UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA INDUSTRIAL TESIS EFECTO DE LOS METABOLITOS VOLATILES DE Trichoderma asperellum TC 74 SOBRE EL CRECIMIENTO DE Fusarium oxysporum. f. sp. lycopersici RAZA 3. PRESENTA Elideth Lucero Flores González DIRECTOR INTERNO DRA. Rosalba Ortega Jimenez DIRECTOR EXTERNO M. en C. Leticia Bravo Luna ORIZABA, VER. FEBRERO, 2011

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3 El presente trabajo titulado EFECTO DE LOS METABOLITOS VOLATILES DE Trichoderma asperellum TC 74 SOBRE EL CRECIMIENTO DE Fusarium oxysporum. f. sp. lycopersici RAZA 3. Se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro del Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politecnico Nacional en Yautepec, Morelos. Bajo la dirección externa de la M. en C. Leticia Bravo Luna. La investigación fue realizada con el financiamiento económico del convenio: BIOKRONE S.A de C.V. y CEPROBI-IPN. Y la dirección interna estuvo a cargo de la Dra. Rosalba Ortega Jiménez (FCQ-UV).

4 DEDICADA: A UNA GRAN MUJER MI MADRE MARIA GUADALUPE FLORES GONZALEZ

5 AGRADECIMIENTOS A Dios: Gracias mi Dios por darme la vida, mi familia, mis amigos por permitrime llegar a cumplir esta meta en mi vida gracias por estar conmigo en cada momento de mi vida A mis padres Madre.. Porque Dios te eligió para guiarme en este camino, educándome con sabiduría y amor. Gracias por comprenderme en momentos difíciles gracias por tu apoyo en todo momento. Gracias por el esfuerzo y sacrificios que has hecho a cada momento porque yo llegara a tener una carrara profesional. No tengo palabras para expresarte cuan agradecida estoy contigo te amo mamita. Mama yaya papa pascual gracias papis porque siempre estuvieron conmigo en todo momento gracias por creer en mí por la educación que dieron por todo su apoyo por su amor este logro también es para ustedes. Los amo A cristhian gracias hermanita por apoyarme tkm A mis tías Cata, Mati porque gracias a sus consejos y apoyos han hecho que siga adelante las quiero mucho y a mis primos gracias... A mi niño hermoso mi bebe gracias por llenarme la vida de luz y alegría Gracias mi angelito este logro también es para ti Rogelio Gracias por tu apoyo por estar conmigo a lo largo de este camino en las buenas y malas tkm A mis amigos: Sarahí, Rene, Victoria..Gracias por compartir conmigo en esta etapa de mi viada por los momentos buenos y malos que pasamos y por tantas cosas los kiero mucho A mis compañeros de generación. A mis maestros Gracias por que a lo largo de mi carrera me trasmitieron sus conocimientos, me brindaron sus consejos y apoyos Maestras Lety: Gracias por ayudar a cumplir mi sueño gracias por su apoyo y comprensión le estoy muy agradecida y es usted un gran ser humano Dra Rosalba. Muchas gracias por su apoyo, por brindarme sus conocimientos a lo largo de la realización de este trabajo gracias por su confianza y paciencia brindada A mis sinodales: Dra. Marina Guevara valencia Dr. Eliud A. García MontalvoCon Cariño Elideth Lucero Flores González

6 ÍNDICE Índice de Figuras Páginas III 1. INTRODUCCIÓN Planteamiento del problema Justificación Objetivo general Hipótesis 4 2. MARCO TEÓRICO Trichoderma spp Importancia Clasificación taxonómica Características generales Trichoderma como agente de control biológico Principales beneficios agrícolas de Trichoderma Control de Trichoderma sobre diferentes 13 microorganismos fitopatógenos 2.4 Mecanismos de acción de Trichoderma Importancia del jitomate Enfermedades en cultivos de jitomate Síntomas en las plantas Manejo de la enfermedad METODOLOGIA Material biológico Preparación de sustrato para siembra de Trichoderma Siembra de Trichoderma Tc74 en matraces con 30 I

7 sustrato 3.4 Preparación de medio PDA Siembra de Fusarium oxysporum Confrontación de Trichoderma y Fusarium Análisis estadístico RESULTADOS y DISCUSIÓN Resultados de la confrontación a los 9 días Resultados de la confrontación a los 15 días Resultados de la confrontación a los 21 días CONCLUSIONES ANEXOS REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 47 II

8 INDICE DE FIGURAS Figura 1 Páginas 11 Conidios y conidióforos de Trichoderma sp Hifas de Trichoderma sp. enrolladas en hifas de Curvularia sp Micorasitismo de Trichoderma sp. en Rhizoctonia sp Distribución geográfica del cultivo de tomate en el país 5 27 Porcentaje de producción en los últimos años de tomate 6 29 Macro y micro conidias de Fusarium oxysporum 7 29 Plantas marchitas por Fusarium oxysporum f. sp lycopercisi 8 Diagrama de trabajo para determinar el efecto de los metabolitos volátiles de Trichoderma asperellum TC 74 sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum. f. sp. Lycopersici Raza confrontación de matraces en la campana de flujo laminar 34 III

9 10 Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento 37 micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol) confrontados a los 9 días de incubación de Trichoderma. 11 Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum Tc74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 9 de incubación de Trichoderma. (p= 0.192) Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3(Fol) confrontados a los 15 días i de incubación de Trichoderma Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum Tc74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 15 de incubación de Trichoderma. (p= < 0.001) E Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol) confrontados a los 21 días de i de incubación de Trichoderma Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum 7Tc 74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 21 ide incubación de Trichoderma. (p= 0.001) Figura 16. Comparación grafica de cada tratamiento. 41 IV

10 1. INTRODUCCIÓN 1

11 En México, el cultivo de tomate (lycopersicon esculentum Mill.) es uno de los más importantes por sus niveles de consumo. Este cultivo es afectado por varios patógenos, entre los cuales Fusarium spp., Phytophthora y Rhizoctonia solani, pueden causar daños en raíz, tallo, hojas y frutos. El método tradicional de control es el uso de fungicidas químicos sintéticos que presentan desventajas como: contaminación ambiental, organismos resistentes, residuos, altos costos de estos. Una alternativa al uso de fungicidas sintéticos, es la utilización de microorganismos antagónicos a los patógenos. (Wisniewskiy y Wilson, 1992) Los antagonistas de mayor importancia que se han investigado pertenecen al género Trichoderma, los cuales poseen diferentes mecanismos de acción para controlar el desarrollo de patógenos, como la antibiosis, competencia por espacio o por nutrimentos, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática) e inducción de resistencia. En general, los antagonistas presentan diferentes modos de acción y la multiplicidad de estos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico (Vannacci & Gullino, 2000). Diferentes especies de Trichoderma han sido utilizados como ingrediente activo de biopesticidas, debido a que se han aplicado exitosamente contra Phytium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp. Sclerotina spp., así como también contra Fusarium spp. en un gran número de cultivos; aplicados a semillas para el control de patógenos presentes en semillas y suelos, además de su efecto como promotor en la estimulación del crecimiento de las plantas. Numerosos estudios han demostrado que la especie T. harzianum Rifai ejerce un control efectivo en enfermedades presentes en plantas causados por R. solani y Sclerotium rolfsii (E.F. Smith) Existe evidencia de que los metabolitos secundarios producidos por Trichoderma en una forma orgánica y en suficientes cantidades explica su eficiente control biológico sobre diversos hongos fitopatógenos (Pavizas, 1985). Varios estudios indican que el origen principal de la fungistasis, son sustancias volátiles involucradas en el complejo de este fenómeno. Distintos autores identificaron entre estos componentes gaseosos al dióxido de carbono, etanol, acetaldehído, acetona, propanol, isobutanol e isopentanol, los cuales a diferentes concentraciones intervienen en la regulación del mecanismo fungistático. 2

