Prof. Laura Carmona Salazar Semestre: 13-II

Transcripción

1 FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA CURSO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA (CLAVE 1807) Licenciatura de QFB Prof. Laura Carmona Salazar Semestre: 13-II Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

2 ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

3 ENZIMOLOGÍA CLÍNICA Los enzimas como catalizadores biológicos Determinación de la actividad enzimática Los enzimas como marcadores de lesión tisular Enzimas séricas de importancia en el diagnóstico clínico

4 ESTRUCTURA Y NATURALEZA DE LOS ENZIMAS

5 EL ARREGLO DE UNA PROTEÍNA PARTICULAR ES EL RESULTADO DE SU SECUENCIA ÚNICA Y ESPECÍFICA DE AMINOÁCIDOS Y ES INDISPENSABLE PARA SU FUNCIONALIDAD HayLoh,2012 Chemistry 18(26):7984

6 LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEPENDE DE LA INTEGRIDAD DE SU CONFORMACIÓN PROTEICA NATIVA ADEMÁS PUEDEN REQUERIR DE OTROS COMPONENTES QUÍMICOS ADICIONALES

7 COENZIMAS FUNDAMENTALES PARA LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE VARIOS ENZIMAS VITAMINA COENZIMA REACCIÓN EN LA QUE ESTÁ INVOLUCRADA Tiamina (vitamina B1) Tiamina pirofosfato Activación y transferencia de aldehídos Riboflavina (vitamina B2) Niacina Flavin mononucleótido o FMN; flavin adenin dinucleótido o FAD +, Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD + ; Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP + Oxidación-reducción Oxidación-reducción Ácido pantoténico Coenzima A Activación y transferencia de grupos acilo Piridoxina Fosfato de piridoxal Reacciones que involucran la activación de aminoácidos Biotina Biotina Activación y transferencia de CO2 Ácido lipoico Lipoamida Activación del grupo acilo:oxidaciónreducción Ácido fólico Tetrahidrofolato Activación y transferencia de grupos funcionales de un sólo carbono Vitamina B12 Adenosil cobalamina; metil cobalamina Isomerizaciones y transferencia de grupos metilo

8 CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS ACORDE A LA REACCIÓN QUE CATALIZAN 1) Oxidoreductasas.- Reacciones redox que involucran transferencia de electrones 2) Transferasas.- Reacciones de transferencia de grupos funcionales 3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis 4) Liasas.- Crean dobles enlaces 5) Isomerasas.- Reacciones de isomerización 6) Ligasas.- Formación de puentes con rompimiento de ATP

9 LOS ENZIMAS CATALIZAN REACCIONES DE MANERA EFICAZ Y ALTAMENTE ESPECÍFICA COMPLEJA ESTRUCTURACIÓN PROTEICA INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO ESPECIFICIDAD

10 QUÉ HACEN LOS ENZIMAS?

11 LOS ENZIMAS FACILITAN LA FORMACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN (Proporcionando una superficie complementaria a su estereoquímica, polaridad ocarga) Estado de transición S Energía libre Estado basal Estado basal Energía libre Coordenada de reacción (cambios químicos)

12 REACCIÓN QUÍMICA S P EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL G Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA, ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD

13 CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga de estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente. OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción y evaluar como se ve modificada ésta en respuesta a cambios en los parámetros experimentales nmoles gramos miligramos µgramos VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por la enzima por unidad de tiempo Por tanto sus unidades son cantidad de compuesto sobre unidad de tiempo: moles µmoles hora minuto segundo

14 S P E + S ES E + P ESTADO PRE-ESTACIONARIO

15 Concentración del sustrato VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

16 QUÉ ES ACTIVIDAD Y CANTIDAD DE UN ENZIMA? ACTIVIDAD: Cantidad transformada por unidad de tiempo (moles/s) ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Actividad enzimática por cantidad de enzima (moles/s/mg de proteína) CANTIDAD: Se refiere a la concentración del enzima (mg, mg/ml, actividad enzimática/ml)

17 CÓMO SE DETERMINA LA CANTIDAD DE ENZIMA EN UNA MUESTRA?

18 METODOLOGÍA UTILIZADA PARA LA DETERMINACIÓN DE ENZIMAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS MÉTODOS INMUNOLÓGICOS.- Que determinan la cantidad de enzima MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS.- Que establecen la actividad catalítica de las enzimas

19 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La velocidad de una reacción se puede expresar como cantidad de sustrato consumido o como cantidad de producto formado Lo cual puede monitorearse espectrofotométricamente a través de determinar los cambios en la absorción óptica de la solución que contiene los sustratos y el enzima 1 UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Cantidad de enzima que puede transformar 1 µmol de sustrato por minuto

20 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UNA MUESTRA BIOLÓGICA

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23 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

24 CÓMO CONVIERTO LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA OBTENIDA EN UI?

25 Para obtener el valor definitivo de actividad enzimática aplicamos la siguiente fórmula:

26 Donde: ε = coeficiente de extinción molar b = es el espesor de la cubeta VF = es el volumen total de reacción VI = es el volumen de muestra en el ensayo Los parámetros: son constantes por tanto podemos la fórmula anterior queda como: UI/L=?A/min cte

27 CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA No utilizar muestras congeladas y descongeladas varias veces. Separar lo antes posible el coágulo del suero Evitar trabajar con muestras hemolizadas Evitar estasis venosa durante la extracción Evitar el envejecimiento de las muestras El transporte de las muestras debe realizarse en frío sin congelar, salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo.

