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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12Q 1/70 C12Q 1/04 C12Q 1/66 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Método y equipos de análisis para la detección de bacteriofagos. k Prioridad: GB k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 73 Titular/es: THE MINISTER OF AGRICULTURE FISHERIES AND FOOD IN HER BRITANNIC MAJESTY S GOVERNMENT OF THE UNITED KINGDOM OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN IRELAND WHITEHALL PLACE London SW1A 2HH, GB k 72 Inventor/es: Sanders, Michael Frederick k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Método y equipos de análisis para la detección de bacteriofagos. La presente invención se refiere a un método para la detección, identificación y/o cuantificación de un bacteriofago (fago o fagos), y a equipos de análisis para su uso en la realización de este método. En particular, el método permite la detección de bacteriofagos específicos para un género, especie o serotipo bacteriano concreto, bien en forma aislada o como contaminantes en muestras del medio ambiente o forenses, o en productos alimenticios. WO describe un método para la detección microbiana que utiliza un bacteriofago para infectar cualquier microbio presente, y posteriormente detecta el bacteriofago utilizando bacterias informadoras que se han manipulado por ingeniería genética de manera que incluyen un gen indicador. La solicitud en trámite WO96931 describe un método para la detección de una bacteria específica que utiliza un bacteriofago para lisar células bacterianas concretas cuyos contenidos pueden detectarse entonces. Aunque a menudo son indeseables, las bacterias tienen también aplicaciones industriales. Está adquiriendo cada vez más importancia el papel de las bacterias en forma de bacterias manipuladas por ingeniería genética en el área de ingeniería genética y particularmente en la producción a gran escala de productos proteicos. Más tradicionalmente se han utilizado en la producción de productos naturales en fermentación, notablemente en la producción de productos de la fermentación del queso y de la leche. La fermentación rápida de lactosa a ácido láctico es la reacción principal en la fabricación de dichos productos derivados de la leche y se inicia por la adición de cultivos iniciadores de especies de bacterias del ácido láctico al substrato leche. En ocasiones, por varias razones, estos cultivos iniciadores fallan y el desarrollo normal de ácido no empieza o no se mantiene. Una de las razones más importantes del fallo del cultivo iniciador es la presencia en la leche de bacteriofago, que se origina a menudo en el ambiente lácteo. Éstos son agentes viralesespecíficos que atacan y matan bacterias, en este caso las del cultivo iniciador. El bacteriofago se reproduce parásitamente en sus huéspedes bacterianos, dando lugar a una progenie de nuevas partículas de fago que se liberan al entorno a través de la lisis de las células bacterianas. Una infección por bacteriofago en una planta láctea resulta en un serio descenso y, en algunos casos, en un fracaso total en la producción de ácido láctico por los cultivos iniciadores. Durante varios años el problema del fago ha sido el más serio de cara al fabricante de queso debido a las pérdidas económicas que conlleva. Éstas incluyen el tiempo perdido en la fabricación, la pérdida de materias primas y del producto subestándar (véase Klaenhammer (1984) Adv. Appl. Microbiol. 46, y Heap & Lawrence (1988) Developments in Food Microbiology, Elsevier). Las técnicas convencionales utilizadas en la industria láctea para la detección de bacteriofago se basan en la tecnología microbiológica convencional, y requieren mucha mano de obra y a la vez consumen mucho tiempo. incluyen la observación de placas bacterianas, Éstas es decir, áreas claras en un fondo de bacterias, producidas en extensiones de bacterias iniciadoras de cultivo en placas de Petri y la medida de la velocidad de producción de ácido láctico en cultivos, ambos inoculados con muestras del entorno. Está claro que el desarrollo de una técnica de detección de bacteriofago rápidayalavezsimplesería de inmenso beneficio para la industria. El presente inventor ha proporcionado ahora una técnica de este tipo que, en su forma preferida, utiliza técnicas bioluminiscentes para proporcionar una señal luminosa indicativa de la presencia