ESTUDIOS PRELIMINARES DE LOS PARÁMETROS SEMINALES DE UNA ORCA (ORCINUS ORCA).

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIA ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN BOVINA CÓRDOBA (IRAC) ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA ESTUDIOS PRELIMINARES DE LOS PARÁMETROS SEMINALES DE UNA ORCA (ORCINUS ORCA). Med. Vet. Juan Pablo Loureiro CÓRDOBA, 2014

2 INTRODUCCIÓN La orca (Orcinus orca) es el delfín más grande de la actualidad, su nombre científico deriva del latín orca u ork que significa monstruo misterioso de extraño aspecto e inus que es un sufijo que significa parecido o perteneciente a (Bastida y Rodríguez, 2003). Mundialmente se reconoce una única especie cosmopolita, aunque algunos científicos propusieron dos nuevas especies (Orcinus nanus y Orcinus glacialis) producto del análisis de ejemplares capturados en la Antártida (Bastida y Rodríguez, 2003). La orca es probablemente uno de los cetáceos más fácilmente identificable, debido a su coloración característica blanca y negra, los machos adultos llegan a medir hasta 9 metros de longitud, con un peso aproximado de 9 toneladas. Son animales de ciclo de vida largo que maduran sexualmente una vez pasado los 10 años de edad aproximadamente (Bastida y Rodríguez, 2003) En Mundo Marino San Clemente del Tuyú, Buenos Aires Argentina se encuentra un macho de Orca (Orcinus orca) Kshamenk, de 25 años de edad y un peso aproximado de 6 toneladas, maduro sexualmente. Este macho ha sido un ejemplar clave para la investigación de la especie en ambientes controlados, desde estudios de comportamiento hasta el más reciente de reproducción. También cabe destacar la importancia de difusión a nivel educacional que cumple. Estos individuos que se encuentran en ambientes controlados son una esperanza de vida para la especie ya que frente a la problemática ambiental de sobrepesca, degradación del hábitat y contaminación, muchas poblaciones hoy están siendo amenazadas en la naturaleza (Taylor et al., 2013) Loureiro Juan Pablo Página 2

3 La evaluación de la calidad seminal es de gran importancia para la preservación de una especie. Muchos test de laboratorios han sido desarrollados para evaluar la calidad seminal y correlacionarla con la fertilidad futura. Una de las características de los espermatozoides que ha llamado la atención de los investigadores durante mucho tiempo es la motilidad, para cuyo estudio descripción y valoración se han desarrollado varias técnicas (Roberk et al., 2001). El objetivo del presente trabajo es evaluar la calidad seminal y reproductiva de una Orca (Orcinus orca) del hemisferio Sur en un ambiente controlado. Loureiro Juan Pablo Página 3

4 MATERIALES Y MÉTODOS Animal y colección de semen. Mundo Marino cuenta con un único macho de orca (Orcinus orca) (Foto 1) llamado Kshamenk el cual convive con una hembra de delfín nariz de botella (Tursiops truncatus) de nombre Floopy ambos animales de 25 años de edad y sexualmente maduros. (Foto 1: Ejemplar macho de Orcinus orca) Mediante estímulos discriminativos se condicionaron los animales para: 1. Kshamenk se relacione de manera tranquila mediante juegos con Floppy. 2. Floppy acepte y colabore con los juegos de Kshamenk. Loureiro Juan Pablo Página 4

5 3. Diferenciar los juegos de la actividad sexual para reforzar esta última. 4. Condicionar ambos animales para que realicen esta actividad sexual en presencia de los entrenadores en un momento específico del día, no durante toda la jornada, por ejemplo no durante los shows. 5. Entrenarle a Kshamenk que se coloque en posición de roll-over cerca del área de manejo para desensibilizar la zona genital. 6. Kshamenk permita que manipulemos el pene para secar el agua salada y colocar el A.V. (vagina artificial). 7. La obtención y discriminación de las muestras mediante el refuerzo y la constancia. 8. Floppy colabore en todas las instancias del comportamiento. Para la colección del semen se designa un grupo de colección de 4 personas llamado colection team. Una persona controla la posición de Floppy durante el momento de trabajo con el macho y tres personas trabajan con el macho, una que manipula el pene, otra que seca con toallas el agua salada y la tercera persona o líder encargada de colocar el AV (vagina artificial) (Fotos. 2, 3, 4). Los horarios elegidos para realizar el comportamiento fueron por la mañana, en el mismo lugar del predio y respetando siempre la predisposición de los animales. Loureiro Juan Pablo Página 5

