NOCIONES DE MEMBRANA CELULAR

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1 NOCIONES DE MEMBRANA CELULAR NOCIONES DE MEMBRANA CELULAR Las membranas celulares son estructuras dinámicas esenciales en todas las células. En las células procariotas (bacterias), la única membrana existente cumple la función de limitar a la célula frente al medio externo. En los eucariotas, la variedad de estructuras de membrana existentes permite que se clasifiquen en cinco grupos, de acuerdo a su función: Barreras físicas entre compartimentos, que proveen un medio ambiente adecuado para que ocurran procesos biológicos con la máxima eficiencia. Transporte de iones y moléculas entre compartimentos para mantener esos ambientes. Transporte de moléculas por una variedad de mecanismos en los diferentes compartimentos para su procesamiento. Receptoras de señales químicas y transductoras de esas señales entre compartimentos. Productoras de energía y transductoras de esa energía entre compartimentos. Los organismos eucariotas, sumada a la membrana plasmática, tienen una variedad muy grande de membranas en el citoplasma (mitocondrias, retículo endoplasmático liso y rugoso, lisosomas, peroxisomas, aparato de Golgi, etc.). La membrana plasmática es una barrera semipermeable entre el interior y el exterior de la célula, lo que le permite mantener una condición homeostática apropiada para las reacciones bioquímicas necesarias para el sostenimiento de la vida. Esta semipermeabilidad implica selectividad en el pasaje de diferentes moléculas. Composición de las Membranas Todas las membranas son de naturaleza anfipática, es decir tienen una estructura no polar (hidrofóbica) central, rodeada por dos capas polares (hidrofílicas) (Figura 1). La unidad básica tiene un grosor de 5 a 10 nm, siendo sus principales componentes: lípidos, proteínas y carbohidratos. Universidad de Buenos Aires Cátedra de Física Biológica

2 Curso de Física Biológica Figura 1 Lípidos Las membranas están compuestas fundamentalmente por una bicapa lipídica, aunque pueden encontrarse, en menor grado, otras disposiciones (formas hexagonales o micelares). La bicapa se caracteriza por: Ser permeable a pequeñas partículas no ionizadas, como glicerol, urea, agua, oxígeno y dióxido de carbono, y a todas las moléculas lipofílicas. Proveer la estructura y el entorno apropiados para el funcionamiento de gran parte de las proteínas. La cantidad total de lípidos de la membrana se expresa normalmente como razón proteínalípido, siendo generalmente mayor que 1, especialmente en las membranas metabólicamente activas, donde puede llegar a 4. No obstante, las membranas celulares tienden a tener mayor cantidad de lípidos que las membranas de las organelas, aunque solamente en las membranas ricas en mielina, el valor baja de 1. Generalmente los lípidos pueden dividirse en cuatro grandes grupos: Ácidos grasos libres Ésteres de ácidos grasos (triacilglicerol, fosfolípidos, etc.) Isoprenoides (esteroles, etc.) Glicolípidos Los fosfolípidos son el mayor componente lipídico, y con excepción de la mielina, representan más del 50% del total de la masa de lípidos de la membrana. Los glicolípidos y el colesterol están usualmente concentrados en la membrana plasmática de las células animales. Recientemente se ha determinado que algunos isoprenoides 54

3 Nociones de Membrana Celular diferentes a los esteroles (derivados del farnesol, geranilgeranol, etc.) son importantes en el metabolismo celular. En la tabla siguiente se observan ejemplos de las cantidades porcentuales de cada tipo de lípido en la membrana de células de mamíferos. Membrana Fosfolípidos Glicolípidos Esteroles Plasmática Organelas <5 10 <5 15 Eritrocito Aunque los ácidos grasos libres en general no se consideran componentes de las membranas, algunos, como los ácidos palmítico o mirístico, así como algunos residuos isoprenoides pueden actuar como ancla de ciertas proteínas a la bicapa lipídica. Fosfolípidos Los derivados del diacilglicerolfosfato son los fosfolípidos más comunes (Figura 2). Dos cadenas acílicas están esterificadas en las posiciones 1 y 2 del glicerol3fosfato. Normalmente su grupo fosfato está ligado a una base nitrogenada (colina, etanolamina o serina), o a un alcohol (inositol o glicerol), formando respectivamente: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, o fosfatidilglicerol. Otros derivados son cardiolipina (difosfatidilglicerol), esfingomielina (sólo hallada en mamíferos), lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, plasmalógeno, etc. Cabeza polar Extremo no polar Figura 2 55

4 Curso de Física Biológica Los ácidos grasos que componen las cadenas de los fosfolípidos se encuentran entre C14 y C24 en mamíferos, son siempre de cadena par, y generalmente son insaturados o poliinsaturados. Las cadenas más largas son específicas de la esfingomielina, por lo que son importantes compuestos en la mielina. Isoprenoides Las cantidades de colesterol en las membranas celulares de mamíferos varían considerablemente. La razón molar colesterol:fosfolípido es alta en la membrana plasmática, y mucho menor en las membranas de las organelas, estando ausente, por ejemplo, en la membrana interna de las mitocondrias. Normalmente el colesterol está presente como esterol libre, no como éster, ya que éste no es anfipático. Otros esteroles son importantes en las membranas celulares, como el dolicol fosfato en el retículo endoplasmático, y el farnesil y el geranilgeranil, que aparentemente unidos a ciertas proteínas, tendrían una función clave en el reconocimiento celular y la regulación de eventos celulares. Arquitectura de los lípidos Todas las membranas lipídicas tienen la forma de una bicapa, con las porciones polares de sus moléculas hacia el exterior, y las cadenas hidrocarbonadas en el centro. De la misma manera, el colesterol se encuentra ubicado en la región no polar, mientras que los hidroxilos libres se ubican en las superficies. Si se realiza una dispersión de fosfolípidos secos en agua, tales como los que se encuentran en las membranas, se producen estructuras llamadas liposomas. Estas son vesículas de varias capas de membranas sobre membranas. Se forman porque se producen reacciones hidrofóbicas entre las cadenas de ácidos grasos. Su estabilidad está consolidada por interacciones electrostáticas y de puentes de hidrógeno entre las cabezas polares. Estas vesículas multicapa pueden transformarse en monocapas por sonicación. Del estudio de estas estructuras se determinó que los lípidos pueden encontrarse en dos 56