y cantidad de un bacteriofago específico o de un tipo de bacteriofago en una muestra bajo investigación, dando un resultado positivo en cuestión de 4 a horas, en contraposición a las 24 horas o más de los métodos existentes. El método de la invención se basa en la liberación de componentes celulares desde bacterias infectadas con bacteriofago, particularmente cuando el bacteriofago se encuentra en el estadio de replicación del ciclo lítico. En este ciclo, el bacteriofago toma el control del metabolismo de la célulaysereplicaasímismo,demaneraque al final del ciclo se rompe la pared celular bacteriana para liberar la progenie y, sustancialmente, la totalidad de los contenidos de la célula bacteriana. Midiendo uno o más componentes concretos asociados a la célula bacteriana, que se hacen accesibles a los reactivos del medio de incubación mediante el fago, es posible medir la infección, por ejemplo vía lisis, y, utilizando curvas de calibración u otras técnicas estadísticas, es posible estimar la cantidad de fago en la muestra original. Mediante la exposición de la muestra a una bacteria que es una diana específica del fago objetivo del test, y proporcionando condiciones de incubación que permitan la infección de estas bacterias por el fago específico, es posible determinar la presencia y cantidad de un fago específico, incluso en presencia de aquellos que no causan infección, mediante el ensayo de componentes celulares concretos hechos accesibles tal y como se ha descrito anteriormente. La presente invención proporciona por tanto un método para la detección, identificación y/o cuantificación de un bacteriofago objetivo con una especificidad determinada por el huésped bacteriano en un material bajo investigación, que comprende incubar una muestra derivada del material con bacterias de este tipo de huésped, preferentemente en un cultivo líquido, en condiciones tales en que se provoque la liberación de los componentes celulares si éstas están infectadas con el fago objetivo, medir la cantidad de uno o más componentes particulares liberados a partir de la bacteria por cualquier bacteriofago presente en la muestra durante la incubación, y relacionar este hecho con la presencia, identidad y/o cantidad de bacteriofago objetivo. Preferentemente, este componente particular o estos componentes particulares comprende nucleótidos. Teóricamente, es posible medir cualquier nu-

3 3 ES T3 4 cleótido liberado a través de la lisis celular provocada por la liberación de nuevas partículas de fago, por ejemplo NAD, NADP, NADH, NADPH, ATP o ADP, camp o cgmp, con la sensibilidad proporcionada por el uso de uno o más de los sistemas de ensayo basados en enzimas, por ejemplo sistemas en cascada, que se encuentran disponibles en el estado de la técnica. Por ejemplo, GB describe un método que puede ser utilizado para ensayar nucleótidos piridínicos reducidos, por ejemplo NADH o NADPH, basado en un sistema de monooxigenasa de salicilato, mientras que otros sistemas enzimáticos tales como el sistema fosfatasa alcalina (EC )/NAD/NADP se describe en GB A los expertos en la técnica se les ocurrirán sistemas de ensayo adecuados para ADP, camp, cgmp etc. Sin embargo, se prefiere particularmente la medida de adenosina trifosfato (ATP), siendo éste fácilmente fácilmente mediante el ensayo con una variedad de combinaciones enzima/substrato enzimático, en virtud de ser un cofactor en numerosas conversiones de substrato, y de ser liberado en cantidades relativamente elevadas en comparación con otros nucleótidos bacterianos. Para la determinación rápida y eficiente de los niveles de ATP liberado, en la presente solicitud se prefiere utilizar especialmente enzimas que comportan la producción de luminiscencia, más convenientemente la enzima luciferasa. La liberación de ATP puede cuantificarse mediante reactivos comercialmente accesibles utilizando el proceso de bioluminiscencia, en el que el ATP se utiliza para conducir la reacción en la que la luciferasa cataliza la oxidación de la luciferina, provocando la emisión de luz. La eficiencia cuántica de esta reacción es extremadamente alta y la cantidad de luz producida da una medida de la cantidad de ATP presente originalmente en la muestra antes de que se agote en la reacción de ensayo. Para la identificación o cuantificación de un fago específico presente en un material en concentraciones relativamente altas, por ejemplo en