12 Trichoderma está ampliamente difundida en diferentes comunidades de los suelos dentro de las cuales existen especies con marcadas propiedades antagónicas; entre éstas con alta concentración de sustancias gaseosas, según Dennis y Webster (1971) lo que permite diferenciar a estas últimas, es un pronunciado aroma a coco que desprende del cultivo. Por lo cual es importante identificar el o los mecanismos de acción con que cuentan los organismos aislados de estos suelos para aprovecharlos como organismos de biocontrol. 1.1 Planteamiento del problema F. oxysporum es un hongo ampliamente distribuido y perjudicial en la agricultura, siendo el tomate uno de los cultivos más susceptibles. Algunos síntomas que puede presentar la planta por el ataque de este hongo son: clorosis, achaparramiento, coloración café del xilema, marchitez que es la característica típica. Fusarium es un excelente habitante del suelo, por lo que una vez establecido, permanecerá indefinidamente, por lo que una estrategia de control es el uso de variedades resistentes, el uso de fungicidas sintéticos como el Benlate; sin embargo, este fungicida disminuye temporalmente la población, ya que se ha reportado que el patógeno puede evadir la acción fungicida, o porque los mismos fungicidas, pueden actuar como agentes mutagénicos, dando como resultado la resistencia. Otra alternativa a este grave problema, puede ser la utilización de agentes biológicos competitivos y eficientes como lo son los hongos antagónicos, protegiendo de esta manera al cultivo, al hombre y al ambiente. 1.2 Justificación Trichoderma presenta antecedentes como agente de biocontrol contra diferentes hongos fitopatógenos. Su habilidad para reducir daños está relacionada con su capacidad de competencia. Mientras mayor sea la probabilidad de que un aislamiento de Trichoderma, manifieste varios modos de acción; más eficiente y duradero será el control sobre el patógeno, aspectos que no poseen los fungicidas químicos. 3

13 Muchas cepas de Trichoderma producen metabolitos secundarios volátiles y no volátiles, algunos de los cuales inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen contacto físico, tales sustancias inhibidoras son consideradas antibióticos. De acuerdo a los antecedentes mencionados la finalidad del presente trabajo es la de conocer los efectos que producen los metabolitos secundarios volátiles generados por Trichoderma sobre Fusarium, que en un futuro pueda aplicarse como un agente de biocontrol de Fusarium en el cultivo de jitomate, para así disminuir el uso de fungicidas químicos sintéticos, dentro de un manejo agroecológico de enfermedades, de modo que puedan postularse como un agente de biocontrol seguro para la selección de aislamientos competitivos. 1.3 Objetivo general Evaluar in vitro la capacidad antagónica de Trichoderma asperellum Tc74 mediante sus metabolitos secundarios volátiles, sobre el desarrollo de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Raza Hipótesis H 0 : Los metabolitos secundarios volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 inhiben el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Raza 3. 4

14 2. MARCO TEÓRICO 5

15 2.1 Trichoderma spp Importancia En el mundo se conoce un grupo importante de hongos y bacterias que presentan efecto antagónico sobre otros microorganismos. Este efecto es aprovechado por el hombre para la regulación, tanto de patógenos cuyo hábitat es el suelo, como aquellos que se desarrollan en la parte foliar de las plantas (Ruiz,1996) Los hongos antagonistas contribuyen a la disminución de los daños que causan las enfermedades en agroecosistemas, donde existen condiciones para su desarrollo y conservación. Para lograr este objetivo los microorganismos benéficos presentan diferentes modos de acción que les permiten ejercer su efecto biorregulador; estos atributos en su conjunto y aunado a la capacidad de multiplicarse abundantemente, se consideran entre los de mayor importancia para su selección como agentes de control biológico (Fernández, 2001). El género Trichoderma está en el ambiente y especialmente en el suelo; se ha utilizado en aplicaciones comerciales para disminuir las poblaciones de fitopatógenos de diversos cultivos. Se encuentra en suelos abundantes en materia orgánica y por su relación con ella está clasificado en el grupo de hongos hipógeos, lignolícolas y depredadores. Es aeróbico y pueden estar en los suelos con ph neutro hasta ácido Clasificación taxonómica Trichoderma fue descrito por primera vez hace 200 años por los micólogos, como un gasteromiceto y solo un siglo después se realizó el análisis de su estructura y características para ser clasificado como género entre los hongos filamentosos, con propiedades y actividades biológicas cada vez más usadas en la agricultura actual. Su habilidad como antagonista fue descubierta hace 50 años y una gran cantidad de artículos técnicos describen sus bondades en el manejo biológico de los cultivos agrícolas (Ahmad y Baker, 1987). 6

16 Es un tipo de hongo anaerobio facultativo que se encuentra de manera natural en un número importante de suelos agrícolas y otros tipos de medios. Pertenece a la subdivisión Deuteromycetes que se caracterizan por no poseer, o no presentar un estado sexual determinado. La clasificación taxonómica actual lo ubica dentro del Reino de las plantas, División Mycota, Sub división Eumycota, Clase Deuteromicetes, Orden Moniliales, Familia Moniliaceae, Género Trichoderma, se conocen 27 especies de Trichoderma, entre las más comunes se encuentran: T. harzianum, Rifai, T. viride Pers., T polysporum Link Fr, T. reesei EG Simmons, T. virens, T. longibrachatum T. pseudokoningii, T. hamatum, T. lignorum y T. citroviride (Villegas, 2005) Características generales Se encuentra ampliamente distribuido en el mundo, y se presenta en diferentes zonas y hábitat, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos vegetales en descomposición, así mismo en residuos de cultivos, especialmente en aquellos que son atacados por otros hongos. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de altas densidades de raíces, las cuales son colonizadas rápidamente por estos microorganismos. Esta capacidad de adaptación a diversas condiciones medioambientales y sustratos confiere a Trichoderma la posibilidad de ser utilizado en diferentes suelos, cultivos, climas y procesos tecnológicos. Se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es ralo en su mayoría, y visto al microscopio es fino, los conidióforos son ramificados, parecen un árbol pequeño. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal (Figura. 1). Estos terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para la identificación taxonómica a nivel de especies. Los conidios aseguran las generaciones del hongo durante gran parte del período vegetativo de las plantas (Rifai, 1969). Son haploides y su pared está compuesta por quitina y glucanos (Harman, 2007). Además de los conidióforos, estas se pueden producir sobre fiálides que emergen directamente del micelio. 7

