EL ESTUDIO DEL ADN EN RESTOS ÓSEOS ANTIGUOS

Transcripción

1 EL ESTUDIO DEL ADN EN RESTOS ÓSEOS ANTIGUOS Tras el estudio antropológico de los restos óseos, durante el cual se individualizaron los sujetos presentes en cada tumba, y realizado el análisis por escáner, se procedió al estudio genético de piezas seleccionadas específicamente para tal fin. El estudio de ADN antiguo (ADNa) reviste ciertas dificultades y peculiaridades que le son típicas y que deben ser tenidas en cuenta siempre. En resumen, estos problemas son el daño de la molécula de ADN por diversas causas, el alto riesgo de contaminación con ADN de fuentes exógenas, y una vez recuperado el ADN, el impedimento de su estudio mediante las técnicas básicas de la biología molecular (inhibición de la amplificación del ADN). En muchos casos, es posible superar estas dificultades mediante la adopción de metodologías y estrategias de trabajo especiales y adaptadas a las condiciones de estas muestras únicas. El estudio de ADN a partir de restos óseos incluye las etapas de Selección de las muestras más idóneas para el estudio de ADN; Limpieza, corte y pulverizado de la muestra; Extracción de ADN y Análisis genéticos. Antes de detallar cada una de estas etapas, es importante destacar que una de las condiciones básicas en el trabajo con restos óseos antiguos y que tiene que ver con la estructura del laboratorio, es la delimitación de zonas de trabajo para cada etapa. En nuestro laboratorio se dispone de un cuarto dedicado exclusivamente a la limpieza, lijado, corte y pulverizado de los restos óseos, un laboratorio de extracción de ADN, un laboratorio de pre-amplificación y un laboratorio de post-amplificador equipado con un secuenciador automático. Selección de muestras para el estudio de ADN. Es difícil estimar la preservación del ADN alojado en el entramado de hidroxiapatita del hueso o diente mediante la simple inspección macroscópica del espécimen. Sin embargo, existen ciertas características que son indicativas de un buen estado de conservación: los huesos deben ser duros y pesados y de estructura compacta, y no presentar fisuras o resquebrajamiento de la superficie cortical. Los dientes que darán mejores resultados serán aquellos sin fisuras o tratamientos dentales, que conserven el brillo del esmalte y con las raíces intactas. En general, los que aún se encuentren incluidos en los alvéolos del hueso estarán mejor conservados. Dentro del conjunto de restos incluidos en el Proyecto de los Reyes de Aragón, nos hemos encontrado con una gran variedad de condiciones de preservación de huesos y dientes. Ver Figura 1. Las piezas esqueléticas de elección para los análisis de ADN son preferentemente las piezas dentales de apariencia exterior intacta, y los huesos largos (fémur, tibia), por presentar una gruesa cortical en la diáfisis con abundante tejido óseo compacto. En los casos en los que las piezas anteriormente mencionadas no estaban disponibles, se seleccionaron aquellos huesos que estuvieran en mejor estado. Así, durante el transcurso de los análisis en el laboratorio, también hemos tomado muestras de huesos tales como costillas, radio, peroné, astrágalo.

2 FIGURA 1. Diferentes estados de preservación de los restos óseos del Proyecto de los Reyes de Aragón. (a) Fémur adulto en muy buen estado de conservación (coloración, densidad y aspecto general normal); (b) Fémur adulto en mal estado de conservación (coloración oscura, brillo conferido por una resina sintética utilizada para su consolidación y preservación; (c) Mandíbula en muy buen estado de conservación, con todas las piezas dentales en su sitio y con un grado moderado de desgaste; (d) Fragmento de mandíbula en muy mal estado de conservación (ausencia de piezas dentales, coloración oscura, resquebrajamiento de la superficie); (e) Molares aislados en muy buen estado (raíces enteras, esmalte conservado y con brillo natural, coloración normal); (f y g) Molares aislados en mal estado de conservación (excesivo desgaste del esmalte, raíces incompletas, coloración oscura).