cultivos de fagos aislados, es posible incubar simplemente la bacteria huésped específica con una muestra del material en la presencia de, o con la posterior adición de, los reactivos de ensayo del componente y por tanto, medir la cantidad de componente liberado durante la ejecución del ensayo. En la identificación de los fagos líticos, al final del ciclo de replicación, las bacterias huésped específicas infectadas por el bacteriofago objetivo explotan (en un intervalo de tiempo desde hasta minutos dependiendo de las especies), el componente celular, por ejemplo nucleótido, se libera y se detecta mediante el ensayo. Muestras control que no contienen fago o que contienen fago sinbacterianomuestranningún incremento en los niveles sobre los niveles de la línea base. Para la identificación, detección, y/o cuantificación de un fago específico a bajas concentraciones, por ejemplo como contaminantes en o sobre el agua o materiales de alimentación, es necesario llevar a cabo en primer lugar un enriquecimiento de la muestra a analizar, por ejemplo durante unas cuantas horas, para permitir al fago objetivo multiplicarse hasta un nivel en el que los componentes liberados, por ejemplo nucleótidos, sean detectables sobre los niveles de la línea base. Este enriquecimiento se lleva a cabo preferentemente por inoculación utilizando un cultivo, preferentemente un cultivo en fase logarítmica, de más cantidad de bacteria huésped perteneciente a un tipo capaz de ser parasitada por el bacteriofago objetivo, preferentemente de manera específica. Después de la incubación con la bacteria huésped para aumentar el recuento del fago, una muestra de medio enriquecido con fago libre de célula se mezcla con un cultivo de organismos iniciadores, preferentemente en fase logarítmica, y se incuba a una temperatura determinada durante un tiempo determinado, ambos seleccionados para provocar la liberación de componentes celulares, siendo independientes de las características de la combinación fago/bacteria que se utiliza y del componente, por ejemplo un nucleótido, cuya liberación va a medirse utilizando un ensayo apropiado, por ejemplo un sistema enzima/substrato. Preferentemente la muestra a analizar debe filtrarse para eliminar cualquier bacteria antes de ser añadida en la etapa de enriquecimiento o de liberación del componente, evitando así una posible liberación interferente debido a la acción de un bacteriofago no-objetivo sobre la bacteria contaminante. Con el propósito de extraer muestras de un entorno a investigar, pueden utilizarse técnicas convencionales tales como la limpieza con un material absorvente, por ejemplo de superficies, o ensayarse alícuotas de líquidos. Dependiendo de la biología del par fago/huésped seleccionado, el método tiene potencial para una gran especificidad y a la vez una mayor sensibilidad y rapidez. Utilizando el método de ensayo de ATP anteriormente mencionado, el inventor ha puesto a punto sistemas capaces de detectar el fago específico para Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella, E.coli y pseudomonos. Los expertos en el arte se darán cuenta de que no hay límite en la aplicación del presente método aparte de la accesibilidad de las parejas específicas fago/bacteria. En el método de ensayo de luminiscencia preferido, en el que se mide la liberación de ATP, la muestra a ensayar, enriquecida o no por el fago, se mezcla convenientemente con el cultivo bacteriano, preferentemente en fase logarítmica, en un tubo luminómetro y se incuba durante un tiempo adecuado. Éste puede estar comúnmente entre y minutos, dependiendo del sistema fago/bacteria. Después o durante este período, preferentemente después, se mide el ATP liberado utilizando un ensayo que produce luz, por ejemplo el sistema de reacción luciferina/luciferasa, para producir una cantidad de luz que se detecta en un luminómetro y se relaciona con la cantidad de ATP. En todos los casos, pueden llevarse a cabo ventajosamente controles para comparar los niveles de componentes de la línea base, por ejemplo niveles de nucleótidos, por ejemplo en muestras de medio de cultivo en fase logarítmica sin la bacteria y/o incubado con la bacteria y una cantidad 3

