Sistemas Analíticos Avanzados para Estudios de Metabolómica no Dirigida Aplicados a Alimentos

Transcripción

1 SEMINARIO 2014 TECNOLOGÍA DE ÚLTIMA GENERACIÓN EN LOS LABORATORIOS DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROMETRIA Sistemas Analíticos Avanzados para Estudios de Metabolómica no Dirigida Aplicados a Alimentos Fernando Vallejo Mellado (metabolomica@cebas.csic.es)

2 CEBAS - CSIC El CEBAS-CSIC es un Instituto de Investigación singular pues se trata de un centro multidisciplinar que lleva a cabo investigaciones en tres áreas científico-técnicas relacionadas (Ciencias Agrarias, Ciencia y Tecnología de los Alimentos, y Recursos Naturales)

3 RECIENTE CREACION SERVICIO DE METABOLOMICA

4 SOLICITUD DEL SERVICIO DE METABOLOMICA

5 INICIOS DE LA METABOLOMICA J.K. Nicholson (1999) Metabonómica como la medida cuantitativa de la respuesta metabólica a los estímulos fisiológicos o modificaciones genéticas Oliver Fiehn (2001) Análisis global y cuantitativo de todos los metabolitos, las moléculas de medio y bajo peso molecular (entre 30 y Da), que dan cuenta de distintas reacciones de las células en un entorno Bill Lasley (2004) La Genómica y Proteómica te dicen lo que podría pasar pero la Metabolómica te dice que es lo que esta pasando en realidad

6 POR QUE METABOLITOS? Lo que puede pasar Genómica (~ genes) Lo que parece estar pasando Transcriptómica (~ transcriptos) Lo que va a pasar Proteómica (~10 6 proteínas) Lo que ha pasado y esta pasando Metabolómica (~2500 metabolitos) - Fenotipo + Fenotipo - El metaboloma da lugar a los fenotipos (Dieta, Estado Fisico, Edad, Sexo) - Los metabolitos son mejores biomarcadores que genes y proteínas - Regulan los diferentes niveles de proteínas y la transcripción de genes y proteínas Nº publicaciones ISI web Metabolomica

7 TOMA, CONSERVACION Y EXTRACCION DE METABOLITOS DE LA MUESTRA (KEY-STEP)!! IMPOSIBLE EVITAR PERDIDAS!! OBJETIVO: AISLAMIENTO DE TODOS LOS METABOLITOS PRESENTES EN LA CELULA RETOS: TAMAÑOS Y POLARIDADES DIFERENTES. INESTABILIDAD DE LOS METABOLITOS REALIDAD: NO HAY UN UNICO PROTOCOLO DE EXTRACCION QUE CUBRA TODO EL METABOLOMA Ph Temperatura Solventes SPE

8 PLATAFORMAS ANALITICAS-METABOLOMA COMPLETO Human Metabolome Project: The Human Serum Metabolome Nikolaos Psychogios et al. Plos One (2011) GC-QTOF UPLC-QTOF RMN METABOLITOS APCI ESI METABOLITOS METABOLITOS µg/ml RMN VENTAJAS DESVENTAJAS RMN REPRODUCIBILIDAD SENSIBILIDAD ROBUSTEZ SOLAPAMIENTO PICOS CUANTITATIVO AUTOMATIZACION ng/ml GC-MS RESOLUCION CUANTIFICACION ROBUSTEZ DERIVATIZACION SENSIBILIDAD BASES DE DATOS pg/ml LC-MS LC-MS EXCELENTE SENSIBILIDAD SUPRESION IONIZACION MASA EXACTA Y ROTURAS CUANTIFICACION LIBRERIAS/DB COBERTURA METABOLOMA

9 APROXIMACION EN METABOLOMICA CLASIFICACION GLOBAL ANALISIS RAPIDO (FINGERPRINTING) ANALISIS GRUPO METABOLITOS (PROFILING) ANALISIS NO DIRIGIDO

