Metionina ATP MAT Metilén THF MS Vit B12 SMMT BHMT Dimetilglicina Betaína S-adenosil metionina Metilación de fosfolípidos, proteínas, DNA MTHFR Metil THF Serina Homocisteína CBS Vit B6 SAH S-adenosil homocisteína SH 2 Cistationina CGL Vit B6 Transulfuración α - cetoglutarato + NH 4 Cisteína SH 2 Taurina Sulfato + CO 2 Glutation
4 Deficiencia de la enzima cistationina beta sintasa (CBS) en la población El defecto se transmite de forma autosómica recesiva Incidencia homocigosis 1:58000 y 1: heterocigosis 1:100 Valores de homocisteína en homocigosis pueden llegar hasta 400 micromolar
5 Modelo animal de hiperhomocisteinemia
6 Ratones carentes de CBS 1. Los homocigotos presentan una hiperhomocisteinemia muy severa y logran completar el desarrollo embrionario normalmente Parámetro μm Cbs +/+ Cbs -/- Homocisteina 25,4 ± 4,8 353 ± 81 a Metionina 144 ± ± 241 a (Akahoshi et al,2008) Animales de 2 semanas estirpe C57Bl/6J media ±SD a, p<0.001 t Student
7 Ratones carentes de CBS 2. Presentan bajo peso al nacer, retardo de apertura del ojo, anormalidades esqueléticas tales como cara, cola y extremidades muy alargadas y delgadas. El pelo en el lomo es menos denso y con menor diámetro WT (cbs +/+) KO (cbs -/-) (Watanabe y cols., 1995)
8 Ratones carentes de CBS 3. El 80% de estos animales mueren antes de cumplir los 21 días 100 % supervivencia cbs -/- cbs +/ día (Watanabe y cols., 1995)
9 Ratones carentes de CBS 4. Los hepatocitos de estos animales son de mayor tamaño con inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas WT (cbs +/+) KO (cbs -/-) (Watanabe y cols., 1995)
10 Ratones carentes de CBS 5. Los machos que sobreviven son fértiles mientras que las hembras no lo fueron (Watanabe y cols., 1995)
11 Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras en función del genotipo Mating female x male Number of mating Number of plugs Number of pregnacies Number of pups Litters size Number of surviving pups cbs +/+ x cbs +/ ± 2 a 46 cbs +/- x cbs +/ ± 2 a 24 cbs +/- x cbs -/ ± 1 a 23 cbs -/- x cbs -/ ± 1 0 Animales de 6 meses a, p<0.001 vs cbs -/- x cbs -/- anova. ( Guzman et al Human Molecular Genetics : )
12 Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras trasplantadas Mating Transplanted female x male Number of pups Liter size Number of surviving pups cbs -/- ovary cbs +/+ x cbs -/- 7 3 ± 1 7 cbs -/- ovary cbs +/- x cbs -/ ± 1 12 cbs -/- ovary cbs +/- x cbs +/+ 3 2 ± 1 3 cbs +/+ ovary cbs +/- x cbs +/ ± 1 11 ( Guzman et al Human Molecular Genetics : )
13 Objetivo 1 Determinación del momento del desarrollo del embrión en el que se produce la muerte.
14 Objetivo 2 Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.
15 Objetivo 1 Determinación del momento del desarrollo del embrión en el que se produce la muerte.
16 Grupos experimentales Grupo Control : WT (edad 12 semanas) Cbs +/+ X Cbs +/+ n=24 Grupo Homocigoto: Cbs KO (edad 12 semanas) Cbs -/- X Cbs -/- n=24 gestantes sacrificadas a día 4, 8, 12 y 16 de gestación (n=6)
17 Diseño experimental gestación día 4,8,12,16 Toma de muestras Ayuno Eutanasia con CO 2 Plasma Tejidos (Ovario, útero, embriones, placenta) Registro de pesos y nº de sitios de implantación Homocisteína Cisteína Lípidos Análisis de expresión Análisis proteómico Análisis histológico
18 Objetivo 2 Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.
19 Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación Grupos experimentales Útero hembras cbs +/+ Útero hembras cbs -/- con sin Sitios de implantación
20 Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación Procedimiento experimental Extracción y limpieza de RNA Análisis de expresión (Affimetrix gene chip). Identificación de los genes sobreexpresados y reprimidos en las diferentes condiciones experimentales con respecto al grupo control Confirmación a nivel individual por real time PCR
21 Objetivos Futuros 3.Recuperación del fenotipo de fertilidad femenina por ingeniería genética y terapia celular. 4.Inducción del fenotipo de infertilidad en ausencia de expresión de cbs utilizando sirna. 5.Ratificación de los mecanismos propuestos en el objetivo 2 al verse corregidos en la recuperación del fenotipo.
22 Dr. Jesús Osada Mario Nuño Dr. Mario Alberto Guzmán Dr. José Manuel Lou Dr. Alfonso Sarriá Dra. Natalia Guillén Dr. Sergio Acín Roberto Martínez Dr. Joaquín Surra Cristina Barranquero Sara Sancho Clara Gabás Adela Ramirez Agradecimientos
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