4 ES T3 6 conocida del fago, permitiendo así la construcción de curvas de calibrado. Tales controles pueden incluir la competición con otros huéspedes de diferente especificidad para determinar más completamente las características de varios tipos de fago presentes en la muestra. De manera similar, pueden utilizarse varios tipos bacterianos en una misma incubación cuando el método se utiliza para examinar un número de tipos de fago para los cuales ninguna bacteria común es suficientemente específica. Los expertos en la técnica se darán cuenta de la vasta gama de bacterias disponibles y bacteriofagos para los cuales éstas son específicas. Por ejemplo, una lista de tipos de fago disponibles en el American Type Culture Collection (ATCC) se publicacomoel Catálogo de Bacterias y Bacteriofagos. Otros depósitos de este tipo también publican datos equivalentes en sus catálogos, y esto puede ser utilizado para identificar posibles reactivos de fago para el presente método. Las bacterias pueden ser utilizadas, entre otras formas, en suspensión acuosa o en forma secada por congelación, por ejemplo en pozos de placa para microvaloración. En esta forma, se puede utilizar la luminometría de placa. El método de la invención se ha diseñado particularmente para su utilización en la identificación y cuantificación de fagos líticos, es decir, aquellos que conducen a la lisis de la bacteria a ensayar, pero puede detectarse cualquier fago que provoque, a través de sus acciones, la liberación de los componentes celulares. La presente invención proporciona también equipos de análisis para llevar a cabo el método de la presente invención y estos están caracterizados en tanto que comprenden una bacteria seleccionada por su capacidad de ser infectada específicamente por el bacteriofago objetivo, es decir, el tipo o tipos que se desean detectar, identificar y/o cuantificar, en combinación con algunos o todos los reactivos que están asociados específicamente con el método de la invención anteriormente mencionado. Por tanto, los equipos de análisis preferidos en la presente invención comprenden: (a) una bacteria seleccionada por su capacidad de ser infectada específicamente por un bacteriofago objetivo, provocando de esta manera que libere componentes celulares, y al menos uno de (b) los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo del componente celular liberado por la acción del bacteriofago sobre la bacteria, y (c) Una bacteria para ayudar al crecimiento del bacteriofago objetivo. Por tanto, los equipos de análisis preferidos en la invención son aquellos en los que los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo son reactivos para el ensayo de la cantidad de nucleótido liberado por la bacteria, preferentemente reactivos que comprenden luciferina y luciferasa. Los equipos de análisis optimizados para la realización del ensayo de alta sensibilidad del bacteriofago incluirán la bacteria correspondiente al componente (c) anterior, que puede ser la misma que aquella correspondiente al componente (a), pero puede también ser una bacteria parasitada menos específicamente, que sin embargo sea capaz de ayudar a una replicación más rápida del fago o a producir una mayor cantidad de fago. El método y equipos de la presente invención se ilustran a modo de ejemplo sólo por referencia a los siguientes ejemplos no-limitativos. La vasta variedad de opciones disponibles serán fácilmente determinables por los expertos en la técnica en consideración del método general descrito anteriormente y concretado abajo, y de los tipos de parejas bacteria/fago y por ejemplo ensayos de nucleótidos. Ejemplo 1 Equipo para uso en la detección de bacteriofagos específicos para cultivos iniciadores de bacterias en el ambiente lácteo y en los productos lácteos Un equipo para la utilización en el método de la invención comprende convenientemente los objetos marcados con un asterisco más abajo y opcionalmente complementados con cualquiera de los otros equipos y reactivos expuestos más abajo, tal y como se requiere para el método del ejemplo. Equipo requerido: discos estériles de algodón; filtros de jeringa de 0,8 (m de tamaño de poro; filtros de jeringa de 0.22 (m de tamaño de poro; jeringas estériles de ml; botellas universales estériles o botellas de bijou; tubos de centrífuga; luminómetro (modelo LB93 Autolumat; Instrumentos Berthold UK LTd. St. Albans, Hertfordshire); tubos luminómetros de poliestireno (Sarstedt. Beaumont Leys, Leicester). Reactivos requeridos: peptona/suero estéril (1g por litro/8,g por litro de agua destilada respectivamente); caldo de cultivo M17 (Unipath