5 Nociones de Membrana Celular fases distintas. La primera, similar a un gel, donde las cadenas acílicas están unidas fuertemente en una estructura cristalina, y la segunda, fluida, donde las cadenas presentan una mayor movilidad, asumiendo una configuración más al azar. Los lípidos pueden pasar de un tipo a otro. Este cambio de consistencia se conoce como transición de fase, y depende del tipo de lípido que conforme el liposoma. Esta transición no se observa en condiciones normales en las células, ya que las membranas tienen una mezcla de ácidos grasos, y no un solo tipo como las bicapas artificiales. El estado fluido es más común en bicapas con cadenas cortas o insaturadas, donde la factibilidad de que se produzcan interacciones de van der Waals entre las cadenas son menores al existir menor superficie activa. Los fosfolípidos de la membrana presentan una asimetría transversal, por lo que la composición de cada hoja de la bicapa es diferente. Aparentemente esta asimetría es característica de todas las membranas biológicas. Esencialmente se reconocen dos regiones no polares en la membrana, una región interior, en el corazón de la bicapa, y una periférica, en la que su fluidez está modulada por el grado de insaturación de las cadenas acílicas, y la presencia de glicerol. Esta insaturación hace que la temperatura de transición entre las fases cristalina y fluida sea menor, lo que permite la fluidez de la membrana en condiciones fisiológicas. Este hecho es muy importante, ya que permite la difusión lateral de los lípidos y la rápida deformación de las membranas durante la fusión y la endocitosis. Proteínas Las proteínas de la membrana fueron clasificadas en dos grupos por Singer y Nicholson, de acuerdo al método por el cual pueden ser extraídas. Estos grupos son: Periféricas (pueden extraerse por cambios de ph o fuerza iónica, sin romper la bicapa lipídica) Estructurales (sólo pueden extraerse por ruptura de la membrana con detergentes). El descubrimiento de ciertas proteínas ancladas a la membrana por lípidos, ha implicado incorporar un nuevo grupo, las proteínas unidas por lípidos, que no 57

6 Curso de Física Biológica pueden extraerse por cambios de ph o fuerza iónica, pero se extraen por mecanismos enzimáticos sin romper la estructura de la membrana. Las proteínas proveen a la membrana: Permeabilidad iónica selectiva Capacidad de transducción de energía Capacidad de responder a las señales y propagar la respuesta Sistemas de transporte para metabolitos hidrofílicos (glucosa, aminoácidos, etc.) Interacciones con moléculas extramembrana en el citoesqueleto y matriz intercelular Proteínas periféricas Las proteínas periféricas son típicamente proteínas globulares unidas iónicamente con el dominio polar de otra proteína, o posiblemente a la cabeza polar de los grupos de fosfolípidos. En general se encuentran por fuera de la membrana, vinculadas a la matriz lipídica por fuerzas de tipo coulómbicas. El citocromo c es el típico ejemplo de este tipo de proteínas, unido periféricamente a la membrana mitocondrial interna. Proteínas estructurales En la más simple conformación de estas proteínas, la cadena polipeptídica atraviesa completamente la bicapa y contiene tres dominios principales. El dominio central está formado por una cadena aminoacídica rica en residuos hidrofóbicos. Este dominio separa los dominios extracelular y citoplasmático, ricos en aminoácidos polares. Están vinculadas a la matriz por fuerzas de interacción lípido proteína. Las proteínas estructurales son importantes como: Receptores envueltos en la internalización de un ligando Receptores envueltos en las señales celulares 58

7 Nociones de Membrana Celular Receptores que son canales iónicos Receptores de antígenos Comunicación entre proteínas intra y extracelulares, particularmente entre proteínas de la cubierta celular y el citoesqueleto Transporte de iones o moléculas pequeñas solubles en agua (azúcares) Transductores de energía Además, algunas proteínas pueden reunir más de una función, tal como la bomba de Na y K. Las proteínas estructurales pueden dividirse en cuatro grupos sobre la base de su modo de inserción en la membrana (Figura 3). Estos grupos son: Monotópicas (no cruzan totalmente la membrana) Bitópicas (cruzan la membrana una vez de un lado a otro) Oligotópicas (cruzan la membrana dos veces) Politópicas (más complejas, cruzan la membrana hasta doce veces) Figura 3 Proteínas ancladas a lípidos Poseen características de ambos grupos. El grupo más importante de estas proteínas son las conocidas como proteínas G, que juegan una parte integral en gran parte de los eventos transmembrana, como la transducción de señales. 59

8 Curso de Física Biológica Arquitectura de las proteínas en el plano de la membrana Muchas proteínas pueden difundir en el plano de la membrana, de 100 a veces más lentamente que los lípidos. La difusión lateral de las moléculas proteicas es una parte importante de procesos tales como endocitosis, donde los receptores (cuando el ligando se ha unido), migran hacia el interior. No obstante, algunas condiciones de la membrana restringen la motilidad de las proteínas, como las uniones íntimas ( tight junctions ) y la interacción con estructuras asociadas a las membranas como el citoesqueleto y glicocalix, que pueden crear dominios especializados y polaridad funcional en ciertos tipos de células. Carbohidratos Los carbohidratos están presentes en la membrana como pequeñas cadenas de oligosacáridos (comúnmente ramificadas), unidas covalentemente a moléculas proteicas o lipídicas, como glicoproteínas o glicolípidos. En los eucariotas éstas se caracterizan por: Están concentradas principalmente en la membrana plasmática. Invariablemente la parte glucídica está expuesta en la cara externa de la membrana, en concordancia con su rol de receptor y antígeno. Glicolípidos Son de conformación similar a los fosfolípidos, aunque su parte polar está formada por residuos de monosacáridos. En los animales se encuentran los glicoesfingolípidos, que consisten en ceramidas unidas a oligosacáridos, que frecuentemente poseen ácido N acetilneuramínico. Son específicos de la membrana plasmática. De acuerdo a su cadena se dividen en: Cortos (menos de cinco residuos neutros, cadenas únicas) 60