6 (Foto. 2) (Foto. 3) (Foto. 4) Loureiro Juan Pablo Página 6

7 Análisis del semen. El análisis de la muestra de semen en el laboratorio se realizó primero en forma macroscópica donde se observaron distintos parámetros como volumen, color, densidad, osmolaridad, ph y cuerpos extraños. Volumen: se observó directamente sobre tubo graduado, teniendo en cuenta que los eyaculados hasta ahora registrados varían entre 1 ml a 42 ml. Color: se consideraron normales los colores que van del blanco al amarillento siendo patológicos los colores rosado, amarronado y verdosos. Densidad: la densidad del semen varía desde un semen acuoso, lechoso cremoso, hasta un cremoso, estando directamente relacionada con la concentración. Osmolaridad: se evaluó con micro osmómetro (the advance tm Micro osmometer). La Osmolaridad aceptada para el semen de un cetáceo es entre 335 a 375 mosm/kg. (Foto 6). Ph: se evaluó extrayendo una gota de semen del tubo y colocándola sobre una tira indicadora de ph. Se considera un ph normal entre 6,8 a 7. Cuerpo extraño: se evaluó observando el fondo del tubo para detectar la presencia de algún cuerpo extraño, se considera como negativo o positivo. Finalizada la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de la muestra de semen. Aquellos parámetros hasta ahora estudiados son motilidad progresiva o motilidad individual, motilidad total, velocidad espermática o vigor, concentración y porcentaje de vivos muertos a través de la coloración vital. M.P. (Motilidad progresiva) o M.I. (Motilidad individual): para realizar esta evaluación se colocó una gota de semen sin diluir en un portaobjeto atemperado de 36 a 37 grados centígrados y se colocó sobre ésta un Loureiro Juan Pablo Página 7

8 cubreobjeto también a la misma temperatura. Se observó al microscópico siempre sobre platina térmica a 400 aumentos, se debe observar un campo y valorar subjetivamente los espermatozoides que se mueven en forma rectilínea progresiva siendo éstos los que atraviesan el campo de observación. Los espermatozoides que giran en círculos o avanzan en forma oscilatoria se consideron que tienen movimientos anormales. El porcentaje que se indicó es el de los espermatozoides con movimiento rectilíneo progresivo del total de espermatozoides aceptados. M.T. (Motilidad total): se evaluó al mismo tiempo que la motilidad individual y se observó la cantidad de espermatozoides que presentan movimiento del total de la muestra. El porcentaje que solo se indica es el de los espermatozoides con movimiento. Velocidad espermática o Vigor: se evaluó el vigor al mismo tiempo que la M.I. y la M.T, teniendo en cuenta la velocidad con la que estos espermatozoides atraviesan el campo. La escala que se utilizó es de 0 a 5 evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 5 los que avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente. Dentro de estos parámetros se consideraron los puntos intermedios. Concentración: para evaluar la concentración, se preparó previamente una solución salina formolada al 2%. Se colocaron 10 microlitros de semen en 2 ml de solución salina formolada (1/200) y se homogenizó invirtiendo el tubo varias veces. Una vez homogenizado, se tomó 14 microlitros aproximadamente y se cargó una cámara de Newbawer por capilaridad, en ambos retículos, teniendo en cuenta de cargar otros 14 microlitros para el otro retículo volviendo a homogenizar entre cada una de las cargas. Nota: para preparar la cámara, se humedecieron los bordes de esta antes de colocar el cubrecamara y luego se presionó ejerciendo una leve fricción para que el cubrecamara quede fijo y al invertir la cámara no se caiga. Una vez cargada la cámara se debe dejar reposar unos minutos para permitir Loureiro Juan Pablo Página 8

9 que todos los espermatozoides decanten y se ubiquen en el mismo plano para contarlos. Luego se procedió a ubicar el retículo de glóbulos rojos a 100 aumentos, y una vez localizados, se pasó a 400 aumentos para realizar el conteo. Se contaron todos los espermatozoides que se encuentran en las cuatro cuadrículas de las puntas y la central (5 en total) teniendo en cuenta de incluir a los espermatozoides sobre 2 de las triples líneas de cada cuadricula ya sea la superior derecha o la izquierda inferior. Se contaron los retículos de ambos lados de la cámara y se sacó un promedio. Al número de espermatozoides contado se lo multiplicó por obteniendo la cantidad de espermatozoides por mililitro cúbico de semen. Coloración Vital o porcentaje de vivos muertos: se realizó extrayendo una gota de aproximadamente 10 microlitros de semen puro y colocándola sobre la punta de un portaobjeto limpio y desengrasado atemperado a 36 a 37 C sobre una platina térmica. Sobre esta gota se colocó una gota de aproximadamente 30 microlitros de eosina que debe estar a la misma temperatura que el semen. Se mezcló suavemente con la punta de la pipeta por aproximadamente 20 segundos. Se utilizó otro portaobjeto también atemperado, y se apoyó sobre el borde de la gota para que por capilaridad se distribuya sobre el porta objeto, se levantó y se desarrolló el extendido en forma firme. El fundamento de la técnica es el siguiente: el colorante penetra la membrana de los espermatozoides muertos, dejando sin teñir los que se encontraban vivos al momento de realizar la tinción. Para sacar el porcentaje de espermatozoides vivos se procedió a observar el frotis a 400 aumentos contando en guarda griega todo los espermatozoides de cada campo evaluado, discriminando los que están teñidos como muertos y los sin teñir como vivos. Se contaron más de 100 células y para obtener el porcentaje. La valoración de la tinción vital se realizó en el mismo día ya Loureiro Juan Pablo Página 9

