Muerte. celular. una batalla. por el control. Carla O. Contreras-Ochoa, Alfredo Lagunas-Martínez, Dolores Correa. ciencia y desarrollo

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2 Carla O. Contreras-Ochoa, Alfredo Lagunas-Martínez, Dolores Correa Muerte celular una batalla por el control 50 ciencia y desarrollo

3 Los protozoarios parásitos son organismos unicelulares, muchos de los cuales viven dentro de una célula por lo que son llamados intracelulares ; de ella obtienen nutrientes para crecer y multiplicarse, así como protección contra los mecanismos de ataque al sistema inmune del huésped que parasitan. En muchos casos, la invasión de estos protozoarios causa enfermedades potencialmente mortales a seres humanos y animales. En las células infectadas con patógenos (bacterias, protozoarios o virus) se activa un proceso de muerte celular llamado apoptosis, mediante el cual una célula infectada comete suicidio, pero sin afectar las células vecinas, previniendo así un daño mayor al organismo. No obstante, los patógenos intracelulares han desarrollado estrategias de supervivencia para controlar la apoptosis de la célula huésped y usarla a su favor. La descripción de este proceso es la base de la presente historia. noviembre-diciembre

4 muerte celular, una batalla por el control La apoptosis es un proceso normal que mantiene el estado de equilibrio (homeostasis) del tejido, y sirve para eliminar las células viejas o dañadas; pero también es un proceso vital del sistema nervioso durante su desarrollo, y del sistema inmune, ya que posibilita la eliminación de las células infectadas con patógenos. Descripción de la apoptosis en células de mamíferos Cuando una célula recibe la señal de apoptosis, se activa una compleja cascada de eventos bioquímicos y moleculares muy bien regulados, que producen cambios morfológicos en ella, tales como compactación de la membrana celular y fragmentación del ADN. Hay dos vías mediante las cuales se induce la apoptosis en una célula: La vía extrínseca se activa mediante la unión de proteínas específicas llamadas ligandos, los cuales interactúan con sus respectivas proteínas receptoras en la membrana de la célula blanco; algunos ejemplos de ligandos son los llamados ligando de Fas (FasL) y Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα, por sus siglas en inglés), los cuales interaccionan con los receptores Fas y TNFR, respectivamente (figura 1). Cuando el ligando se une al receptor, se forma un complejo con muchas proteínas, entre las más importantes están las llamadas caspasas, que se localizan en el citoplasma de la célula y se encargan de fragmentar otras proteínas celulares, provocando con esto el desensamblaje de la célula; es como si las caspasas fraccionaran los andamios de una casa para que ésta colapse. Estas caspasas se designan por números, por ejemplo, la Caspasa 8 es fundamental en la vía extrínseca. La vía intrínseca o mitocondrial es inducida por estímulos externos, como estrés, radiación, luz ultravioleta o agentes tóxicos (fármacos), todos estos que figura 1. Esquema general del proceso de apoptosis en células de mamífero. Se indica los componentes de la vía extrínseca (letras moradas), de la vía intrínseca (letras verdes) y la convergencia de las dos vías (letras rosas); así como las proteínas reguladoras de la apoptosis (letras negras). Las flechas en color negro indican activación, y las rojas, inhibición. Vía intrínseca Estímulo Bak Bad Bax Caspasas 3, 6 y 7 TNF TNFR DISC FADD Caspasa 8 NFxß FasL Fas Vía extrínseca IAP Bcl Bcl-x1 Mcl-1 citocromo c Apaf-1+Caspasa 9 Apoptosoma Degradación de proteínas blanco en citoesqueleto Degradación de proteínas blanco NÚCLEO IAP Bcl-2 Apoptosis 52 ciencia y desarrollo