17 Figura 1. Conidios y conidióforos de Trichoderma sp. La mayoría de las especies de Trichoderma presentan clamidosporas, las cuales pueden ser intercalares y en ocasiones terminales. Las clamidosporas toleran condiciones ambientales adversas, son estructuras de sobrevivencia y permiten que el hongo pueda perdurar a través del tiempo (Stefanova, 1999). No obstante, las clamidosporas recién formadas presentan más de 75% de germinación, bajo condiciones óptimas de humedad (> 75%) y temperatura (28-30 o C). Debido a esto se dice, que las especies de Trichoderma produce tres tipos de propágulos: hifas, clamidosporas y conidios (Díaz, 1994). La alta presencia de humedad y el riego mejora las condiciones de vida de Trichoderma, pasando de un estado latente a uno activo y desarrollándose óptimamente hasta en un 60 % de humedad de capacidad del suelo. A porcentajes mayores de saturación se disminuye la colonización y sobrevivencia por la baja disponibilidad de oxigeno. Es favorecido por condiciones de ph ácido donde su población se incrementa por una mayor formación de conidióforos, por la germinación de conidios y por menor competencia con microorganismos como actinomicetos y bacterias que se encuentran limitados por la acidez. En suelos con temperatura que oscilan entre los 10º y 15º C y baja disponibilidad de nutrientes esenciales no crece y se afecta la actividad benéfica. 8

18 2.2 Trichoderma como agente de control biológico Trichoderma tiene diversas ventajas como agente de control biológico, ya que posee un rápido crecimiento y desarrollo, también produce una gran cantidad de enzimas, inducibles con la presencia de hongos fitopatógenos. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hábitat, donde los hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos significativos de plaguicidas y otros químicos. Además su gran variabilidad se constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico bajo diferentes sistemas de producción y cultivos. Trichoderma, toma nutriente de los hongos (a los cuales degrada) y de materiales orgánicos ayudando a su descomposición, por lo cual las incorporaciones de materia orgánica y compostaje lo favorecen; también requiere de humedad para poder germinar, la velocidad de crecimiento de este organismo es bastante alta, por ello es capaz de establecerse en el suelo y controlar enfermedades. Probablemente sea el hongo benéfico, más versátil y polifacético que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo sea patógeno de ninguna planta; sin embargo, es capaz de parasitar, controlar y destruir muchos hongos, nematodos y otros fitopatógenos, que atacan y destruyen muchos cultivos; debido a ello, muchos investigadores lo consideran hongo hiperparásito. Todo esto convierte a Trichoderma en un microorganismo de imprescindible presencia en los suelos y cultivos, y de un incalculable valor agrícola (Chet, 1993). T. harzianum ha demostrado ser efectivo contra diversas especies de Fusarium, hongo que causa daños importantes en el cultivo de jitomate. La incidencia de Fusarium en cultivo de jitomate causa anualmente pérdidas económicas importantes a los productores. El uso de T. harzianum durante la etapa de invernadero de cultivo de jitomate permite disminuir significativamente la incidencia de Fusarium en las raíces y en el fruto maduro. Las cepas de T. harzianum son consideradas como los más efectivos fungicidas biológicos por su amplio espectro antagónico contra hongos fitopatógenos mediante la producción de enzimas líticas 9

19 que degradan las paredes celulares del patógeno provocando su muerte (Serrano y Galindo, 2006). Rosello (2003) determinó en cultivo dual que T. harzianum frente a Rhizoctonia solani y Verticillium solani presentó mayores valores de crecimiento, quedando de manifiesto el total dominio de T. harzianum sobre las cepas enfrentadas, no así con F. oxysporum f. sp. lycopersici. Existen reportes señalando que el género Trichoderma sintetiza varias moléculas de bajo peso molecular que también tienen actividad antagónica, fenómeno denominado como antibiosis. Entre estas moléculas encuentra un grupo de compuestos denominados peptaiboles que agrupan péptidos de no más de 20 residuos de aminoácidos, algunas de naturaleza no proteica como el ácido α-arninoisobutírico, isovalina e hidroxiprolina. Dichos compuestos tienen la capacidad de desestabilizar el voltaje de las membranas celulares para el correcto funcionamiento de los canales iónicos de las células sobre los cuales tienen efecto, teniendo esto como consecuencia la desrregulación de factores fisicoquímicos celulares y la posterior muerte de células (Ramírez y Trigos, 2008; Guedez et al., 1997). La actividad de T. harzianum podría verse afectado por señales ambientales, que incluyen entre otros, la presencia de los nutrientes de las plantas en el campo, como reguladores del crecimiento en sus formulaciones. A. alternata es un hongo patógeno que puede secretar endo-poligalacturonasa (endo-pg) y liasa pectasa (LP o por sus siglas en ingles: PL). Estas enzimas son responsables de la hidrólisis péctica de componentes de la pared de células vegetales; dependiendo del tipo de interacción desarrollado entre las especies de plantas y los microorganismos (compatible o incompatible), estos podrían ser pectinas que representan uno de los mecanismos de infección por hongos o podrían ser considerados dentro de los sistemas enzimáticos que activan una respuesta hipersensible a través de la liberación de oligosacáridos (elicitor) en respuesta de la planta. Los resultados de esta investigación es que la presencia de reguladores de crecimiento no afecta a la capacidad de T. harzianum para el control de A. alternata. Además, su presencia podría beneficiarse de la actividad de la planta que induce a T. harzianum a activar sus mecanismos de defensa en contra de la invasión de fitopatógenos. 10

20 2.3 Principales beneficios agrícolas de Trichoderma Entre las diversas funciones beneficiosas que realiza este hongo en la agricultura, especialmente en el campo de la sanidad vegetal. Se han demostrado las siguientes: a) Estimulador del crecimiento de las plantas Se ha comprobado que Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas. Estas sustancias actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemáticos primarios (los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no hayan sido tratadas con dicho microorganismo. Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, Tagetes, petunia, pepino, berenjena, arveja, pimienta, rábano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodón, fríjol y pastos ornamentales. Las semillas de pepino germinan dos días antes que aquellas que no han sido inoculadas con el hongo. La floración de Pervinca rosea, se acelera en el número de botones por planta. En crisantemo se incrementa también el número de botones, la altura y el peso de plantas son mayores que aquellas no tratadas. Tales respuestas han ocurrido consistentemente a concentraciones de 108 unidades formadoras de colonias por gramo de suelo, estas densidades de población son fácilmente aplicables al suelo en formulaciones, las cuales favorecen a su vez el incremento de la población de Trichoderma en el medio. Se han realizado algunos estudios preliminares con Trichoderma para la estimulación del crecimiento sobre plantas de fríjol, donde los aislamientos seleccionados estimularon la germinación y presentaron un aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso de un 60% aproximadamente, ello supone un incremento en los rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto estrella, demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un 30%. 11

