Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con agua de coco

Transcripción

1 Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con agua de coco RESUMEN El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal, puede definirse como el cultivo en medios nutritivos de plantas, embriones, semillas o cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante en condiciones asépticas. Técnica que también se conoce como Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) y que consiste en tomar una porción de la planta a la que se le proporciona los nutrientes necesarios para diferenciarse en estructuras vegetativas o crecer, el medio nutritivo que se le proporciona permite regenerar una o muchas plantas, la composición de los medios de cultivos contienen componentes básicos que son: sales minerales, vitaminas, hormonas, sacarosa y un agente gelificante como el agar. A partir de dicha técnica se promovió el crecimiento de plántulas de la orquídea Laelia speciosa de importancia ornamental y económica por la belleza de su flor, en medios de cultivo MS adicionado con agua de coco la cual contienen sustancias como citocininas que favorecen el crecimiento celular, se comparó el crecimiento de las plántulas en medios MS y MS con agua de coco y sin agua de coco, hasta el momento y después de dos meses se observan diferencias significativas en el crecimiento de las plántulas, algunos de los cultivos se han contaminado con hongos y bacterias, problema que se está atendiendo cuidadosamente. 1

2 Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con agua de coco MARCO TEORICO El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal, puede definirse como el cultivo en condiciones asépticas, de plantas, embriones, semillas o de cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante. El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) consiste en tomar una porción de la planta y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células crezcan de manera adecuada mediante un medio de cultivo nutritivo esterilizado, esto permite regenerar una o muchas plantas, la composición de los medios de cultivos vegetales va a diferir según la finalidad del mismo, no obstante todo medio requiere de unos componentes básicos que son: sales minerales, vitaminas, hormonas, azúcar y un agente gelificante como el agar. La finalidad del CTV puede ser muy diversa por ejemplo: la obtención de plantas libres de virus o bacterias, la micropropagación de plantas en vías de extinción o plantas difíciles de propagar por otros métodos. La reproducción de plantas por esta técnica es posible gracias a que las células vegetales son totipotenciales que quiere decir que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera de forma asexual. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos, para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales a lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción. Por esta técnica se han obtenido plantas ornamentales como: orquídeas, lirios y rosas. Frutales: la piña, mango y aguacate. Plantas agrícolas: el plátano y la papa. Cultivos agroindustriales: como la caña de azúcar y la palma de aceite, entre muchas otras. 2

3 La técnica de CTV o cultivo in vitro debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de células, tejidos u órganos vegetales, estos medios preparados en el laboratorio requieren de un control en su preparación, conservación y uso, que aseguren su confiabilidad en los resultados obtenidos. El medio más utilizado para propagar orquídeas es el de Murashige y Skoog (MS), su composición se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Composición Química del medio MS Sales de macronutrientes (mg L -1 ) Sales de micronutrientes (mg L -1 ) NH 4 NO KI 0.83 KNO H 3 BO CaCl 2 2H 2 O 440 MnSO 4 4H 2 O 22.3 MgSO 4 7H 2 O 370 ZnSO 4 7H 2 O 8.6 KH 2 PO Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25 CuSO 4 5H 2 O CoCl 2 6H 2 O Na 2 EDTA 37.3 FeSO 4 7H 2 O 27.8 Tomada de Roca, 1991 Aunque este medio es rico en nutrientes, existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo por ejemplo: Agua de coco, jugo de frutos de tomate, extracto de levadura, extracto de tubérculos de papa, Aminoácidos (asparagina, cisteína y L-tirosina), Ácidos orgánicos (cítrico, málico, succínico y pirúvico) o Sustancias antioxidantes (ácido ascórbico, L- cisteína y polivinilpirrolidona). 3

4 Propiedades del agua de coco El coco es una fruta de la cual se pueden aprovechar no solo su pulpa si no también el agua que contiene, la cual posee una gran cantidad de propiedades nutritivas y beneficiosas. El agua de coco tiene componentes tales como azúcares, vitaminas, minerales, electrolitos (como potasio, magnesio, calcio, sodio y fósforo), enzimas, aminoácidos, citocininas. A su vez es muy bajo en calorías y no tiene contenidos grasos, lo cual lo convierte en una sustancia excelente para el cultivo de plantas. Las citocininas son reguladores de crecimiento que inducen la división celular, retardan la senescencia de los cultivos y promueven la formación de brotes. Las orquídeas Las Orquídeas son plantas herbáceas perennes de la familia Orchidaceae, clase Liliopsida (monocotiledóneas), muy abundantes, con más de 600 géneros y especies en el mundo. Aunque son más abundantes en los trópicos, también existen especies en ambientes templados, desde el nivel del mar a grandes altitudes. Las orquídeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas, hermafroditas (ambos sexos en la misma flor), zigomorfas (con 1 solo plano de simetría), trímeras (3 sépalos y 3 pétalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas (anteras) y femeninas (pistilo). El fruto es una cápsula seca con muchas semillas pequeñas, sin endospermo y con embrión no diferenciado. Algunas viven en las ramas de los árboles (epifitas), otras sobre rocas (litofíticas) y algunas en el suelo (terrestres). Las raíces de las epífitas y litofílicas están adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgánica, ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo. 4