5 Cuadro 1. protozoarios parásitos que modulan la apoptosis de la célula huésped Toxoplasma gondii Causa una enfermedad llamada toxoplasmosis, común en zonas cálidas y húmedas; en México se presenta principalmente en las costas y centro del país. La enfermedad no tiene síntomas característicos, por lo que pasa desapercibida, pero durante el embarazo, el parásito se puede trasmitir al embrión, causando problemas clínicos. Toxoplasma infecta cualquier célula nucleada y provoca en ésta un efecto dual en su maquinaria apoptótica; es decir, induce apoptosis en células de bazo, ojo y cerebro; pero también previene la apoptosis en células de sistema inmune (linfocitos) y de cerebro. Hasta el momento, sólo se ha identificado una proteína del parásito llamada TgIKK, que podría ser responsable de prevenir la apoptosis de la célula. En el cuadro 2 se menciona otras proteínas de la maquinaria apoptótica de la célula que Toxoplasma activa o inhibe. Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax. Ambos provocan una enfermedad llamada paludismo o malaria en países tropicales, la cual es mortal en niños pequeños y en adultos inmunodeficientes; en México se presenta en Chiapas, Oaxaca y Tabasco. Inicialmente, Plasmodium infecta células del hígado llamadas hepatocitos e induce la liberación de un factor de crecimiento conocido como factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) que, aparentemente, previene la apoptosis de estos hepatocitos. Después, invade los glóbulos rojos (eritrocitos) en la sangre y se multiplica dentro de ellos; entonces, los eritrocitos infectados se adhieren a los vasos sanguíneos y liberan proteínas solubles que inducen la apoptosis en las células endoteliales que recubren el interior de estos vasos. Así, Plasmodium activa o inhibe varias proteínas de la maquinaria apoptótica de la célula, pero aún no se han identificado las proteínas del parásito que interactúan con ellas. Trypanosoma cruzi Causa la enfermedad de Chagas, exclusiva del continente americano; en México, se encuentra en Chiapas, Yucatán, Oaxaca, Morelos y Jalisco, principalmente. En la etapa inicial de la infección, Trypanosoma induce la apoptosis de las células del sistema inmune (linfocitos y macrófagos), para escapar a su ataque; pero en etapas avanzadas previene la apoptosis de las células en las que se aloja (corazón, músculo, tejido nervioso y sistema digestivo). Para mantener el estado anti-apoptótico, Trypanosoma activa o inhibe algunas proteínas de la célula que regulan la apoptosis (cuadro 2). Además, se han encontrado dos proteínas del parásito que podrían ser las responsables de evitar la apoptosis de la célula, éstas son: Trans-sialidasa, que actúa sobre neuronas, y Cruzipaína, que actúa sobre células del corazón (cardiomiocitos); ambas inhiben la apoptosis mediante la interacción con la proteína celular NFκβ y las caspasas, pero se ignora aún la forma en que esto ocurre. provocan daño a la mitocondria; y una vez que ésta se daña, libera la proteína citocromo c que, junto con la Caspasa 9, forman un complejo en el citoplasma llamado Apoptosoma, el cual comienza la cascada de eventos que finalmente conducen a la muerte de la célula. En esta vía también participa una familia de proteínas llamada Bcl-2; algunas de las cuales tienen la función de prevenir la apoptosis, por eso se llaman anti-apoptóticas; ejemplos: Bcl-2, Bcl-xL y Mc-1. Mientras que otras proteínas favorecen la apoptosis y se llaman pro-apoptóticas, tales como Bax, Bak y Bad. Tanto la vía extrínseca como la intrínseca convergen en la activación de las Caspasas 3, 6 y 7, las cuales En las células infectadas por parásitos protozoarios se activa un proceso de muerte celular programada, conocida como apoptosis, con el fin de reducir la replicación y diseminación del patógeno reciben y amplifican la señal de muerte, además de fragmentar proteínas del núcleo y el citoesqueleto, provocando que la célula se desensamble. También existen otras familias de proteínas encargadas de controlar la apoptosis de la célula, como son las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP), que evitan la muerte, estorbando la actividad de las cas- noviembre-diciembre