21 b) Protección de semillas contra el ataque de hongos patógenos Posterior a la cosecha, el almacenamiento de semillas para la próxima siembra, si no se aporta la suficiente cobertura de conservación (para conservar su potencial germinativo y productivo), trae como consecuencia que varias especies de hongos patógenos ataquen dichas semillas con relativa facilidad, logrando una significativa pérdida de sus cualidades botánicas y productivas. Se ha demostrado la protección con Trichoderma garantizando la cosecha, ya que este hongo coloniza las semillas botánicas protegiendo las futuras plántulas en la fase post-emergente de patógenos fúngicos, ya que es capaz de colonizar la superficie de la raíz y de la rizósfera a partir de las semillas tratadas y de las plantas adultas existentes en el suelo, protegiendo a las mismas de enfermedades fungosas. Así las semillas reciben una cobertura protectora cuyo efecto se muestra cuando la misma es plantada en el sustrato correspondiente. El tratamiento de las semillas reduce los contaminantes externos como Rhizopus stolonifer y otras especies de hongos en cucurbitáceas, col, cebolla, rábano, remolacha, zanahoria, habichuela, tomate y pimiento entre otros; además incrementa el porcentaje de germinación y estimula el crecimiento (Stefanova, 1999). c) Protección directa a suelos y diferentes cultivos l manejo de las plantas mediante la rotación de cultivos favorece a Trichoderma a librar el suelo de los propágulos del fitopatógeno (las estructuras de resistencia que el patógeno deja en el suelo con el fin de que cuando vuelvas a sembrar te vuelva a infectar la cosecha), vulnerables durante su latencia en ausencia del hospedante, por esta razón la utilización del biopreparado en los cultivos a rotar en las áreas altamente infectadas será una forma a contribuir en la reducción de la población del patógeno en un menor plazo de tiempo. Además la preparación adecuada del terreno, la mejor fecha de plantación, fertilización y riego actúan a favor de la combinación Planta-Trichoderma asociadas. La aplicación de Trichoderma, directo al suelo ofrece incluso una protección mayor a los cultivos. Cuando Trichoderma es utilizado 12

22 para el control de hongos del suelo, pueden mezclarse con materia orgánica (estiércol y biotierra) y otras enmiendas utilizadas como biofertilizantes, tal como se hace con inoculantes bacterianos usados como fertilizantes ecológicos Control de Trichoderma sobre diferentes microorganismos fitopatógenos Al emplear un abono orgánico rico en microorganismos de excelente control biológico como el Trichoderma, se logra un buen control de la enfermedad "mal del alluelo" producido por el hongo de suelo Rhizoctonia spp., en este caso el control es debido a los mecanismos de competencia e hiperparasitismo del Trichoderma hacia el hongo Rhizoctonia spp., además de sustancias nocivas al patógeno (antibiosis, por producción de antibióticos), producidas por el sustrato de materia orgánica empleada. Varias instituciones han demostrado la potencialidad de Trichoderma como posible agente de control, tanto in vitro, como in vivo, de los siguientes fitopatógenos: A. mellea, R. solani, S. sclerotiorum y Phytophthora spp. En América del Sur, científicos están aplicando el hongo Trichoderma para combatir y controlar el "witches broom y el hongo "frosty pod"; principales enfermedades en el cultivo del cacao en Brasil y Perú respectivamente. En el cultivo de arroz (Oryza sativa), Trichoderma ejerció un control sobre el hongo Rhizoctonia solani, que afecta la producción de arroz en más del 20%. Cuando se aplicó Trichoderma, los niveles de incidencia estuvieron por debajo del 13%, mientras que en el testigo la incidencia del fitopatógeno estuvo por encima del 50% (Stefanova y Larrinaga, 1999). Está demostrado que Trichoderma también es empleado como bioagente para el control de diferentes fitopatógenos, por lo que ha contribuido a sustituir en muchas cultivos las aplicaciones de plaguicidas químicos, que son más caros y más dañinos a la salud de las personas y de los animales. Ello ha posibilitado la producción de alimentos más sanos y ecológicos, potenciando de manera significativa una agricultura orgánica y más en correspondencia con las actuales necesidades de los consumidores. Obreque (2004) llevó a cabo una evaluación aplicando T. harzianum en conjunto con el fungicida benomilo para el control de Fusarium sp. En proteasas y se determinó que benomilo y T. harzianum en concentraciones de 10 8 y 10 9 conidias fueron efectivos en el control de Fusarium sp., disminuyendo la enfermedad en un 20%. 13

23 2.4 Mecanismos de acción de Trichoderma En la acción biocontroladora de Trichoderma se han descrito diferentes mecanismos de acción que regulan el desarrollo de los hongos fitopatógenos. Entre estos, los principales son la competencia por espacio y nutrientes, el micoparasitismo y la antibiosis, que tienen una acción directa frente al hongo fitopatógeno (Leal, 2000) Estos mecanismos se ven favorecidos por la habilidad de los aislamientos de Trichoderma para colonizar la rizósfera de las plantas. Otros autores han sugerido distintos mecanismos responsables de su actividad biocontroladora, que incluyen, además de los mencionados, la secreción de enzimas y la producción de compuestos inhibidores (Haram y Zimand, 1996). Además se conoce que Trichoderma presenta otros mecanismos, cuya acción biorreguladora es de forma indirecta. Entre estos se pueden mencionar los que elicitan o inducen mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos como es la activación en la planta de compuestos relacionados con la resistencia (Inducción de Resistencia) (Harman, 2004), con la detoxificación de toxinas excretadas por patógenos y la desactivación de enzimas de estos durante el proceso de infección; la solubilización de elementos nutritivos, que en su forma original no son accesibles para las plantas. Tienen la capacidad además, de crear un ambiente favorable al desarrollo radical lo que aumenta la tolerancia de la planta al estrés (Harman 2003). a) Competencia La competencia constituye un mecanismo de antagonismo muy importante. Se define como el comportamiento desigual de dos o más organismos ante un mismo requerimiento (sustrato, nutrientes), siempre y cuando la utilización de este por uno de los organismos reduzca la cantidad o espacio disponible para los demás. Este tipo de antagonismo se ve favorecido por las características del agente de control biológico como plasticidad ecológica, velocidad de crecimiento y desarrollo, y por otro lado por factores externos como tipo de suelo, ph, temperatura, humedad, entre otros (Ahmad, 1987). La presencia de forma natural de Trichoderma en diferentes suelos (agrícolas, forestales, en barbechos), se considera una evidencia de la plasticidad ecológica de este hongo y de su 14

24 habilidad como excelente competidor por espacio y recursos nutricionales, aunque la competencia depende de la especie (Wardle et al., 1993 citados por Samuels, 1996). Trichoderma está biológicamente adaptado para una colonización agresiva de los sustratos y en condiciones adversas para sobrevivir, fundamentalmente, en forma de clamidosporas. La alta velocidad de crecimiento, abundante esporulación y la amplia gama de sustratos sobre los que puede crecer, debido a la riqueza de enzimas que posee, hacen que sea muy eficiente como saprófito y aún más como agente de control biológico (Hjeljord, 1998). La competencia por nutrientes puede ser por nitrógeno, carbohidratos no estructurales (azúcares y polisacáridos como almidón, celulosa, quitina, laminarina, y pectinas, entre otros) y microelementos (Eveleigh, 1986). Esta forma de competencia en los suelos o sustratos ricos en nutrientes no tiene importancia desde el punto de vista práctico. Por ello, cuando se emplea fertilización completa o existe exceso de algunos de los componentes de los fertilizantes e inclusive en suelos con alto contenido de materia orgánica, este tipo de antagonismo es poco eficaz. La competencia por sustrato o espacio depende de si el mismo sustrato está libre de patógenos (sustrato estéril) o si hay una micobiota natural. En el primer caso, la velocidad de crecimiento del antagonista no determina la colonización efectiva de los nichos, sino la aplicación uniforme del mismo en todo el sustrato. Sin embargo, en el segundo caso la velocidad de crecimiento, conjuntamente con otros de los mecanismos de acción del antagonista, es determinante en el biocontrol del patógeno y colonización del sustrato. Un ejemplo fehaciente de estas interacciones es el notificado por Durman et al. (2003), quienes encontraron una disminución del crecimiento de Rhizoctonia solani y de la viabilidad de los esclerocios por la acción de diferentes aislamientos de Trichoderma spp. b) Micoparasitismo El micoparasitismo es definido como una simbiosis antagónica entre organismos, en el que generalmente están implicadas enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, y que 15