9 Nociones de Membrana Celular Largos (cinco o más residuos neutros, en general cadenas ramificadas) Gangliósidos (tres a siete azúcares, cadenas frecuentemente ramificadas que contienen ác. Nacetilneuramínico) Glicoproteínas Se encuentran predominantemente en la membrana plasmática, donde los oligosacáridos están exclusivamente en el espacio extracelular. Proteoglicanos Los proteoglicanos, específicos de los eucariotas, son predominantemente carbohidratos compuestos por largas cadenas de azúcar no ramificadas (glicosaminoglicanos, 40 a 100 residuos) unidos a cortos segmentos polipeptídicos, usualmente por un residuo de serina. Están circunscriptos a la superficie externa de la célula, donde forman la matriz extracelular. Algunos están unidos fuertemente a la membrana por un corto polipéptido, mientras que otros solamente están unidos por fuerzas iónicas. Están envueltos en los fenómenos de adhesión célula a célula, y pueden actuar como ancla de ciertas enzimas que actúan en la interfase célulamedio extracelular. Organización y fluidez de los componentes de la membrana La idea de la bicapa lipídica fue sugerida por Gorter y Grendel en 1925, luego de extraer lípidos de membranas de eritrocitos. Estos experimentos, aunque basados en mediciones erróneas (defectos en el método de extracción, y por realizar los cálculos considerando al eritrocito como esférico en lugar de bicóncavo), proveyeron una llave vital para interpretar la estructura de la membrana. El modelo del mosaico fluido, aceptado actualmente, fue propuesto por Singer y Nicholson en 1972, interpretando a la membrana como una bicapa lipídica con proteínas adsorbidas a la superficie o insertadas en ellas. Los lípidos y las proteínas están 61

10 Curso de Física Biológica estructurados en un paquete unido, con exclusión de agua. Las fracciones polares están ubicadas hacia el interior y exterior de la célula. El colesterol, intercalado entre las cadenas acílicas, previene la transición de fase fluida a fase gel, que normalmente ocurre a bajas temperaturas, y a la vez ejerce un efecto restrictivo sobre la fluidez de la membrana. Tanto los lípidos como las proteínas pueden moverse libremente en forma lateral, aunque estudios modernos establecen que estos movimientos están limitados por interacciones con componentes del citoesqueleto. Los lípidos intercambian su posición con el vecino a razón de 10 7 veces por segundo. El movimiento entre capas ( flipflop ) es termodinámicamente desfavorable, ya que requiere el pasaje de la cabeza polar de los lípidos a través del corazón no polar de la membrana. Esto implica una asimetría en la distribución de los lípidos de la bicapa. Por ejemplo, los glicolípidos están circunscriptos a la cara externa de la membrana. Esta asimetría lipídica tendría un rol funcional, como soporte y regulación de las proteínas de la membrana, mantenimiento de la distribución de cargas, y con actividad sobre cationes esenciales como Ca y Mg. Los glicolípidos, colesterol y fosfolípidos son sintetizados en el RE y el aparato de Golgi, para luego ser transportados hasta su lugar en la membrana. Este transporte es mediado por proteínas transportadoras de lípidos. Estas proteínas cruzan la membrana y permiten llevar los lípidos de una capa a la otra en una forma independiente de difusión facilitada (flipasas). Este mecanismo es 10 5 veces más rápido que la difusión de lípidos entre capas ( flipflop ). Otras proteínas, las traslocasas, transportan fosfolípidos a través de la membrana con gasto de energía, usando energía liberada de la hidrólisis del ATP. Este transporte activo mantiene el desequilibrio en la distribución de los lípidos de las dos capas de la membrana. También existen proteínas de intercambio de fosfolípidos, que transportan una molécula de fosfolípido por vez entre dos membranas separadas por un medio acuoso. Las proteínas también muestran una asimetría en su distribución. Las proteínas unidas a azúcares, en general receptores hormonales o involucradas en el reconocimiento celular, 62

11 Nociones de Membrana Celular están ubicadas en la parte externa, y su paso hacia el interior, a través del corazón no polar, es termodinámicamente desfavorable. Uniones intercelulares La integridad y funcionalidad de los órganos y tejidos animales dependen de la organización de las células. Esta organización está realizada por regiones especializadas de la membrana llamadas uniones celulares. Hay tres categorías funcionales en las uniones: Desmosomas (mantienen las células unidas) Uniones íntimas o tight junctions (sellan las paredes impidiendo el paso de moléculas) Uniones con canales o gap junctions (forman canales de comunicación entre células, permitiendo el pasaje de pequeñas moléculas e iones). Concentración de sustancias en los líquidos intra y extracelular Se denomina líquido extracelular a todos los fluidos que están distribuidos en el exterior de la célula, como los líquidos vasculares, el líquido cefalorraquídeo, y el líquido intersticial. Éste último es el que está en contacto directo con las células y se caracteriza por no tener la cantidad de proteínas ionizadas que se encuentran en los líquidos vasculares. Se llama líquido intracelular a los fluidos que se hallan en el interior de las células. En el siguiente cuadro se ejemplifica la distribución de las concentraciones aproximadas de los iones (en estado estacionario) a ambos lados de la membrana del músculo de un mamífero. mm/cm 3 Líquido intersticial Líquido intracelular Na K H 3, Otros Cationes (Mg, etc.) 5 Cl HCO

12 Curso de Física Biológica Otros Aniones El siguiente esquema describe la distribución relativa de iones a ambos lados de la membrana (Figura 4). Existe una disposición desigual de iones a ambos lados de la membrana que origina un potencial de membrana, como se verá más adelante. M edio Intracelular K A Cl M E M B R A N A Medio Intersticial K Na Na Cl HCO 3 HCO 3 Figura 4 Dinámica de la membrana La célula puede incorporar materiales del medio a través de procesos conocidos como endocitosis. Se conocen tres tipos de endocitosis: Pinocitosis Fagocitosis Endocitosis mediada por receptores La pinocitosis es un proceso continuo de formación de vacuolas compuestas por porciones del medio externo con nutrientes disueltos, en general, derivados proteicos y otras macromoléculas, rodeadas de porciones de la membrana celular. Hay una adsorción del compuesto a incorporar a la superficie de la membrana cambiando la tensión superficial de la misma. Se produce una invaginación, conocida como vesícula pinocitótica que se separa de la superficie celular. Ya en el citoplasma, los lisosomas se adhieren a la superficie de la vesícula, volcando sus enzimas (hidrolasas) en el interior. Estas enzimas hidrolizan las proteínas a aminoácidos, que difunden a través de la membrana de la vesícula hacia el citoplasma. El cuerpo residual de la vesícula se 64