6 muerte celular, una batalla por el control Figura 2. Protozoarios parásitos que interfieren con la maquinaria apoptótica de la célula. A) Astrocitos de cerebro de ratón infectados con Toxoplasma gondii. B) Eritrocitos humanos infectados con Plasmodium falciparum. C) Células musculares de ratón infectadas con Trypanosoma cruzi. A y B) Tinción con Giemsa 100x. C) Tinción con inmunofluorescencia, anticuerpo anti-actina de músculo y suero de ratón infectado con Trypanosoma cruzi, con el fluorocromo FITC, 100x. Los parásitos se identifican con flechas. Fotos: Carla Contreras. pasas; además de factores de supervivencia, como la proteína NFkβ que, al moverse del citoplasma al núcleo, se une al ADN e induce la expresión de genes anti-apoptóticos de las familias IAP y Bcl-2 (figura 1). Apoptosis como estrategia de supervivencia Normalmente, una célula infectada entra en proceso de apoptosis con la finalidad de evitar la multiplicación del patógeno que la ha invadido, con lo cual evita que éste se disemine e infecte células vecinas; estrategia que limita el daño al organismo. Sin embargo, estudios realizados en células en cultivo, así como en ratones, indican que los protozoarios parásitos pueden regular la apoptosis de la célula huésped, proceso que depende de varios factores, tales como: Cuadro 2. PROTEÍNAS DE LA MAQUINARIA APOPTÓTICA DE LA CÉLULA HUÉsPED ACTIVADAS O INHIBIDAS POR PROTOZOARIOS PARÁSITOS PARÁSITO PROTEÍNA SOBRE LA QUE ACTÚA Y SU EFECTO inhibe Activa Toxoplasma Citocromo c Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Bfl-1 y Mcl-1 caspasas 3, 8 y 9 IAPs (c-iap y XIAP) bad y Bax Nfkβ Plasmodium Caspasas 3, 8 y 9 Trypanosoma Bad bcl-2 y Bcl-xL y NFkB Etapa de la infección: Durante la etapa aguda de la enfermedad, es decir, en los primeros seis meses después de la infección, el parásito escapa al ataque del sistema inmune del huésped, para diseminarse a otras células; y al hacerlo induce apoptosis en las células encargadas de la defensa del organismo, como los linfocitos. Algo así como provocar que todos los cuerpos de protección de una ciudad (ejército, policías, etc.) se suiciden. Además, durante la etapa crónica de la enfermedad, que ocurre a partir de los seis meses de la infección, el parásito puede prevenir la apoptosis de las células que los alojan, evitando que éstas mueran, para que los sigan manteniendo y logren el objetivo de reproducirse y colonizar más células. Tipo de parásito: La población de parásitos de una especie determinada suele tener variantes o tipos con virulencia diversa. Los más virulentos tienen características que los vuelven más agresivos, es decir, se multiplican en tiempos más cortos que las variantes no virulentas; y pueden provocar la apoptosis en un mayor número de células, en comparación con las de menor virulencia. Tipo de célula huésped: Las células de mamífero comparten una maquinaria apoptótica común, pero 54 ciencia y desarrollo

7 algunos tipos celulares, como los astrocitos (célula del cerebro que brinda protección y nutrientes a las neuronas), son más resistentes a la muerte celular. Cantidad de parásitos: Se ha observado que entre más parásitos invasores vivan dentro de una célula, aumenta en ésta el efecto inhibidor del proceso de apoptosis. Entre los protozoarios parásitos que tienen la capacidad de interferir con la maquinaria apoptótica de la célula, descrita anteriormente, se encuentran: Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma, Cryptosporidium, Leishmania y Theileria (figura 2), éstos causan infecciones en humanos y animales; no obstante, se desconoce exactamente cómo lo hacen. En los últimos años, con el uso de técnicas bioquímicas y moleculares, se ha encontrado proteínas propias de los parásitos que interactúan con las proteínas que conforman la maquinaria apoptótica de la célula; algunos ejemplos son descritos en el cuadro 1. Así mismo, en la célula huésped, ha sido posible identificar algunas proteínas blanco, que pueden ser activadas o inhibidas por los parásitos para modificar el proceso de apoptosis a su favor (cuadro 