5 La orquídea Laelia speciosa Esta especie tiene una amplia gama de color en sus flores en racimos que pueden ser erectos o péndulos. La planta es resistente a la sequía y puede tolerar tanto las condiciones de temperatura fresca como calurosa. Forma pseudobulbos de unos 6 a 30 cm de longitud, ovoides y están claramente separados. Cada pseudobulbo desarrolla una o dos hojas céreas, de unos 20 cm de longitud. Las floraciones de la planta se producen desde finales de la primavera, en verano hasta otoño, sus flores tienen fragancia. La inflorescencia es un racimo y puede tener una longitud de 30 cm y generalmente poseen de tres a cuatro flores de color rosa o púrpura en cada inflorescencia. Laelia speciosa crece fácilmente en cultivo y son resistentes a las sequías, sus raíces pueden recibir corrientes de aire y aguantar ciclos de humedad o sequía. Laelia speciosa es una planta que se desarrolla en lugares altos, teniendo preferencia por unas condiciones soleadas, frías y secas. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Debido al interés que las personas tienen por Laelia speciosa han llegado a extraerla de su medio natural para comercializarla de manera ilícita, actividad que puede llegar a colocarla en peligro de extinción, la importancia económica que tiene para los lugareños del área en donde crece ha llevado a buscar formas alternativas de propagación y establecimientos de invernaderos en donde se pueda multiplicar y comercializar para reducir el impacto del saqueo a la que está expuesta. Actualmente en el laboratorio de CTV del Jardín botánico de la UNAM se propaga en medios MS, por lo que nos dimos a la tarea de probar el Medio MS adicionado con agua de coco (que contiene citocininas) a partir de cual esperamos obtener una mayor producción de plántulas y/o observar un aumento en el tamaño de las plantas. Se pretenden sustituir también de esta manera el uso las 5

6 sustancias químicas del medio de cultivo por extractos naturales que favorezcan el crecimiento de la planta. JUSTIFICACIÓN Las orquídeas son plantas muy cotizadas por lo llamativo de sus flores, lo que ha ocasionado que sean extraídas de sus hábitats naturales. Laelia Speciosa no es la excepción, su importancia ornamental se debe a lo llamativo de sus flores por lo cual la gente las extrae y comercializa vendiéndolas bajos costos lo que sugiere que las personas las extraen con facilidad y comercializan por su alta, demanda llevándolas a una disminución de sus poblaciones, por lo que a través del CTV pretendemos promover su propagación así como encontrar las condiciones adecuadas para el crecimiento de las plántulas que posteriormente se puedan mantener en el invernadero hasta la época de floración, en un primer avance de nuestra investigación se ha logrado el establecimiento de cultivos con plantas sanas que al adicionarles agua de coco presentan un crecimiento favorable. El llevar este tipo de investigaciones nos permitirá contar con información que favorezca el establecimiento de plantas que produzcan semillas para su conservación. OBJETIVOS 1. Propagar la orquídea Laelia Speciosa por el método de cultivo in Vitro 2. Evaluar el desarrollo de los cultivos en medio MS (50-100%) y medio MS (50-50%) adicionado con agua de coco. 3. Conocer y adquirir habilidad en el manejo de la técnica de CTV. 4. Aplicar los conocimientos adquiridos en las asignaturas Biología y Química durante establecimiento de cultivos in vitro. 6

7 HIPÓTESIS Al colocar plantas de Laelia speciosa en medios de cultivos MS adicionadas con agua de coco se espera obtener un mayor número de plántulas o un aumento en su tamaño. MÉTODO Y TÉCNICAS UTILIZADAS Materiales y equipo Plantas de Laelia speciosa, obtenidas y donadas por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM. EQUIPO MATERIAL Autoclave Matraz Erlen Meyer de 2000 ml Parrilla de calentamiento Probeta de 1000 ml Agitador magnético Balanza Mechero de bunsen Propipeta Balanza Analítica Frascos de Gerber Potenciómetro Vaso de precipitados 1 L. Bisturí Cuarto de incubación Cajas Petri Sustancias químicas del Medio MS Pinzas de disección Matraz Aforado de 100 ml PROCEDIMIENTO Nuestro trabajo experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología CREA del Siladin del Plantel Sur. En el Laboratorio se montó un espacio que se acondiciono para llevar a cabo la siembra y trasplante de plántulas de Laelia speciosa en medios MS (control) y medios MS adicionados con agua de coco. 7