13 Nociones de Membrana Celular disuelve en el citoplasma, o es expulsado hacia el exterior. La fagocitosis es usada en la ingestión de materiales insolubles, que se unen a lisosomas. Éstos vuelcan sus enzimas al interior de la vesícula para digerir los sólidos, que luego pasarán al citosol celular. La endocitosis mediada por receptores se caracteriza por la unión de las macromoléculas a introducir al citoplasma con receptores específicos de la superficie celular. Tanto la macromolécula como el receptor son incorporados a la célula, y mientras que la primera es degradada y utilizada, el receptor es reciclado hacia la superficie. La célula también puede excretar sustancias hacia el exterior, utilizando un mecanismo conocido como exocitosis. Este mecanismo es la unión de vesículas intracitoplasmáticas con la membrana celular y liberación del contenido al exterior. Este mecanismo es importante en la secreción de hormonas por las glándulas endocrinas, la liberación de neurotransmisores por las neuronas, etc., como así también en el reciclado de la membrana. Transporte a través de la membrana 65

14 Curso de Física Biológica Los mecanismos de transporte a través de la membrana cumplen una función dinámica para mantener un medio interno tal que permita las reacciones bioquímicas necesarias para el mantenimiento de la vida. Una de las características principales de las membranas en este sentido es su permeabilidad selectiva. De acuerdo al gasto energético que produzca en la célula, el transporte puede clasificarse en pasivo, cuando el pasaje de sustancia que se realiza a favor de una diferencia de concentraciones y/o potencial sin gasto de energía, o activo, cuando se realiza en contra de una diferencia de concentraciones y/o potencial con gasto de energía. Básicamente hay dos tipos de procesos que permiten el intercambio de iones y moléculas a través de la membrana. Estos son: Transporte pasivo (Difusión pasiva y Difusión facilitada) Transporte activo Difusión pasiva Es el movimiento libre de moléculas a través de la membrana a favor del gradiente de concentración. Esto implica que la molécula se moverá desde donde está en mayor concentración hasta donde está en menor concentración. Si la molécula no es cargada, entonces el movimiento responde a la primera Ley de Fick de Difusión. Básicamente puede definirse como: El flujo neto de moléculas por unidad de área de membrana es proporcional al gradiente de concentración. El flujo (J) es un vector cuyo módulo mide la cantidad de partículas que atraviesan la unidad de área en la unidad de tiempo (moles/cm 2. seg.). Su dirección y sentido es desde la región de mayor concentración hacia la de menor concentración. El gradiente de concentración es un vector que indica la dirección y sentido en el cual crece la concentración (moles/cm 4 ). Ambos, flujo y gradiente de concentración, tienen la misma dirección pero distinto sentido. La ley de Fick puede expresarse como : J = D Grad conc. Donde J = vector flujo ; y D = coeficiente de Difusión El signo menos indica que estas dos magnitudes vectoriales son de sentido opuesto. Con fines de cálculo puede aproximarse a: 66

15 Nociones de Membrana Celular C siendo x J = D C x = Grad de conc., en una dimensión, como muestra la figura siguiente. C 1 grd C C 2 Sistema de espesor x que permite la diferencia de concentraciones J C 1 > C 2 x La constante de proporcionalidad en la expresión de la ley de Fick es el coeficiente de difusión D (cm 2 /seg), que depende, en general, de la temperatura (aumenta con la temperatura), del soluto (tamaño de las partículas a difundir) y del medio a través del cual difunde (membrana). Esta ley es válida sólo cuando el pasaje es debido exclusivamente a una diferencia de concentraciones que se mantiene en régimen estacionario (no varía con el tiempo). Permeabilidad de la membrana Se define como permeabilidad de la membrana al cociente entre el coeficiente de difusión y el espesor de la membrana, y se expresa en cm/seg. P = D e Aplicando la Ley de Fick al caso particular de una membrana celular podemos hacer las siguientes consideraciones: 67

16 Curso de Física Biológica Ce Ci grd C J Ce > Ci e Ci = conc. intracelular ; Ce = conc. extracelular ; e = espesor de la membrana Aplicando la ley de Fick: J = ( Ci Ce) D e D = ( Ce Ci) = P( Ce Ci) e Se denomina influjo al flujo de entrada a la célula y eflujo al flujo de salida de la célula. Si se representa en un par de ejes cartesianos el flujo (J) en función de la diferencia de concentraciones (Ce Ci) se obtiene una recta que pasa por el origen de coordenadas. La pendiente de la misma es el coeficiente de permeabilidad. J Tgα = P (Ce Ci) Como no actúan sitios específicos en la membrana, no se produce saturación aún cuando haya grandes concentraciones de soluto. No obstante, la ley de Fick no es aplicable a partículas cargadas, ya que la tasa de difusión de estas partículas no está determinada únicamente por el gradiente de concentración, sino también por el potencial eléctrico (diferencia de potencial) existente a través de la membrana, tal como se verá más adelante. La velocidad del pasaje a través de una membrana para una sustancia determinada, se 68

17 Nociones de Membrana Celular calcula como: V = J. A donde: V = velocidad de flujo ; J = flujo ; A = área de contacto La ley de Fick asume que no hay ninguna restricción impuesta a la molécula durante el pasaje a través de la membrana. No obstante, para cruzar la membrana las moléculas deberán disolverse en el corazón no polar de los ácidos grasos, lo que hará que las moléculas más hidrofóbicas, pasen más fácilmente. Esta facilidad para atravesar la membrana disolviéndose en la fase no polar, se conoce como liposolubilidad. Como la liposolubilidad de muchos compuestos orgánicos y la permeabilidad están relacionadas, puede establecerse si la sustancia atravesará o no la membrana por este medio, determinando el coeficiente de partición. Éste se determina colocando en un recipiente las dos fases inmiscibles entre sí (acuosa orgánica), y luego agregando el soluto a investigar. Se determinan las concentraciones de soluto en ambas fases en equilibrio y se calcula como: K solub. en fase orgánica = solub. en fase acuosa Siendo K = coeficiente de partición Si el valor es mayor que 1, la sustancia es liposoluble, si es menor, no será liposoluble. La teoría del enrejado explica adecuadamente la habilidad de muchas partículas no cargadas para difundir a través de las membranas. Esta teoría establece que la difusión ocurre por el movimiento de las partículas en vacancias producidas en la estructura de la capa lipídica, producidas por el movimiento aleatorio de los lípidos. Cuando la difusión lateral de los lípidos está aumentada (aumento de la temperatura o disminución del contenido de colesterol) aumenta el flujo de algunas sustancias. No obstante, esta teoría no sirve para interpretar la difusión de todas las moléculas a través de las membranas. El agua y los gases como el O 2, CO 2 y N 2, cruzan la membrana a mayor velocidad de la esperada, lo que sugiere la existencia de poros en la membrana. Estos poros pueden estar formados por el reacomodamiento de los lípidos de la membrana o por proteínas transmembrana, que permitirían el paso de sustancias polares. Por ejemplo, el agua cruza a través de la membrana por poros proteicos 69