Limited, Basingstoke), mezcla de ensayo Adenosina- -trifosfato conteniendo luciferina/luciferasa y un tampón de dilución (Sigma Chemical Company Limited, Poole, Dorset); ácido láctico estéril al %; cultivo stock de bacteria de cultivo iniciadora (véase el Boletín del IDF 263/1991 Capítulo 2). Ejemplo 2 Método para la detección de bacteriofagos específicos para cultivos iniciadores de bacterias (A) en el ambiente lácteo y (B) en los productos lácteos A: Método del equipo lácteo Muestreo: Una porción estéril de algodón humedecida en agua destilada estéril se utiliza para limpiar un área del equipo (0, m 2 )ydespués se agita en ml de peptona/suero estéril. La peptona/suero se filtra entonces a través de un filtro de jeringa de 0,8 (m de tamaño de poro en un contenedor estéril y seguidamente se filtra otra vez a través de un filtro de jeringa de 0,22 (m de poro en un segundo contenedor del mismo tipo. Si se anticipa que la valoración de bacteriofago será baja, se lleva a cabo una etapa de enriquecimiento del fago. Enriquecimiento: Se inoculan 8 ml de caldo de cultivo fresco M17 en 1 ml de cultivo de organismos iniciadores en fase logarítmica, se añade 1 ml de filtrado de bacteriofago, y la mezcla se incuba a una temperatura adecuada durante 4 h (-22 C para cultivos iniciadores mesófilos y 42 Cpara

5 7 ES T3 8 cultivos iniciadores termófilos). Este cultivo enriquecido se transfiere a un tubo de centrífuga y se centrifuga para eliminar bacterias (000g durante minutos), antes de filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 (m de tamaño de poro en un recipiente estéril. Ensayo: Se añaden 0 µl de caldo de cultivo M17, mantenidos entre 22 C y 42 C dependiendo del cultivo iniciador del huésped utilizado tal como se ha expuesto anteriormente, a todos los tubos luminómetros de poliestireno en el luminómetro precalentado a la misma temperatura. Se colocan 0 µl de cultivo iniciador en fase logarítmica en cada tubo alternado para actuar como control negativo; 0, ml de filtrado de fago de la etapa de enriquecimiento o de muestreo se añaden a 4, ml del cultivo remanente y 0 µl de estos se colocan en cada uno de los tubos luminómetros restantes. La medida de luz se inicia con la inyección de 0 µl de reactivo luciferina/luciferasa en cada tubo y se mide la producción de luz en períodos de minutos. Se determinan las medidas de máximos de luz (cuentas por segundo) en función del tiempo tanto para los tubos de muestra como para los tubos de control negativo. Resultado: Un aumento aproximado de veces los niveles de ATP libre de las muestras ana- 1 2 lizadas frente a los controles negativos indican la presencia de fagos específicos iniciadores en la muestra ensayada. B: Método del producto lácteo Muestreo: los líquidos no requieren un pretratamiento particular; los polvos se suspenden ventajosamente en un volumen apropiado (eg. dilución 1:) de agua estéril; sólidos tales como el queso se mezclan con nueve veces su peso de peptona/suero y se homogeniza. El ph de todas las muestras se ajusta asépticamente a 4,-4,7 para precipitar la caseina. Se añade 0,3 ml de ácido láctico al % estéril a ml de leche o suero de la leche; se evita la utilización del electrodo de ph a menos que se autoclave, por riesgo de contaminación. Las muestras se centrifugan a 000g durante minutos y el sobrenadante se filtraatravés de un filtro de jeringa de 0,22 (m de tamaño de poro en un contenedor estéril para eliminar partículas grandes y bacterias. Como en (A) anteriormente, se aumenta la valoración de bacteriofago en este filtrado estéril mediante una etapa de enriquecimiento si se sospecha que ésta será baja. Las etapas de enriquecimiento y medida de luz se llevan a cabo tal y como se ha descrito en el Método A anterior