3 Limpieza, corte y pulverizado de la muestra El ADN exógeno (de origen humano o no) que una muestra pueda contener, es considerado contaminación y es generalmente eliminado por abrasión (por lijado o raspado) de la superficie del hueso. En primer lugar y para asegurar una eliminación completa de la suciedad y posible ADN exógeno contaminante de la superficie de la pieza elegida, sea ésta hueso o diente, es necesario descartar la capa más superficial y llevar a cabo una limpieza exhaustiva de la misma. Para ello, se realiza la abrasión de la superficie, bien manualmente o utilizando un mini-taladro con un cabezal adecuado para lijar. En este paso, se eliminan entre 2 y 3 mm de espesor de la cortical. Ver Figura 2. Una vez lijado, se realiza el corte de pequeñas porciones de hueso (lo mínimo necesario para asegurar los estudios de ADN y los estudios complementarios) utilizando un mini-taladro con sierra. Todo este proceso produce una enorme cantidad de polvo y por lo tanto debe ser realizado en un espacio ventilado y exclusivamente dedicado para este fin (las normas de protección de operario y de control de contaminación pueden encontrarse aquí. Después de cortada la muestra, se realizan lavados rápidos con agua destilada autoclavada, hipoclortito de sodio al 10% y etanol, sucesivamente, y se deja secar. Posteriormente, las muestras serán pulverizadas en un mortero magnético conteniendo nitrógeno líquido. Ver Figura 2. FIGURA 2. Proceso de lijado, corte y pulverizado de las muestras óseas previo al estudio de ADN. (a) Lijado de la superficie; (b) Detalle de la superficie después del lijado; (c) Corte de fémur; (d) Mortero magnético de nitrógeno líquido utilizado en la pulverización de las muestras.

4 Extracción ADN El primer paso en cualquier técnica para el estudio de ácidos nucleicos consiste en liberar el ADN de su entramado biológico o del soporte en el que se encuentre. En el caso de huesos y dientes, esto supone romper una barrera física de tejido mineralizado que no existe en otros tipos de muestras. En general, se realiza un paso de desmineralización por el que se destruye la matriz mineral, seguido de pasos de lisis celular para dejar el ADN libre en solución que puede ser extraído por diferentes métodos (extracción orgánica, adsorción a partículas de sílice, etc.). En los restos de los Reyes de Aragón se ha utilizado preferentemente un método de adsorción a partículas de sílice, que en nuestro laboratorio ha demostrado ser el que presenta mayores rendimientos de ADN por gramos de hueso, y el que proporciona un ADN de mejor calidad. Una vez extraído el ADN es esencial cuantificarlo, ya que la cantidad de ADN obtenida determinará los siguientes pasos del proceso. En nuestro laboratorio, realizamos la cuantificación mediante PCR en tiempo real utilizando un sistema que nos permite, no sólo conocer la cantidad de ADN sino también evaluar su calidad en términos de presencia o ausencia de sustancias inhibidoras de la amplificación que pudieran haberse extraído junto con el ADN. En aquellos casos en los que se detectó inhibición, los extractos de ADN fueron tratados con diferentes métodos para intentar eliminarla. Análisis Genéticos En los restos de los Reyes de Aragón se han realizado múltiples análisis genéticos con el fin de caracterizar genéticamente a cada individuo e intentar establecer relaciones de parentesco. Se han obtenido perfiles genéticos completos de algunos individuos cuyos restos presentaban un grado muy bueno de conservación, y que han sido confirmados por otros investigadores en laboratorios tanto nacionales como internacionales. Esto tiene una gran relevancia ya que se trataría de los primeros datos genéticos que se obtienen de la Familia Real de Aragón. No obstante, dada la antigüedad y el estado de conservación de los restos disponibles, no todos los casos han sido exitosos para todos los análisis realizados, siendo el escenario más frecuente la obtención de resultados parciales. Esto también ha implicado la necesidad de optimizar los sistemas genéticos disponibles adaptándolos a las condiciones especiales de estas muestras tan antiguas. La Genética Forense es un área del conocimiento que por estar al servicio de las Ciencias Forenses presenta un ritmo vertiginoso de investigación donde se aúnan los esfuerzos de la comunidad forense a nivel mundial y por lo tanto, su evolución continua. En nuestro laboratorio hemos trabajado con los últimos marcadores para el tipado genético validados para humanos, y estamos probando cada día los nuevos sistemas disponibles en el mercado, con el fin de asegurarnos el recabar la máxima información genética posible en las muestras del estudio, en las condiciones actuales. Cabe esperar que en los próximos años se logre rescatar información genética que dadas las condiciones actuales, aún no está a nuestro alcance.