18 Curso de Física Biológica llamados aguaporinas. Moléculas más grandes como azúcares, aminoácidos, y pequeñas partículas cargadas como Ca, Na, K, e H, no atraviesan la membrana por difusión simple o lo hacen muy lentamente, por lo que algunas teorías postulan la existencia de carga positiva dentro de estos poros. Se ha determinado experimentalmente que solamente sustancias de tamaño inferior a 8 Å atraviesan los poros. Sustancia Tamaño Velocidad relativa de pasaje Na hidratado 5,12 Å 1 agua 3 Å urea 3,6 Å K hidratado 3,96 Å 100 Cl hidratado 3,86 Å glucosa 8,6 Å 0,4 Transporte mediado por transportadores Como las paredes lipídicas son impermeables a compuestos iónicos o polares, éstos deben atravesar las membranas con la ayuda de proteínas transportadoras específicas o carriers, embebidas en la bicapa lipídica. Las membranas diferirán en la permeabilidad a ciertos compuestos de acuerdo al tipo de proteína transportadora que posean. De acuerdo al gasto energético producido se clasifican en difusión facilitada y transporte activo. El transporte mediado se diferencia significativamente de la difusión simple. Estas diferencias son: Es altamente específico para diferentes moléculas e iones Es más rápido Presenta cinética de saturación, esto es, existe una máxima tasa de transporte cuando todos los transportadores están saturados La cinética de este proceso se describe por la ecuación de la catálisis enzimática: 70

19 Nociones de Membrana Celular J = J max [ S] Km [ S] donde: J = Flujo ; J máx = Flujo máximo ; [S] = conc. de la sustancia a ser transportada K m = constante que depende del proceso enzimático correspondiente (carriers) Analizando esta expresión, vemos que: Si [S] = 0 ; J = 0 [S] = K m ; J = J máx /2 [S] = ; J J máx La representación gráfica mediante cuadro de valores da: J J max c donde: y = J y x = C El transporte a través de transportadores puede ser pasivo o activo. El transporte pasivo por transportadores se conoce como difusión facilitada, y se produce cuando un ion o molécula cruza la membrana a favor de su gradiente electroquímico o de concentración, hasta que se obtiene el equilibrio. No hay gasto energético, ya que la diferencia de energía libre ( G) para este proceso es negativa por moverse a favor de su gradiente. Nótese que a favor del gradiente no implica el sentido matemático, sino desde donde hay mayor concentración hacia donde hay menor concentración. Básicamente pueden darse dos formas diferentes de transporte. En la primera (caso 1), el soluto se une al transportador en el exterior, es transportado, liberado en el interior, y 71

20 Curso de Física Biológica luego el transportador vuelve al lado inicial. Caso 1 Líq. Extracelular Membrana Líq. Intracelular A (Soluto) XA XA A (Soluto) Transportador X X En el segundo caso, el transportador no vuelve solo, sino que se ha unido a un soluto del lado interior de la membrana, que lo acompañará en su vuelta al lado externo. Caso 2 Líq. Extracelular Membrana Líq. Intracelular Ae AeX AeX Ae Bi BiX BiX Bi Para un mol de una sustancia, la energía libre se calcularía como: G = 2.3 R T log [C2] / [C1] En el equilibrio, como ambas concentraciones son iguales, G vale cero. Para sustancias cargadas, se debe tomar en consideración el gradiente de potencial eléctrico existente a través de la membrana, siendo entonces G igual a: G = 2.3 R T log [C2] / [C1] z F V donde: z = valencia del ion ; F = constante de Faraday ; V = diferencia de potencial a través de la membrana Básicamente el mecanismo de transporte tiene cuatro etapas que son: 72

21 Nociones de Membrana Celular unión reversible del soluto a transportar a sitios específicos del transportador (receptores) desplazamiento del par receptorligando hacia la superficie opuesta de la membrana liberación del soluto vuelta del sistema al estado inicial La cantidad de sustancia que atraviesa la membrana por este mecanismo depende de: la diferencia de concentración del soluto a transportar entre ambos lados de la membrana la cantidad de transportador disponible. Cuando se saturan los transportadores se alcanza un flujo máximo (Cinética de saturación) la velocidad con que tiene lugar la unión y la separación entre el soluto y el transportador. A medida que aumenta la diferencia de concentraciones aumenta el flujo. A partir de una C determinada, los transportadores se saturan y el flujo alcanza un valor constante, llamado flujo máximo. Cualquier aumento de concentración a partir de ese punto no traerá aparejado cambio alguno en el flujo. Este tipo de comportamiento obedece a la ecuación de Michaelis Menten, como se observa en la representación gráfica. Diferentes sustancias como azúcares, aminoácidos y pequeños iones son transportados por difusión facilitada a través de las membranas. Un ejemplo es el transporte de glucosa a través de la pared del eritrocito desde el plasma sanguíneo hacia el interior de la célula. El transportador es una proteína estructural. La molécula de glucosa se une a un sitio específico en la superficie exterior de la proteína, e induce una modificación en la conformación del transportador que genera un poroexclusa para que la glucosa unida a la proteína llegue al citosol. Los transportadores se caracterizan por tener una gran especificidad. Esto implica que sustancias muy parecidas al soluto transportado, no atraviesan la membrana por este medio. 73