25 se corresponden con la composición y estructura de las paredes celulares de los hongos parasitados (Lorito, 1990). Las especies de Trichoderma durante el proceso de micoparasitismo crecen quimiotrópicamente hacia el hospedante, se adhieren a las hifas del mismo, se enrollan en ellas frecuentemente y las penetran en ocasiones. La degradación de las paredes celulares del hospedante se observa en los estados tardíos del proceso parasítico, que conlleva al debilitamiento casi total del fitopatógeno (Carsolio, 1999). El micoparasitismo como mecanismo de acción antagónica en Trichoderma spp. ha sido ampliamente estudiado, (Pérez 2004). No obstante, existen aspectos en el mismo que no están totalmente esclarecidos. Este es un proceso complejo que para su estudio se ha separado en cuatro etapas. El desarrollo de cada etapa depende de los hongos involucrados, de la acción biotrófica o necrotrófica del antagonista y de las condiciones ambientales. (Chet y Benhamou, 1998), explican detalladamente cada una de estas etapas, para el caso de las especies de Trichoderma. b) Crecimiento quimiotrófico El quimiotropismo positivo es el crecimiento directo hacia un estímulo químico. En la etapa de localización del hospedante, se ha demostrado que Trichoderma puede detectarlo a distancia y sus hifas crecen en dirección al patógeno como respuesta a un estímulo químico (Chet, 1994). d) Reconocimiento Las investigaciones realizadas a lo largo de muchos años con un número considerable de cepas de Trichoderma y de especies de hongos fitopatógenos han demostrado que estas son efectivas sólo contra patógenos específicos. El conocimiento de esta especificidad condujo a la idea de que el reconocimiento molecular entre Trichoderma y el hospedante es el evento esencial que precede al proceso antagonista (Chet y Benhamou, 1998). Esto es un elemento a tener en cuenta para la aplicación práctica de este hongo, y para la búsqueda de nuevos aislamientos más adaptados y eficaces como un proceso continúo. 16

26 El reconocimiento se realiza a través de interacciones lectinas-carbohidratos. Las lectinas son proteínas enlazadas a azúcares o glicoproteínas, las cuales aglutinan células y están involucradas en las interacciones entre los componentes de la superficie de las células y su ambiente extracelular, citado por Chet et al. 1998). La producción de lectinas se ha investigado en Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii. En todos los casos se encontraron evidencias directas, de que las lectinas están involucradas en el micoparasitismo (Chet e Inbar, 1994). e) Adhesión y enrollamiento Cuando la respuesta de reconocimiento es positiva, las hifas de Trichoderma se adhieren a las del hospedante mediante la formación de estructuras parecidas a ganchos y apresorios (Figura 2), se enrollan alrededor de estas, todo esto está mediado por procesos enzimáticos (Pérez, 2004). Según Chet y Elad (1983), citado por Martínez (Martínez, 1994) la adherencia de las hifas de Trichoderma ocurre gracias a la asociación de un azúcar de la pared del antagonista con una pectina presente en la pared del patógeno. Figura 2. Hifas de Trichoderma sp. enrolladas en hifas de Curvularia sp. 17

27 f) Actividad lítica En esta etapa ocurre la producción de enzimas líticas extracelulares, fundamentalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, que degradan las paredes celulares del hospedante y posibilitan la penetración de las hifas del antagonista (Haram,1996). Por los puntos de contacto donde se produce la lisis y aparecen los orificios, penetra la hifa del micoparásito en las del hongo hospedante. La actividad enzimática en Trichoderma ha sido estudiada extensamente, así como las posibles funciones que desenvuelven en el micoparasitismo. Las especies de Trichoderma tienen un elevado potencial parasítico (Figura 3), con una actividad metabólica muy particular, que les permite parasitar eficientemente las estructuras fúngicas de los hongos (Sandoval y López, 2002). Figura 3. Micoparasitismo de Trichoderma sp. en Rhizoctonia sp. Trichoderma excreta muchos metabolitos dentro de ellos enzimas (celulasas, glucanasas, lipasas, proteasas y quitinasas) que participan en la lisis de la pared celular de las hifas del hospedante, facilitando la inserción de estructuras especializadas y de hifas de Trichoderma, que absorben nutrientes del interior del hongo fitopatógeno Eveleig et al., 1986,. Misaghi (1984) y Adams (1990) citados por Díaz (1994), plantearon que el micoparasitismo finalmente termina con la pérdida del contenido citoplasmático de la célula del hospedante. El citoplasma restante está principalmente rodeando las hifas invasoras, mostrando síntomas de disgregación, lo que disminuye la actividad patogénica del mismo. 18

28 Desde el punto de vista práctico las enzimas se tienen en cuenta como criterio en la selección de aislamientos. Elad. (1983), encontraron que los aislamientos de Trichoderma eficaces en el control de patógenos vegetales eran capaces de producir glucanasas, quitinasas y proteasas, por lo que recomienda que los aislamientos de Trichoderma spp. pueden ser seleccionados como agentes de control biológico en base a su capacidad de producir α1,3-d glucanasa y quitinasa en presencia de glucano y quitina, respectivamente. Por los resultados que se han obtenido hasta el momento, se ha llegado a la conclusión que la producción aspecto que reafirma una vez más la búsqueda constante de nuevos aislamientos de este antagonista (Díaz del factor inhibidor en Trichoderma depende más del aislamiento que de la propia especie;, 1994). Liu y Baker (1980) citados por Díaz (1994), plantearon que el micoparasitismo de Trichoderma sobre Rhizoctonia solani es el responsable de la disminución de la densidad de inóculo de este patógeno y que se corresponde con un incremento en la densidad de población de Trichoderma sp. Diferentes autores han informado para Trichoderma diferentes tipos de interacción hifal como parasitismo, considerándolos una potencialidad para su uso como biorreguladores de hongos del suelo (Correa, 1997). Bernal (2004), encontró enrollamiento y penetración de hifas de Trichoderma en hifas de F. oxysporum f. sp. cubense. Harman (2001), encontró penetración en hifas de Pythium sp. y R. solani. Rivero et al. (2008), evaluaron cuatro aislamientos de Trichoderma sobre Alternaria padwickii (Ganguly) Ellis, Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker, Curvularia lunata (Wakker) Boedijn y Phoma sp. y obtuvieron una alta capacidad competitiva, con dos o más tipos de interacción hifal, excepto en Phoma sp. g) Antibiosis La antibiosis es la acción directa de antibióticos o metabolitos tóxicos producidos por un microorganismo sobre otro sensible a estos. Algunos autores opinan que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de acción de un antagonista, ya que existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno resistentes al antibiótico (Rivero et al., 1999). En la práctica uno de los antecedentes ha sido el caso de la aparición de cepas de Agrobacterium tumesfaciens Smith y 19