5 Qué estudiamos? En genética forense se estudian zonas polimórficas, o altamente variables, que distinguen a un individuo de otro, o que permiten situarlo dentro de una línea familiar paterna o materna. Las células tienen su información genética, en forma de ADN, contenida dentro del núcleo celular y de las mitocondrias. Tanto el ADN nuclear como el ADN mitocondrial aportan información muy valiosa sobre el individuo, aunque tienen ciertas características que hacen que uno u otro sean de elección en determinadas situaciones. De forma muy resumida podríamos decir que el ADN nuclear será el ADN de preferencia por tener un poder discriminante entre individuos muy superior al del ADN mitocondrial, pero por otro lado el ADN mitocondrial, al ser más resistente a las condiciones ambientales adversas y estar en mayor número de copias por célula, hace posible el estudio genético aún en aquellos casos donde no se ha podido recuperar ADN nuclear. En nuestro laboratorio hemos realizado los siguientes análisis: Ø ADN nuclear: o STRs y mini STRs autosómicos o STRs y mini STRs del cromosoma Y Ø ADN mitocondrial (regiones hipervariables I y II) Ø Análisis complementarios en curso: o Determinación del grupo sanguíneo (ABO) o Estudio de mutaciones puntuales (SNPs) para determinación de características fenotípicas.

6 Perfil de mini STRs (AmpFlSTR MiniFiler PCR Amplification Kit, Applied Biosystems) de restos esqueléticos de un niño de 4 años provenientes del Sarcófago de Doña Sancha, Monasterio de las Benidictinas, Jaca. Este análisis ha permitido establecer el sexo masculino (XY, ver recuadro rojo), que no había podido determinarse con métodos antropológicos por no contar con suficientes elementos óseos.

7 Perfil de mini STRs (AmpFlSTR MiniFiler PCR Amplification Kit, Applied Biosystems) de restos esqueléticos de un individuo de la Tumba 1 del Panteón Real de San Juan de la Peña.

8 Perfil de mini STRs (AmpFlSTR MiniFiler PCR Amplification Kit, Applied Biosystems) de restos esqueléticos de un individuo proveniente del Sarcófago de Doña Sancha, Monasterio de las Benidictinas, Jaca. En este caso, el análisis genético ha confirmado el sexo femenino (XX, ver recuadro rojo), determinado previamente por métodos antropológicos.

9 Fragmento de secuencia de ADN mitocondrial de los restos pertenecientes a un individuo proveniente del Sarcófago de Doña Sancha, Monasterio de las Benedictinas, Jaca.

10 Perfil parcial de STRs del cromosoma Y de los restos de un individuo proveniente del Panteón Real de San Juan de la Peña.

11 Fotografías de diferentes partes del Laboratorio de Genética Forense de la Facultad de Medicina. (A) Termocicladores y equipo de PCR en tiempo real; (B) Cabina de extracción de ADN de restos óseos; (C) Secuenciador Automático y ordenador; (D) Detalle del secuenciador automático.