22 Curso de Física Biológica Estos mecanismos pueden ser activados o inhibidos por ciertas sustancias específicas. Por ejemplo, la insulina es capaz de aumentar la velocidad en el transporte de la glucosa de 7 a 10 veces, mientras que la ouabaína es utilizada para inhibir el funcionamiento de la bomba de Na y K. El transporte activo (transporte activo primario), a diferencia de la difusión facilitada, usa energía metabólica para transportar iones o moléculas en contra de su gradiente electroquímico o de concentración. La permeabilidad selectiva de las membranas biológicas es importante en la homeostasis celular. La célula mantiene una alta concentración de K y una baja concentración de Na, estableciendo gradientes iónicos que usará para conducir otros procesos de transporte. Así también, como el Ca es un importante segundo mensajero, su concentración intracelular se mantiene muy baja en la célula en reposo. Para mantener este medio iónico tan definido, la célula usa el transporte activo. Esto implica que la célula basa gran parte de su actividad en mantener el desequilibrio iónico. Este sistema consume más del 50% de la energía disponible, y es por lo tanto un factor muy importante en el metabolismo celular. El ion Na ingresa a la célula por flujo pasivo, mientras que el K sale al medio extracelular. Para que las concentraciones de Na y K permanezcan constantes, el flujo activo de cada ion debe ser igual pero de signo opuesto al correspondiente flujo pasivo. La bomba de Na y K mantiene constantes las concentraciones. Intracelular Extracelular Na J activo Na J pasivo Na Na K J activo K J pasivo K K 74

23 Nociones de Membrana Celular Por ejemplo, el transporte activo de Na y K a través de muchas células eucariotas es mediado por una proteína (PM Dalton) llamada Adenosin Tri Fosfatasa Na K dependiente (ATPasa Na K ), también conocida como bomba de Na y K, que envuelve directamente la hidrólisis del ATP. En la mayoría de las células en las que está presente bombea tres Na hacia el exterior de la célula, transportando simultáneamente dos K hacia el interior. Medio Intracelular Membrana Medio Extracelular ATP 3 Na ADP Pi Energía 2 K Se observan tres fenómenos simultáneos y acoplados: ingreso de dos K, egreso de tres Na, e hidrólisis del ATP a ADP Pi energía en el medio intracelular. Para la ocurrencia del fenómeno, los tres factores deben estar presentes. En ciertas células animales, la bomba es importante para general el potencial de la membrana, dada la facilidad con que el K tiende a salir de la célula a favor de su gradiente de concentración, favoreciendo que el interior de la membrana quede cargado negativamente. En el organismo hay otras bombas, como por ejemplo bombas de H en el epitelio del estómago, bomba de I en la glándula tiroides, bomba de Ca en el retículo sarcoplasmático muscular, bombas de Na, Cl, Ca e H en las células intestinales y en los túbulos renales, etc. La signología de ciertas patologías pueden afectar el mecanismo de la bomba, como por ejemplo la degeneración globosa producida por el virus aftoso, o la diarrea profusa en el 75

24 Curso de Física Biológica enfermo de cólera. El mecanismo de cotransporte activo (transporte activo secundario) es aquél que implica el movimiento de una molécula a favor de su gradiente eléctrico o de concentración, acoplado al pasaje de otra molécula en contra de su gradiente de concentración. El cotransporte puede suceder tanto si la molécula transportada y el ion cotransportado se mueven en la misma dirección, como la absorción de glucosa y aminoácidos unidos a la entrada de Na en la luz intestinal, o en direcciones opuestas, como la entrada de Na unida a la salida de Ca en las células musculares cardíacas. Actividad Eléctrica de la Membrana Introducción Hay dos sistemas que operan a nivel supracelular para coordinar las acciones realizadas por células y tejidos. Éstos son el sistema endocrino y el sistema nervioso. Mientras que el primero se encuentra tanto en animales como en plantas, el sistema nervioso es exclusivo de los animales. Una diferencia de potencial eléctrico existe en todas las células vivas entre las caras externa e interna de la membrana celular. Esta diferencia de potencial se llama potencial de membrana en reposo, y, en la mayoría de las células, su valor se encuentra entre 70 y 90 mv (con el lado interno negativo). El potencial en reposo resulta de la inequidad en la distribución de iones a ambos lados de la membrana, existiendo siempre un exceso de cationes por fuera de la célula. En un tipo especial de células animales, las llamadas células excitables, el potencial de membrana puede modificarse temporariamente de su valor de equilibrio, como respuesta a un estímulo dado. Esta respuesta se llama potencial de acción, que llega a valores aproximados de 30 mv, con el interior de la célula positivo con respecto al exterior. Este potencial puede transmitirse a través de la membrana plasmática de la célula, e inclusive pasar de una célula a otra. La transmisión de este potencial es la base del impulso nervioso. 76

25 Nociones de Membrana Celular Concentración de iones en los líquidos intra y extracelular El líquido extracelular, fluido que se encuentra en el exterior de la membrana, se divide en varios tipos de acuerdo a su ubicación en el organismo. El líquido que baña a las células se conoce como intersticial, y se diferencia del vascular (discurre en los vasos del sistema circulatorio), en no tener proteínas ionizadas disueltas. Normalmente, los iones se distribuyen a ambos lados de la membrana (en estado estacionario) en forma particular, no equilibrada. Esto es, manteniéndose un desequilibrio entre las concentraciones de cada uno de los iones. Dentro de los iones que se encuentran en mayor cantidad en el líquido intersticial encontramos: Na, Ca, Cl y HCO 3, mientras que en el líquido intracelular encontramos: K, Mg, PO 4 H y aniones no difusibles, en general, proteicos. Potencial de membrana en reposo El potencial de membrana en reposo está dado por una cantidad de cationes ubicados en el exterior de la célula, no compensados por el mismo número de aniones. El exceso de cationes no es detectable químicamente, ya que la diferencia es del orden de en promedio. El pequeño desbalance iónico es suficiente para mantener el potencial de membrana, ya que la capacidad eléctrica de la membrana es baja. Varios mecanismos metabólicos mantienen el exceso de cationes afuera de la célula. Algunos de esos procesos son antagonistas entre sí, sin embargo, la actividad total resulta en el mantenimiento de un equilibrio estable. Tres procesos están implicados: Bomba de Na y K, que cotransporta Na hacia afuera y K hacia adentro de la célula, con hidrólisis de ATP. Difusión pasiva de Na y K, mecanismo opuesto a la bomba. Difusión pasiva de otros iones, mayormente Cl, como consecuencia de gradientes de potenciales electroquímicos generados por una variedad de mecanismos. El mantenimiento del potencial de membrana en reposo estable está determinado entonces por gradientes iónicos específicos, sumado a la permeabilidad selectiva de la membrana para los diferentes iones. 77