29 Townsend resistentes al Agrosin 84, un antibiótico producido por una cepa de Agrobacterium radiobacter Beijerinck y van Del- den (Campbell, 1989). Muchas cepas de Trichoderma producen metabolitos secundarios volátiles y no volátiles, algunos de los cuales inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen contacto físico. Tales sustancias inhibidoras son consideradas "antibióticos" (Hjeljord y Tronsmo, 1998). Al inicio se estimó que la actividad inhibidora de aislamientos de Trichoderma sobre otros hongos se debía solo a compuestos no volátiles. Dennis y Webster (1971), fueron los pioneros en esta temática, con la realización de los trabajos más completos acerca de la función de los antibióticos producidos por hongos del género Trichoderma sobre patógenos de las plantas. Ellos relacionaron la actividad antibiótica de Trichoderma spp. con compuestos no volátiles, entre los que se encontraban uno identificado como Trichoderma y otros metabolitos peptídicos. En investigaciones posteriores Webster y Lomas (1964) citados por Díaz (1994), determinaron que Trichoderma sp. produce dos antibióticos más: gliotoxina y viridina. Más tarde (Martínez, 1998), informaron que T. harzianum Rifai produce numerosos antibióticos como son: suzukacilina, alameticina, dermadina, trichotecenos y trichorzianina. Posteriormente, Dennis y Webster (1971), detectaron que la actividad antibiótica de algunos aislamientos se debía también a la producción de compuestos volátiles, y notaron que los aislamientos más activos poseían un fuerte olor a coco, posiblemente relacionado con la actividad antagonista. Los antibióticos volátiles tienen un efecto esencialmente fungistático, debilitando al patógeno y lo hacen más sensible a los antibióticos no volátiles, lo que se conoce como un "hiperparasitismo" de origen enzimático (Martínez et al., 1994). Stefanova et al. (1999), informaron la presencia de metabolitos no volátiles con actividad antifúngica en cuatro aislamientos de Trichoderma y concluyeron que los mismos reducen el crecimiento micelial de Phytophthora nicotianae Breda de Haan y R. solani en medios de cultivo envenenado con filtrados líquidos donde se habían cultivado las cepas antagónicas. Plantean además, que al parecer estos causan a nivel celular: vacuolización, granulación, coagulación, desintegración y lisis. Por otro método, (Rivero, 2008), evaluaron el efecto de 20

30 antibiosis de dos aislados de Trichoderma en cultivo dual con Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Curvularia lunata y Phoma sp., obteniendo inhibición significativa del crecimiento radial de estos patógenos. Algunas de las enzimas no solo intervienen en el proceso de penetración y lisis, sino que actúan también como antibióticos, tal es el caso de la enzima endoquitinasa (Ech42) que causa hidrólisis en las paredes de Botritys cinerea, y además inhibe la germinación de conidios y el crecimiento de tubos germinativos de varios hongos (Benhamou y Carsolio, 1996). La producción metabólica de los aislamientos de Trichoderma presenta, al igual que el micoparasitismo, determinada especificidad. Samuels (1996), informó sobre un grupo de cepas de Trichoderma denominado "Q" que produjeron gliotoxina y fueron efectivas frente a R. solani, pero no frente a Pythium ultimum Trow; mientras que otro grupo de cepas "P", que excretaron gliovirina mostraron resultados opuestos. No obstante, la máxima eficacia pudiera lograrse con el sistema enzimático completo (Lorito et al., 1990), inclusive la selección tiene que ser más integral, donde intervengan diferentes modos de acción. Por ejemplo, Martínez y Reyes (2008), observaron al evaluar 59 aislamientos de Trichoderma, competencia por el sustrato, micoparasitismo y antibiosis. En casi todos los aislamientos determinaron al menos un tipo de interacción hifal bien definida, y algunos de ellos presentaron hasta cuatro tipos de interacción sobre R. solani. Esto favorece el control por un lado y disminuye la posibilidad de que surja resistencia en el patógeno al antagonista (Vero y Mondino, 1999). Los metabolitos secundarios de los hongos filamentosos son compuestos que poseen estructura química muy diferente a la de los metabolitos primarios, como lo son, azucares, aminoácidos y ácidos orgánicos. Los metabolitos secundarios no son esenciales para el crecimiento en el cultivo de producción, pero sirven en diversas funciones para la supervivencia en la naturaleza. Estos metabolitos secundarios, en contraste a la naturaleza general de los metabolitos primarios, son producidos por especies de un género y para algunas especies por determinadas cepas, únicamente. Muchos de los microorganismos que 21

31 producen metabolitos secundarios poseen una compleja diferenciación morfológica (Sutton, 1996). De los 100,000 productos naturales producidos por microorganismos y plantas, alrededor de 50,000 son producidos por microorganismos (Sutton, 1996). En condiciones ambientales apropiadas, existen mecanismos fungistáticos que impiden el desarrollo de los hongos fitopatogenos, los hongos del género Trichoderma tienen la capacidad para sintetizar sustancias volátiles tales como (dióxido de carbono, etanol, acetaldehído, acetona, propanol, isobutanol e isopentanol) involucradas en el complejo responsable de evitar el fenómeno antes mencionado. La antibiosis es el fenómeno mediante el cual un hongo antagonista inhibe o destruye a un organismo a través de la antagonista inhibe o destruye a un organismo a través de la producción de moléculas tóxicas, volátiles y de enzimas ( Baker y Griffin, 1995; Goldman et al., 1994). Entre mayor sea la cantidad de productos metabólicos, el poder antagónico se incrementa ( Pezet et al., 1999).. Se han reportado diferentes metabolitos producidos por Trichoderma: furanona, trichorziaminas, 6-pentyl-α-pirona, que tiene efectos antagónicos sobre los hongos fitopatógenos: Pythium ultimum Trow, Sclerotium rolfsii Sacc., y Rhizocnia solani kühn, entre otros (Hovath et al., 1995; Howell et al., 1993; Ordentlich et al., 1992; Pavlovicova, 1998; Wilhite y Straney, 1996). Entre los metabolitos volátiles que produce Trichoderma spp., el 6- pentil alfa pirona (6PAP) es el más conocido y estudiado (Collins y Halim, 1994). La habilidad para producirlo es muy variada entre las diferentes especies, aun entre cepas de la misma especie (Cooney et al., 1997)Su toxicidad está relacionada con su habilidad hidrofóbica de absorberse dentro de las membranas celulares, formando una capa hidrorepelente sobre la pared celular, que impide la adsorción de agua por la célula del hongo (Scarselletti y Faull, 1994). El 6PAP mostró ser promisorio in vitro y también in vivo en el control de muchos hongos en Nueva Zelanda, entre ellos Armillaria, Botrytis y Phytophthora (Cutler y Hill, 1994), es efectivo en tratamientos tópicos como el control de B. cinerea Pers.:Fr. que causa pudrición en kiwi [ Actinidia deliciosa (A. Chev.) C.F. 22