2). Recientemente también se ha encontrado que tanto las células infectadas como los parásitos por sí mismos liberan moléculas durante el proceso de infección, las cuales pueden actuar directamente sobre la célula infectada, o bien, sobre las células vecinas que aún no han sido infectadas para prevenir su muerte. Por qué estudiar la apoptosis? Como se puede ver, la interacción célula huésped parásito es muy compleja, pues la célula infectada trata de eliminar al invasor, activando, incluso, el proceso de su propia muerte (apoptosis); por su parte, el parásito se defiende, tomando el control de la maquinaria celular para evitar que ésta muera, con lo cual continúa obteniendo nutrientes y un espacio para crecer y multiplicarse. Es esta modulación del proceso de apoptosis por parte de los protozoarios parásitos lo que permite o no el establecimiento de la infección y, en consecuencia, el avance de la enfermedad. El estudio de la modulación de la apoptosis en la célula infectada comprende un nuevo campo de investigación enfocado al desarrollo de terapias para prevenir el daño o, incluso, eliminar la infección. Esta estrategia se ha usado en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y cáncer, en las cuales la apoptosis favorece el desarrollo de la enfermedad. Actualmente, se están probando nuevos fármacos con efecto anti-apoptótico para el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en ratones infectados con Plasmodium berghei, el inhibidor de Caspasas ZVAD-fmk disminuyó la mortalidad celular asociada a la infección; mientras que en ratones infectados con Trypanosoma cruzi el inhibidor de caspasas, llamado Benziloxicarbonil-fluorometil cetona redujo la cantidad de parásitos y previno la apoptosis de linfocitos. Actualmente, un reto importante es identificar las moléculas del parásito que interfieren con la maquinaria apoptótica de la célula; así como caracterizar los mecanismos celulares y moleculares por los que estas moléculas actúan, conocimiento que va enfocado al desarrollo de fármacos que inhiban la infección, lo que permitirá en un futuro controlar enfermedades causadas por protozoarios parásitos. Agradecimientos 1. Al M. en C. Bernardo Cortina por el diseño de la figura de apoptosis. Bibliohemerografía: Bienvenu, A. L, E. González-Rey, S. Picot. Apoptosis Induced by Parasitic Diseases. Parasites & Vectors, 3, (2010): 106. Bruchhaus, I, T. Roeder, A. Rennenberg, V. T. Heussler Protozoan Parasites: Programmed Cell Death as a Mechanism of Parasitism. Trends in Parasitology, 23 (2007): Elmore, S. Apoptosis: a Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathology, 35 (2007): Lüder, C. G., J. Campos-Salinas, E. González-Rey, G. van Zandbergen. Impact of Protozoan Cell Death on Parasite-Host Interactions and Pathogenesis. Parasites & Vectors, 3, (2010): 116. Carla Contreras-Ochoa es Doctora en Ciencias de la Salud Pública con especialidad en Enfermedades Infecciosas, labora en el Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI), del Instituto Nacional de Salud Pública (INSP). Su investigación se ha enfocado en el estudio de los protozoarios parásitos Toxoplasma, Trypanosoma y Plasmodium. Alfredo Lagunas-Martínez es candidato a Doctor en Ciencias Biomédicas por la UNAM. Actualmente labora en el CISEI-INSP. Su línea de interés se centra en la caracterización de los mecanismos a través de los cuales los virus bloquean la muerte celular programada (apoptosis). Dolores Correa es Doctora en Investigación Biomédica, y trabaja en el Laboratorio de Inmunología Experimental, del Instituto Nacional de Pediatría. Tiene más de 25 años de experiencia en Investigación Biomédica enfocada a la Inmunología de las parasitosis, particularmente, con cisticercosis, toxoplasmosis, fasciolosis y triquinelosis. Ha desarrollado tecnología inmunológica de diagnóstico con aplicación clínica y epidemiológica; así como estudios sobre los mecanismos de evasión y patogenia de los parásitos. Es miembro del SNI, nivel 3. noviembre-diciembre