26 Curso de Física Biológica Determinación experimental del potencial de membrana Básicamente se realiza un circuito formado por una célula que tendrá insertado un microelectrodo de vidrio con una aguja no mayor de 1µ lleno de solución concentrada de KCl, un osciloscopio y otro electrodo sumergido en el líquido que baña a la célula. Dado que los valores de potencial son del orden de mv (10 3 V), se incorpora un amplificador que permite determinar esas pequeñas diferencias. Pasaje de partículas cargadas Como hemos visto anteriormente, las partículas pequeñas no cargadas difunden a través de la membrana respondiendo a la Ley de Fick. Cuando las partículas son cargadas, no solamente atraviesan las membranas por diferencias de concentración, sino que también por diferencias de potencial. Esto se debe a que la membrana se comporta como un condensador plano, siendo cada cara una placa del condensador, y el espesor de la membrana, el espacio entre las placas. Los siguientes gráficos muestran como son los flujos para los iones mayoritarios. 78

27 Nociones de Membrana Celular Para el Na : I Na Na E [Na ]e > [Na ]i J ( c) (Flujo debido a c) J ( v) (Flujo debido a v) J neto = J ( c) J ( v) Para el K : I K K E [K ]e < [K ]i J ( c) (Flujo debido a c) J ( v) (Flujo debido a v) J neto = J ( c) J ( v) Resumiendo: Ion de Potencial de Concentración Flujo Neto Na Influjo Influjo Influjo K Influjo Eflujo Eflujo Cl Eflujo Influjo 0 En el caso del Cl, como el flujo neto es 0, se dice que el ion está en equilibrio pasivo. Entonces se denomina equilibrio pasivo al caso en que el flujo neto es nulo. Esto implica que no hay pasaje neto de iones y, en consecuencia, las concentraciones 79

28 Curso de Física Biológica permanecen constantes. En términos físicos, el potencial de membrana en reposo, que es la diferencia de potencial que puede medirse a ambos lados de la membrana, puede ser asimilado a un potencial de difusión, pasible de ser estimado por las concentraciones en equilibrio de los iones, utilizando la ecuación de GoldmanHodgkinKatz, que responde a: donde: 80 E = RT F ln E = Potencial de membrana en reposo [ Na ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] i. P Ki. P Cle. P Na K Cl Nae. P Ke. P Cli. P Na K Cl P = Coeficiente de permeabilidad para cada ion i = Concentración interna e = Concentración externa R = Constante de los gases T = Temperatura en grados K F = Constante de Faraday En la práctica, solamente el Na, K y Cl tienen concentración suficiente o coeficientes de permeabilidad importantes para tener influencia en el valor final del potencial de membrana en reposo. La capacidad eléctrica de un capacitor (usualmente llamado condensador), se define como la razón de la carga eléctrica sobre la diferencia de potencial entre las caras. La bicapa lipídica actúa como un dieléctrico, separando los medios conductores intra y extracelular. La capacidad por cm 2 de las membranas biológicas se estima en aproximadamente 10 6 Faradios (1 Faradio = 1 culombio / 1 voltio), lo que corresponde a una diferencia de concentraciones de mol/cm 2. Estas pequeñas diferencias de concentraciones son suficientes para originar una diferencia de potencial de 100 mvolt. Suele usarse los valores de permeabilidad relativa al K de los iones monovalentes, siendo: P K = 1 ; P Na = 0.04 ; P cl = 0.45 Esta distribución iónica no homogénea entre los dos compartimentos separados por una membrana se mantiene alejada del equilibrio pasivo a causa de los procesos de

29 Nociones de Membrana Celular transporte con gasto de energía (transporte activo). La membrana alcanza un estado estacionario cuando los flujos que tienden a alejar el sistema del equilibrio igualan a los flujos que tienden a llevarlo al equilibrio. De acuerdo a lo visto hasta ahora, los factores que influyen en la formación del potencial de membrana celular son en consecuencia los aniones no difusibles (como fosfato orgánico, sulfato y proteinatos), que juntamente con los iones difusibles tienden a mantener un equilibrio de Gibbs Donnan (ver más adelante) y por otro lado la bomba de sodio y potasio, que aleja a la membrana del equilibrio pasivo. En el estado estacionario, el valor del potencial de membrana depende tanto de las concentraciones intra y extracelular de los iones Cl, Na y K como de sus respectivas permeabilidades. Si se analiza individualmente cada ion se comprueba que el Cl alcanza un equilibrio Gibbs Donnan (pasivo), en tanto que el Na y el K se alejan de este equilibrio por la acción de mecanismos activos. Potencial de equilibrio de un ion Se define como el valor del potencial de membrana tal que el ion se encuentre en equilibrio pasivo, o sea, que su flujo neto sea 0. El potencial de equilibrio puede tomar cualquier valor, dependiendo de la relación de concentraciones del ion a cada lado de la membrana. Puede calcularse por la Ecuación de Nernst: E = potencial de equilibrio R = Constante de los gases T = Temperatura en grados K F = Constante de Faraday [ Cb/mol] z = Carga relativa al electrón C 1 y C 2 = concentración intra y extracelular [ C ]. 1 [ C ]. 2 RT E = ln zf ; siendo Esta ecuación se obtiene al considerar que, en el equilibrio, actúan sobre el ion dos fuerzas opuestas de igual módulo, fuerzas eléctricas y fuerzas difusivas, que son iguales 81