32 2.5 Importancia del jitomate El jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es una hortaliza con importancia a nivel nacional e internacional debido a su alta demanda, con mercado para uso fresco e industrializado (Rodríguez, 2006). La FAO en sus registros ubica a China como el principal país productor de jitomate con 35 millones de toneladas. México ocupa el décimo lugar con una producción de tres millones de toneladas anuales (FAOSTAT, 2006). En México el jitomate tiene importancia tradicional en la dieta alimenticia, siendo principalmente consumido en fresco (Rodríguez, 2006). Los principales estados productores de jitomate en México son; Sinaloa, Baja California, Michoacán, San Luis Potosí, Jalisco, Nayarit y Morelos. La producción se distribuye en los ciclos otoño-invierno y primavera-verano, de tal manera que la producción de jitomate en el país es todo el año (Ascencio-Alvarez et al., 2008). La producción mundial de tomate (tanto fresco como procesado) alcanzó 108 millones de toneladas en el año 2002, lo que implica un crecimiento del 291% sobre el total producido en el año En el mismo período , el rendimiento promedio mundial del tomate por unidad de superficie incrementó un 64%, llegando a las 36 tn/ha. La mayor parte del incremento de la producción se concentró en Asia, región que participó con un 50% de la producción global en La producción nacional de jitomates se encuentra en todos los estados del país, pero la mayor producción se ubica en los estados del Noroeste de México (Figura 4). Figura 4. Distribución geográfica del cultivo de tomate en el país 23

33 Figura 5. Porcentaje de producción en los últimos años de tomate Uno de los fitopatógenos que afecta al jitomate es Fusarium. Para el control de las enfermedades fungosas en el cultivo de jitomate se han utilizado tradicionalmente fungicidas sintéticos, ocasionando reportes frecuentes, de efectos adversos en el ambiente, la salud del hombre, así como menor efectividad de los mismos, debido a la aparición de cepas resistentes. Fusarium es un hongo filamentoso ampliamente distribuido en el suelo y en asociación con plantas. La mayoría de las especies son saprofitas y son unos miembros relativamente abundantes de la microbiota del suelo. Las esporas del hongo son fácilmente reconocibles al microscopio por su forma de media luna o de canoa. Algunas especies producen micotoxinas en los cereales y que pueden afectar a la salud de personas y animales si estas entran en la cadena alimentaria. La principal toxina producida por estas especies de Fusarium son fumonisinas y trichothecenos. Dentro de la agricultura el cultivo de tomate Solanum lycopersicum, es el que se ve más afectado por este hongo patógeno. Es una planta de la familia Solanaceae, originaria de América y cultivada en todo el mundo por su fruto comestible, llamado tomate (o jitomate en el sur y centro de México). Dicho fruto es una baya muy coloreada, típicamente de tonos que van del amarillento al rojo, debido a la presencia de los pigmentos licopeno y caroteno. Posee un sabor ligeramente ácido, mide de 1 a 2 cm de diámetro en las especies silvestres, y es mucho más grande en las variedades cultivadas. 24

34 Enfermedades en cultivos de jitomate. Una de las enfermedades que más afecta el cultivo del tomate es la marchitez ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Esta enfermedad se encuentra distribuida en todo el mundo causando grandes pérdidas en el cultivo de tomate. El hongo sobrevive en restos de cultivo de una temporada a otra y posee estructuras de resistencia que le permiten perdurar en el suelo por espacio de 6 años. Es favorecido por temperaturas cálidas (20º C) asociada a alta humedad relativa. El hongo penetra en la planta a nivel del suelo ya sea por el tallo o raíces superficiales, luego por los haces vasculares es trasladado a toda la planta. Existen tres razas del hongo numeradas del uno al tres, esto obedece al orden cronológico en que fueron descubiertas. El manejo de esta enfermedad es basado en la siembra de variedades resistentes. (Jansse, 2002) Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici pertenece a la clase Deuteromycete, este presenta numerosas estructuras llamadas esporodoquios donde se agrupan las esporas. Produce tres tipos de esporas asexuales, microconidios, que tiene de una a dos células, son las que se producen con mayor frecuencia y abundancia en todas las condiciones. Macroconidios, que son las esporas típicas de Fusarium, están constituidas de 3 a 5 células, se adelgaza gradualmente y se encorvan hacia ambos extremos. Aparecen con gran frecuencia sobre la superficie de plantas que han sido destruidas por el patógeno, se forman en grupos similares a los esporodoquios, son las clamidiosporas, que están constituidas por una o dos células, con la pared gruesa y con esporas redondas que se forman terminal o intercaladamente en el micelio más viejo o en los macroconidios y este sobreviven durante más tiempo en el suelo. (Rivera,1991)El micelio es incoloro al principio, posteriormente un color crema o amarillo pálido y bajo ciertas condiciones adquiere una tonalidad rosa pálido o algo púrpura (Figura. 6). 25

35 Figura 6: Macro y micro conidias de Fusarium oxysporum Síntomas en las plantas Produce marchitamientos vasculares principalmente en flores y hortalizas anuales, plantas herbáceas perennes de ornato, plantas de cultivo, malezas. Diferentes plantas hospedantes son atacadas por formas especiales o razas del hongo (Agrios, 1998). Lo primero que se observa a campo es un amarillamiento en las hojas básales posteriormente se marchitan se secan pero permanecen adheridas a la planta. Esta sintomatología va progresando hacía la parte superior de la planta a veces sólo toma un sector de la misma. Al comienzo las plantas muestran marchitez en las horas más calurosas del día recuperándose al final del mismo pero finalmente se marchitan y mueren. Las raíces principales y la base del tallo presentan necrosis vascular. Cuando se corta el tallo se observa el sistema vascular de color marrón. (Agrios, 1998). El micelio del hongo se propaga intercelularmente a través de la corteza de la raíz y cuando llega a los vasos xilémicos, entra en ellos a través de punteaduras. Se mantiene vieja a través de ellos, en sentido ascendente, hacia el tallo y la corona de la planta. Al encontrarse con los vasos, dicho micelio se ramifica y produce microconidios que son desprendidos y llevados hacia la parte superior de la planta en el torrente de savia estos germinan conforme avanza. 26

36 Figura 7. Plantas marchitas por Fusarium oxysporum f. sp lycopersici Manejo de la enfermedad Después que el hongo penetra al tejido vegetal, no existe control químico efectivo para esta enfermedad. La utilización de variedades resistentes es la medida más adecuada para el manejo de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. En el mercado existen variedades con resistencia a las razas 1 y 2 y en menor proporción a la raza 3. Esta resistencia puede perderse cuando se producen heridas ya sea por nematodos o por el laboreo. Por lo tanto, el suelo libre de nematodos así como evitar la rotura de raíces al laborear el suelo contribuirá a mantener la sanidad del cultivo. Las plantas enfermas deben eliminarse lo más pronto posible a efectos de reducir el inoculó. Las rotaciones con cultivos no huéspedes como el caso de lechuga, acelga, entre otros son necesarias para el manejo adecuado de la enfermedad. 27

37 3. Metodología 28

38 El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CEPROBI) en los periodos comprendidos Enero- Febrero y Julio-Agosto del El diagrama experimental de la Figura 8. Preparación de sustrato para siembra de Trichoderma Preparación de medio PDA Siembra de Fusarium oxysporum Después de 9 días de la siembra de Trichoderma confrontación del patógeno contra el antagonista Sustrato para Trichoderma PDA Trichoderma asperellum Fusarium oxysporum Confrontación Crecimiento micelial Repetir a 15 y 21 días Evaluación 9 días Analisis de resultados. Analisis estadisticos Figura. 8 Diagrama de trabajo para determinar el efecto de los metabolitos volátiles de Trichoderma asperellum TC 74 sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum. f. sp. lycopersici Raza 3. 29