8 Se estableció un lote de 80 frascos con plantas, de las cuales 40 fueron colocadas en medios MS al 100% de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas, de acuerdo al medio Murashige Skoog (1962) y Roca (1991). Las otras 40, fueron colocadas en medio MS al 100% de macronutrientes, 100% de micronutrientes y 50% de vitaminas más 100 ml de agua de coco en un litro de medio. Una vez listo los medios de cultivo procedimos a la siembra de Laelia speciosa, la cual se llevó a cabo en un área estéril, trabajamos en condiciones asépticas usando cubrebocas y cabello recogido, también fue importante el uso de la bata. Una vez colocadas las plantas dentro de los frascos con medio de cultivo se sellaron con egapack y colocaron en una cámara de incubación en condiciones de luz constante por 24 horas. Se llevó a cabo un registro del crecimiento de las plantas durante dos meses. RESULTADOS Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas al 100% mantenidas en cámara de incubación con luz constante por 24 horas. De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones, se registró un aumento en la talla de la planta de aproximadamente 1.0 a 1.5 cm durante estos dos meses, en los cuales las plantas también se conservaron sanas. Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes 100% y vitaminas al 50%, medio adicionado con 100 ml agua de coco (900 ml de medio/ 100mL agua de coco) mantenidas en cámara de incubación con luz constante por 24 horas. De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones es decir medio adicionado con agua de coco, se registró un aumento en la talla de la planta de 8

9 aproximadamente de 1.0 a 1.7 cm durante estos dos meses, como se muestra la diferencia entre el tamaño de la plantas en el grupo control con el experimental fue poco significativo, consideramos que se requiere de un poco más de tiempo para observar el efectos de las sustancias que contienen el agua de coco en el crecimiento de Laelia speciosa. stock Preparación de soluciones Preparación de Medios de cultivo 9

10 Establecimiento de plántulas de Laelia speciosa Orquídea Laelia speciosa 10

11 Finalmente se logró el establecimiento de los cultivos en los dos medios probados durante nuestro experimento. ANÁLISIS DE RESULTADOS El uso de medio de cultivo MS para propagar la orquídea Laelia speciosa fue adecuado, se estableció un lote importante de más de 100 frascos con las plántulas, de las cuales 80 se mantuvieron en observación. Es importante mencionar que durante el establecimiento de estos cultivos tuvimos algunos problemas de contaminación principalmente por bacterias y hongos por lo cual implementamos rigurosas medidas de asepsia durante la siembra y subcultivo de nuestras plantas, lográndose finalmente erradicar este problema. Se requiere llevar a cabo un registro cuantitativo del tamaño de las plantas más riguroso, sin afectar la siembra de las plántulas con problemas de contaminación, por lo cual se propone llevar a cabo un registro de la masa de la planta o adaptar algún dispositivo que nos permita medir sin riesgo su tamaño. Nuestros resultados deberán confirmarse con el seguimiento de los cambios en las plantas durante los siguientes meses. El registro del crecimiento se llevó a cabo durante los meses de enero a febrero. CONCLUSIONES La técnica de cultivo de tejidos vegetales resulta ser un procedimiento propicio para la propagación de especies vegetales, en el caso de Laelia speciosa fue posible su cultivo, consideramos que se requiere de más tiempo para poder afirmar que el efecto de las citocininas en el crecimiento y multiplicación de las plántulas es significativo. 11

12 Consideramos que hemos adquirido una gran experiencia en el trabajo en el laboratorio, en el uso de material y equipo así como en la elaboración de medios de cultivo, siembra y cuidado de plantas in vitro. Creemos que mediante este tipo de técnicas es posible la multiplicación masiva de plantas y el rescate de especies que se encuentran en peligro de extinción además de ser una alternativa viable para propagar plantas de importancia económica como Laelia speciosa, dando alternativas de producción de plantas que puedan ser comercializadas sin alterar las poblaciones de los hábitats naturales. REFERENCIAS Roca, M. W Cultivo de tejidos en la agricultura fundamentos y aplicaciones, edit. Xyz, calicolombiapag Muñoz, M. A Biotecnología. Ed. Universidad Nacional de Quilmes Barceló, Fisiología Vegetal. Ed. Pirámide Devlin, R Fisiología Vegetal. Ed. Omega. Choppin, G. R Química, México Ed. Publicaciones Cultural, pp. 156, , Lama, D. D Eco fisiología del Cultivo de Cacao, Universidad Agraria de la Selva, Tingo María Perú. Lama D. D. Paquete Tecnológico del Cultivo de Cacao en la Región Alto Huallaga,Ministerio de Agricultura, Agencia Agraria Leoncio Prado. PLANTAS-MADRES Barthelemy R, Dawson J, y Lee, A Técnicas para el laboratorio de biología. Ed. Continental Pierik, R. L In vitro culture of higherplants. Editorial MartinusNijhoff Publishers 12

13 Strasburger, E Tratado de Botánica. Ed. Marín 13