10 METABOLÓMICA NO DIRIGIDA TOF Profiling Profinder Mass Profiler Professional Intensidad Masa Exacta Tiempo UPLC-QqQ Rutas Metabólicas Molecular Structure Correlator QTOF (MS/MS) Cuantificación Biomarcador METLIN; HMDB; KEGG; METFRAG

11 ANALISIS ESTADISTICO (MASS PROFILER PROFESIONAL) 1. Datos Profinder (Algoritmo Recursivo) 2. Alineamiento, Normalización, Transformación línea base 3. QC Features Filtros Frecuencia/Abundancia 4. QC Muestra Análisis No supervisados (PCA-3D)

12 ANALISIS ESTADISTICO (MASS PROFILER PROFESSIONAL) 5. Análisis Estadístico (T-test; ANOVA; MTC; Post-Hoc; FC) 6. QC Muestra (Cluster; Diagrama Venn) 7. Modelos Predictivos Análisis Supervisados (PLS-DA) Y HASTA AQUÍ EL 50% DEL TRABAJO.Y ADEMAS EL MAS FACIL!!

13 METABOLÓMICA NO DIRIGIDA. IDENTIFICACION Patrón disponible Identificación Metabolitos (Molecular Structure Correlator) Metabolic Pathway METLIN; HMDB; KEGG; METFRAG

14 ALTERNATIVAS PARA LA IDENTIFICACION TENER CERCA UN BUEN QUIMICO Flash-Crom. SemiPrep (Amb/Sephadex)

15 EJEMPLO ESTUDIO DE METABOLOMICA EN ALIMENTOS NO DIRIGIDA UPLC-QTOF (6550)

16 TRATAMIENTOS TECNOLOGICOS PARA INCREMENTAR LA BIODISPONIBILIDAD DE ZUMOS DE NARANJA CITRUS JUICE EXTRACTOR AND PADDLE FINISHER PAST FRESH SQUEEZED HPH HIGH PRESSURE HOMOGENIZER LANE LATE VALENCIA LATE ORTANIQUE

17 MODELOS NO SUPERVISADOS (PCA, CLUSTER)

18 MODELOS SUPERVISADOS DISCRIMINATORIOS (PLS-DA) Cross-Validation (N-Fold=3). 2 partes validar modelo; 1 parte construir modelo

19 IDENTIFICACION. LIBRERIAS PUBLICAS KEGG, CHEMSPIDER, MASS BANK

20 EJEMPLO ESTUDIO DE METABOLOMICA EN ALIMENTOS DIRIGIDA UPLC-QqQ (6460)

21 METABOLOMICA DIRIGIDA. METABOLITOS DE FASE II. BIOMARCADORES DE INGESTA. HO3SO 3 O CH3 Gluc-O 3 O CH3 HO3SO 7 A O C B Gluc-O 7 A O C B 5 O H O HESPERETIN 7-O-SULPHATE HESPERETIN 3 -O-SULPATHE 5 OH O HESPERETIN 7-O-GLUCURONIDE HESPERETIN 3 -O-GLUCURONIDE

22 METABOLITOS DE FASE II EN ORINA ANALIZADOS POR UPLC-QqQ (AGILENT 6460) HESPERETIN DIGLUCURONIDE NARINGENIN DIGLUCURONIDE HESPERETIN SULFOGLUCURONIDE HESPERETIN GLUCURONIDE NARINGENIN GLUCURONIDE HESPERETIN SULPHATE

23 CITOSINAS HIDROXIMETILADAS DE ADN ANALIZADAS POR UPLC-QqQ (AGILENT 6460) 5hmdC 5hmC 5mdC 5mC dc C

24 ALCALOIDES EN TOMATE ANALIZADOS POR UPLC-QqQ (AGILENT 6460)

25 METODOS EN PREPARACION PARA UPLC-QqQ S-AMe/S-Ah EN PLASMA LACTULOSA/MANITOL EN ORINA EICOSANOIDES AA/DHAA EN MUESTRAS VEGETALES/MODELOS IN VIVO TAURINA EN ATUN AMIGDALINA (VIT B17) EN EXTRACTOS DE ALMENDRA

26 GRACIAS POR VUESTRA ATENCION, PREGUNTAS??