10 que pasado un determinado tiempo todos los espermatozoides comienzan a teñirse. muestra de semen) (Foto 5: Fotografía microscópica de una (Foto 6: Microsmómetro) Loureiro Juan Pablo Página 10

11 RESULTADOS Se colectaron un total de 110 muestras de semen desde el año 2010 hasta el presente año En la observación macroscópica de los espermatozoides se obtuvieron los valores promedios, máximos y mínimos para cada una de los parámetros evaluados (Tabla 1). Tabla 1: Evaluación macroscópica de los espermatozoides. PARÁMETRO PROMEDIO ± VALOR MÁS VALOR MÁS DESVÍO ESTÁNDAR ALTO BAJO Volumen 8,5 ± 7,2 42 ml 0,4 ml Color 100% blanco Densidad Lechoso- cremoso Osmolaridad 366,5 ± 46,4 687 mosm 338 mosm PH 7,2 ± 0,3 8,4 6,5 Cuerpo extraños 100% negativo Al igual que la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de los espermatozoides (Tabla 2) Loureiro Juan Pablo Página 11

12 Tabla 2: Evaluación microscópica de los espermatozoides. PARÁMETRO Motilidad progresiva PROMEDIO ± DESVÍO VALOR MÁS VALOR MÁS ESTÁNDAR ALTO BAJO 89,0 ± 12,3 98 % 20 % Motilidad total 88,9 ± 11,1 98% 30% Velocidad espermática 4,2± 0,8 5 2 Concentración 1014,3 x 10 6 ± 565,1 x x x 10 6 Porcentaje vivos muertos de 88± 12,6 % 96% 20% DISCUSIÓN y CONCLUSIÓN La colección de semen, a través de condicionamiento operante con refuerzo positivo, es una técnica no invasiva que ha permitido colectar buena calidad y cantidad de semen demostrándose también que es bien tolerada en los Mamíferos Marinos. El análisis de semen es una forma directa de la evaluación de la condición reproductiva de un individuo, cuyo conocimiento es importante para la planificación de la cría y manejo de la población en ambientes controlados. Loureiro Juan Pablo Página 12

13 La importancia de este trabajo es que sienta base de estudio y además permite seguir trabajando y investigando sobre las características reproductivas de la especie orca (Orcinus orca) que en el futuro podrá estar amenazada por el hombre. BIBLIOGRAFÍA Barth, A. D., y Oko, R. J Abnormal morphology of bovine spermatozoa. Lowa St. University Press. Bastida R. y Rodríguez D Mamíferos Marinos de Patagonia y Antártida. Vásquez Manzzini Editores. Buenos Aires Curso de posgrado en Reproducción Bovina Módulo 2 Capacidad Reproductiva del toro. IRAC. Dierauf, L., y Gulland, F. M. (Eds.) CRC handbook of marine mammal medicine: health, disease, and rehabilitation. CRC press. Migliorisis A. L., Loureiro J. P., Balbona J. C., De la Sota R.L. y Loureiro J.D Estudios preliminares de los parámetros seminales de un delfín nariz de botella (Tursiops truncatus gephyreus). 9 Simposio Internacional de Reproducción Animal Córdoba Argentina p.76. Montano, G. A., Kraemer, D. C., Love, C. C., Robeck, T. R. y O'Brien, J. K Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction, 143(6), Loureiro Juan Pablo Página 13

14 Rebollo, J.H., Speciale, M.F., Mininni, D. I, Tompkins, C. D. y Galán, M.A Training a male killer whale (Orcinus orca) for conditioned semen sample collection in Mundo Marino, Argentina IMATA 39 th Annual conference. Salisbury, G; Van Demark, N. y Lodge, J Physiology of Reproduction and Artificial Insemination of Cattle. Ed. Freeman. Taylor, B.L., Baird, R., Barlow, J., Dawson, S.M., Ford, J., Mead, J.G., Notarbartolo di Sciara, G., Wade, P. y Pitman, R.L Orcinus orca. The IUCN Red List of Threatened Species. Version Todd R. Roberk, Shannon K. C. Atkinson, y Fiona Brook Reproduction. En: CRC handbook of marine mammal medicine: health, disease, and rehabilitation. Dierauf, L., y Gulland, F. M. (Eds.). CRC press. Yuen, Q. W., Brook, F. M., Kinoshita, R. E. y Ying, M. T Semen Collection and Ejaculate Characteristics in the Indo Pacific Bottlenose Dolphin (Tursiops aduncus). Journal of andrology, 30(4), Loureiro Juan Pablo Página 14