30 Curso de Física Biológica en magnitud, pero de distinto signo. Para el ion Cl se observa que el potencial de equilibrio, calculado por la ecuación de Nernst, coincide con el potencial de membrana en reposo medido en forma experimental. Es decir, el ion Cl se encuentra en equilibrio pasivo. El ion K tiene un potencial de equilibrio próximo al potencial de membrana en reposo, debido a su alta permeabilidad, mientras que el ion Na está más alejado de este valor. Ninguno de ellos se encuentran en equilibrio pasivo, merced a la acción de los transportes activos, mencionados anteriormente. Por otra parte debe recordarse que el valor modular del eflujo de K es menor que el correspondiente al Na, tal como se vio anteriormente. Cálculo de los trabajos eléctrico y difusivo en la obtención de la ecuación de Nernst Trabajo realizado por las fuerzas eléctricas C 1 C 2 J ( v) C 1 > C 2 carga () 1 mol Si una carga q está sometida a una diferencia de potencial V, el trabajo debido a las fuerzas eléctricas vale W = qv Considerando 1 mol de ion de carga positiva, que se traslade de C2 a C1, el trabajo de origen eléctrico se puede calcular como: W e = n. Z. F. E. = Z. F. E Donde : We es el trabajo eléctrico [Joule] ; q es la carga = n. Z. F, siendo n el n de moles y Z el equivalente de carga del ion ; F = Cb/mol ; y E el potencial de 82

31 Nociones de Membrana Celular equilibrio [en voltios]. Trabajo realizado por las fuerzas difusivas El proceso de difusión es un proceso irreversible para el cual no hay cálculo riguroso del trabajo realizado durante el mismo. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, puede ser considerado como la expansión isotérmica de un gas ideal. En este caso: V Wd = R. T.ln 2 V1 Se puede considerar que la concentración es igual al número de moles por unidad de volumen. Si tomamos un mol C = 1/V entonces: C = y C2 = V V 1 2 Reemplazando V por las concentraciones resulta: C Wd = R. T.ln 1 C2 En el equilibrio el J neto es nulo, y el trabajo de las fuerzas eléctricas es igual al trabajo de las fuerzas difusivas, o sea: We = Wd Reemplazando queda: C Z. F. E = R. T.ln C Si se despeja se obtiene la Ecuación de Nernst: E = RT. ZF. C ln 1 C2 La ecuación de Nernst aplicada al caso específico de la membrana se expresa como: 1 2 E R T =. Z. F ln Ce Ci donde Ce = concentración extracelular ; Ci = concentración intracelular Ejemplo: En el músculo esquelético se han determinado los valores de concentración de los iones Na, K y Cl, principales iones que intervienen en el valor del potencial de 83

32 Curso de Física Biológica membrana en reposo, el valor del potencial de membrana, y el potencial de equilibrio calculado para cada ion con la ecuación de Nernst, como se observa en la tabla siguiente: [Na ] [K ] [Cl ] Em E Na E K E Cl meq/l meq/l meq/l (reposo) (mv) (mv) (mv) (mv) Líq. Int Líq. Ext ,5 90 A 37ºC la ecuación se puede simplificar: E R. T Ce = ln = Z. F Ci 8, 31Joule. 310 K 23, log Z. K. mol Cb/ mol Ce Ci 0, 061Volt Ce 61 mvolt Ce E = log = log Z Ci Z Ci ENa Ce = 110 meq / l Ci = 13 meq / l ENa = 61mVolt 110 meq / l log 1 13 meq / l = 56 mvolt EK Ce = 25, meq / l Ci = 140 meq / l EK = 61mVolt 25meq l log, / meq / l = 105 mvolt ECl Ce = 90 meq / l Ci = 3 meq / l ECl = 61mVolt 90 meq / l log 1 3 meq / l = 90 mvolt 84

33 Nociones de Membrana Celular Equilibrio de GibbsDonnan Los experimentos llevados a cabo por Gibbs y Donnan en 1911, permitieron establecer la posibilidad de generar un potencial de membrana mediante transporte pasivo exclusivamente. En el experimento original, en una cubeta llena con agua destilada, y dividida en dos compartimentos por una membrana semipermeable selectiva, se incorporó a uno de ellos el colorante Rojo Congo, que se disocia en aniones (A ) y cationes Na, y en el otro NaCl, que se disocia en iones Cl y Na. Los aniones del Rojo Congo no pueden difundir a través de la membrana, mientras que los pequeños iones Cl y Na, así como el agua, pueden hacerlo en ambos sentidos. I Estado Inicial II A Na Agua M E M B R A N A Cl Na Agua Las dos restricciones que deben verificarse para que este equilibrio se cumpla son: el anión A no difunde a través de la membrana no hay pasaje neto de cargas y se conserva la neutralidad eléctrica Una vez que se establece el equilibrio de distribución de iones se constata que el Cl y el Na se reparten en forma desigual entre las soluciones, a ambos lados de la membrana. La concentración de Cl es mayor en el compartimento II. La tendencia del anión no difusible a atravesar la membrana hace que se ubique sobre la cara de la misma, provocando una densidad de cargas negativas. Estas cargas negativas son equilibradas por cargas positivas de Na, ubicadas sobre la otra cara de la membrana (en el otro compartimento). Dada la electroneutralidad, ambos 85

34 Curso de Física Biológica compartimentos tiene carga neta 0. I Estado Final II A Na Cl Agua M E M B R A N A Cl Na Agua Tal que: [Cl ] I < [Cl ] II [Na ] I > [Na ] II En el estado final, cuando se alcanza el equilibrio, se observan tres consecuencias: El producto de las concentraciones de los iones difusibles a ambos lados de la membrana es igual. Esto se desprende de aplicar la ecuación de Nerst para cada ion, ya que están en equilibrio pasivo, e igualarlas, de la siguiente forma: [ Cl ] [ Cl ] RT. II RT. E = ln = ln ZF. ZF. I [ Na ] [ Na ] II I RT. F ln [ Cl ] [ Cl ] I II = RT. F ln [ Na ] [ Na ] II I [ Cl ] En consecuencia: [ Cl ] I II [ Na ] [ Na ] II = ó [Cl ]I. [Na ]I = [Cl ]II. [Na ]II I Se origina un potencial de membrana. Esto se debe a la presencia del anión no difusible, que le da la polaridad al lado de la membrana donde se encuentra. Dado que es un equilibrio, puede ser calculado por la ecuación de Nerst. Hay un desequilibrio osmótico. Se observa porque la suma de los iones del compartimento donde está el anión no difusible es mayor que en el otro. Si no existiera el ion no difusible en uno de los compartimentos, en el equilibrio se 86