6 9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Método para la detección, identificación y/o cuantificación de bacteriofagos objetivo con una especificidad predeterminada para un huésped bacteriano en un material en investigación, que comprende incubar una muestra derivada del material con la bacteria de este tipo de huésped en las condiciones seleccionadas, de manera que si las bacterias están infectadas con el fago objetivo, se lisen y liberen así sus componentes celulares, medir la cantidad de uno o más componentes particulares liberados por la bacteria y relacionar ésta con la presencia, identidad y/o cantidad de bacteriofago objetivo. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el componente celular o los componentes concretos medidos comprenden uno o más nucleótidos. 3. Método según la reivindicación 2, en el que el componente o componentes medidos son uno o más compuestos entre NAD, NADP, NADH, NADPH, ATP o ADP, camp o cgmp. 4. Método según las reivindicaciones 2 o 3, en el que el nucleótido se mide utilizando un sistema de ensayo basado en enzima.. Método según la reivindicación 4, en el que el sistema de ensayo es un ensayo de cascada enzimática. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriormente citadas en el que el componente es ATP y el ensayo utiliza una reacción enzimática que provoca luminiscencia. 7. Método según la reivindicación 6, en el que el sistema de ensayo es el sistema luciferina/luciferasa. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de incubación de la muestra con la bacteria huésped se lleva a cabo mezclando la muestra con un cultivo de la bacteria huésped. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de incubar la muestra con la bacteria huésped se lleva a cabo en presencia de, o con la posterior adición de, los reactivos de ensayo del componente concreto.. Método según la reivindicación 9, en el que se utilizan los reactivos de reacción luciferina/luciferasa y la cantidad de luz emitida se mide durante la incubación y/o al final de la misma. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a en el que se enriquece el bacteriofago en la muestra antes de la adición en las etapas de liberación del componente y medida, mediante la incubación con un cultivo de la bacteria huésped de un tipo capaz de ser parasitado por el bacteriofago objetivo, donde éste puede multiplicarse. 12. Método según la reivindicación 11, en el que la incubación de enriquecimiento se lleva a cabo entre 1 y 4 horas. 13. Método según las reivindicaciones 11 o 12, en el que la etapa de enriquecimiento se lleva acabomediantelaadicióndelamuestraaun cultivo en fase logarítmica de la bacteria huésped Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las incubaciones de enriquecimiento y liberación de componentes se llevan a cabo utilizando un número de tipos de bacteria huésped de diferente especificidad, de manera que la liberación de componente es indicativa del número de tipos de bacteriofago. 1. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra a analizar se filtra para eliminar cualquier bacteria antes de ser añadida en las etapas de enriquecimiento o liberación del componente. 16. Equipo de análisis para la detección, identificación y/o cuantificación de bacteriofagos, que comprende: (a) una bacteria seleccionada por su capacidad de ser infectada y lisada específicamente por el bacteriofago objetivo de manera que se liberen los componentes celulares, y al menos uno de (b) los reactivos necesarios para llevar a cabo un ensayo de un componente celular liberado por la acción del bacteriofago en la bacteria y (c) una bacteria para la replicación del bacteriofago; siempre que dicho equipo de análisis no contenga bacteriofago. 17. Equipo de análisis según la reivindicación 16, en el que los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo de componentes celulares son reactivos para el ensayo de un nucleótido liberado por la lisis de la bacteria. 18. Equipo de análisis de acuerdo con la reivindicación 17, en el que los reactivos comprenden luciferina y luciferasa. 19. Utilización de un equipo de análisis que comprende: (a) una bacteria seleccionada por su capacidad de ser infectada específicamente y lisada por el bacteriofago objetivo de manera que se liberen los componentes celulares, y al menos uno de (b) los reactivos necesarios para llevar a cabo un ensayo de un componente celular liberado por la acción del bacteriofago en la bacteria; (c) una bacteria para la replicación del bacteriofago; y opcionalmente (d) una muestra de bacteriofago objetivo; para la detección, identificación y/o cuantificación del bacteriofago.. Utilización de acuerdo con la reivindicación 19, en la que los reactivos necesarios para llevar a cabo el ensayo de los componentes celu- 6

7 11 ES T3 12 lares son reactivos para el ensayo del nucleótido liberado por la lisis de la bacteria. 21. Equipo de análisis de acuerdo con la rei- vindicación, en el que los reactivos comprenden luciferina y luciferasa NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 7