39 3.1 Material biológico Para el experimento se utilizaron cepas de los hongos Trichoderma asperellum Tc74 y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Raza 3 (Fol) (aislado de tomate cultivado en el municipio de Emiliano Zapata en el estado de Morelos) proporcionadas por la M. en C. Leticia Bravo Luna del Laboratorio de Fitopatología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en Yautepec, Morelos. 3.2 Preparación de sustrato para siembra de Trichoderma En un molino para grano de motor se molió trigo hasta obtener un triturado del trigo, posteriormente se colocaron 600 g de trigo molido en un vaso de precipitado de 1000 ml y se le adicionó agua destilada hasta alcanzar el volumen de 900 ml, se dejó reposar durante 24 horas, posteriormente en un matraz el sustrato se preparó al 1% con agua destilada y se agregó agar-agar (0.22 g en 15 ml). Esta operación se repitió hasta completar 20 matraces). Se taparon con papel aluminio y se agitaron para homogeneizar la mezcla. Posteriormente se colocaron en autoclave para su esterilización (121 C por 15 min). 3.3 Siembra de Trichoderma Tc74 en matraces con sustrato La siembra se llevó a cabo en una campana de flujo laminar, con un horadador estéril se realizaron cortes 5 mm de diámetro de crecimiento micelial de T. asperellum Tc74 y con la ayuda de una aguja estéril se tomó el disco y se sembró en el centro de cada matraz con sustrato enseguida se taparon con papel aluminio. Se observó el crecimiento de Trichoderma en los matraces cada 24 hrs durante 6 días que eran los días en los que el testigo llegaba a su máximo crecimiento micelial. 30

40 3.4 Preparación de medio PDA En un matraces de 125 ml se preparó 15 ml de medio de cultivo agar dextrosa y papa (PDA) siguiendo las instrucciones del fabricante (39 g de PDA para 1000 ml de agua destilada estéril), la operación se repitió hasta completar 10 matraces. Los matraces se taparon con papel aluminio y se esterilizaron en las condiciones ya descritas Siembra de Fusarium oxysporum. La siembra de Fusarium se realizó en campana de flujo laminar, empleando horadador estéril para cortar discos de 5 mm de diámetro de crecimiento micelial de Fusarium de 8 días de incubación, posteriormente con la ayuda de una aguja estéril, se tomó el disco y se colocó en el centro del matraz con medio de cultivo PDA y se tapó con papel aluminio. Fusarium se realizó dos días antes del tratamiento con Trichoderma para que el disco quedara fijo en el medio y no se cayera al momento de confrontar los matraces. 3.5 Confrontación de Trichoderma y Fusarium. A los 9, 15 y 21 días de crecimiento de T. asperellum se confrontó con F. oxysporum, para lo cual en una campana de flujo laminar a los matraces inoculados con Trichoderma se les retiró el papel aluminio y se les colocó sobre la boca un circulo de papel filtro y sobre este se colocó el matraz inoculado con Fusarium quedando unidos por las bocas y sellaron con cinta adherible para que estos quedaran fijos (Figura 9). Figura 9. Confrontación de matraces en la campana de flujo laminar 31

41 Posteriormente se fotografiaron los matraces que contenían inoculado al patógeno mediante el análisis de la imagen se determinó el área de crecimiento micelia utilizando el programal Image J V El testigo fue la confrontación de Fusarium frente a un matraz que contenía únicamente el sustrato de trigo. Se hicieron 5 repeticiones por tratamiento. 3.6 Análisis estadístico Los datos generados del área de crecimiento micelial se analizaron bajo una prueba de t, el objetivo de la prueba es determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en el promedio de una variable de escala de acuerdo a las categorías de una variable categórica y si la existe definir cuál de las medias es mayor. Además se realizó una regresión lineal (anexos) simple para determinar la tasa de crecimiento mediante la pendiente de la recta, estos análisis se realizaron en el programa estadístico Sigma Stat

42 4. RESULTADOS Y DISCUSIONES 33

43 Crecimiento micelial (cm2) 4.1 Resultados de la confrontación a los 9 días. Los resultados de la confrontación de Trichoderma asperellum Tc74 incubado durante 9 días contra fusarium oxysporum f sp. lycopersici raza 3 (Fol), no hubo diferencias significativas en el crecimiento micelial p=0.151 (Figura 10.) a 15 Testigo Trichoderma Vs Fol Día 9 Figura10. Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol) confrontados a los 9 días de incubación de Trichoderma. a= NS 34

44 Crecimiento micelial (cm 2 ) Así mismo las tasas de crecimiento no presentaron diferencias significativas p=0.192 (Figura.11) Tc= a 20 Tc= a Trichoderma Vs Fol Testigo Tiempo (hrs) Figura 11. Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum Tc74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 9 de incubación de Trichoderma p=

45 Crecimiento micelial (cm 2 ) 4.2 Resultados de la confrontación a los 15 días. Los resultados de la confrontación de Trichoderma Tc74 incubado durante 15 días contra Fol, hubo diferencias significativas en el crecimiento micelial p=0.005 (Figura 12), el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial que ejercieron los compuestos volátiles de Trichoderma sobre Fol fue de 51.71% b Testigo Trichoderma Vs Fol Día 15 Figura 12. Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3(Fol) confrontados a los 15 días de incubación de Trichoderma. b=

46 Crecimiento micelial (cm2) En Las tasas de crecimiento también presentaron diferencias significativas p 0.001, que en caso de la confrontación Trichoderma-Fol fue de 2.54 cm 2 por día y la tasa de crecimiento del testigo fue de 7.37 cm 2 por día (Figura 13.) 45 Tc= a Tc= b Trichoderma vs Fol Testigo Tiempo (hrs) Figura 13. Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum Tc74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 15 de incubación de Trichoderma.p= <

47 Crecimiento micelial (cm2) 4.3 Resultados de la confrontación a los 21 días. Los resultados de la confrontación de Trichoderma Tc74 incubado durante 21 días contra Fol, hubo diferencias significativas en el crecimiento micelial p=0.01 (Figura 14), el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial que ejercieron los compuestos volátiles de Trichoderma sobre Fol fue de 32.42% b Testigo Trichoderma Vs Fol Día 21 Figura 14. Efecto de compuestos volátiles de Trichoderma asperellum Tc74 sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol) confrontados a los 21 días de incubación de Trichoderma. b=

48 Crecimiento micelial (cm2) En Las tasas de crecimiento también presentaron diferencias significativas p=0.001, que en caso de la confrontación Trichoderma-Fol fue de 4.26 cm 2 por día y la tasa de crecimiento del testigo fue de 7.37 cm 2 por día (Figura 15.) 45 Tc= a Tc= b Trichoderma vs Fol Testigo Tiempo (hrs) Figura 15. Dinámica de crecimiento micelial y tasa de crecimiento (Tc) de Trichoderma asperellum Tc74 contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Fol), confrontación en el día 21 de incubación de Trichoderma. p=

49 Crecimiento micelial (cm2) Testigo Trichoderma vs Fol dia 9 dia 15 dia 21 Figura 16. Comparación grafica de cada tratamiento. 40