28 CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EDTA: Variables que afectan al análisis clínico. EDTA y hemólisis Su efecto anticoagulante se basa en su capacidad para quelar iones divalentes como calcio o magnesio. No es posible determinar la actividad de enzimas que requieran estos iones. MUESTRAS HEMOLÍTICAS: La ruptura de los eritrocitos hace que su contenido pase al plasma. Las muestras presentan una coloración roja intensa muy característica debida a la presencia de hemoglobina. La hemólisis puede ser causada por una patología o, en la mayor parte de los casos, un procesamiento indebido de la muestra.

29 CARACTERÍSTICAS DE LOS ENZIMAS UTILIZADOS COMO MARCADORES EN LA CLÍNICA

30 LOS ENZIMAS SE UTILIZAN COMO MARCADORES DE LESIÓN TISULAR SIGNIFICADO CLÍNICO DEL PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE ALGUNOS ENZIMAS

31 DETERMINACIÓN DEL PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE LACTATO DESHIDROGENASA (LDH)

32 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LAS ISOFORMAS DE LDH PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE LDH EN DIFERENTES PATOLOGÍAS

33 QUÉ PUEDE PROMOVER CAMBIOS EN LAS CONCENTRACIONES DE LOS ENZIMAS?

34 LOS ENZIMAS PUEDEN SER INDICADORES DE UNA LESIÓN CELULAR Y TISULAR

35 IMPORTANCIA DEL ESTUDIO ENZIMÁTICO

36 ENZIMAS UTILIZADOS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO - Alanina aminotransferasa (ALT) - Aspartato aminotransferasa (AST) - Creatina kinasa (CK) - Fosfatasa alcalina (AP, ALP, SAP) - g-glutamil transpeptidasa (GGT) - Amilasas -Lipasas

37 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LAS TRANSAMINASAS

38 ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT) También llamada GPT (Transaminasa glutámico-pirúvica) Función: cataliza la transferencia de alanina al ácido a- cetoglutárato, formando piruvato y ácido glutámico) Localización: citoplasma Valores normales: < 50 U/ml Aumento importante: Shock, hepatitis Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,

39 ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) También conocida como GOT (Transaminasa glutámico-oxalacético) -Función: cataliza la transferencia del grupo a-amino del ácido aspártico al ácido a-cetoglutárico, formando oxaloacetato y glutámico) Localización: citoplasma y mitocondria Valores normales: < 40U/ml Aumento importante: Infarto del miocardio, hepatitis, traumatismos Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis

40 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA CREATINA CINASA

41 CREATINA CINASA (CK Ó CPK) Función: importante para la contracción muscular. Transfiere el fosfato de la fosfocreatina al ADP, formando ATP Localización: citoplasma y mitocondria de miocitos Isoenzimas: CK-1: isoenzima BB, cerebro CK-2: isoenzima MB, músculo cardíaco y esquelético CK-3: isoenzima MM, músculo esquelético y cardíaco CK-Mt: membranas mitocondriales. Músculo cardíaco Valores normales: < 160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres Aumento importante: Infarto de miocardio CK-MB Aumento moderado: miopatías, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular

42 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA FOSFATASA ALCALINA

43 FOSFATASA ALCALINA (AP, ALP, SAP) Función: metaloenzima que cataliza la hidrólisis de diferentes ésteres de fosfato. Requiere ph alcalino y cofactores (iones zinc y magnesio) Localización: asociada a membrana Valores normales: U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños en desarrollo Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vías biliares, cirrosis, hepatomas Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo

44 G-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT) Función: Cataliza la transferencia de grupos glutamil C-terminales de unos péptidos a otros o a aminoácidos. Es importante en el metabolismo del glutatión, la absorción de aminoácidos y en la antioxidación Localización: membrana y citoplasma (5%) Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis hepáticas, enf. alcohólica Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

45 AMILASAS (α-amilasa) Función: hidroliza carbohidratos complejos para formar maltosa y glucosa Localización: Se produce en páncreas, hígado e intestino delgado. Se filtra y reabsorbe a través del riñón Valores normales: <50U/ml Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica, cáncer de páncreas. Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreáticos (gastritis, úlcera duodenal, peritonitis, obstrucción intestinal.

46 LIPASAS Función: hidroliza triglicéridos Localización: Se sintetiza en el páncreas y en la mucosa gástrica. Se elimina a través del riñón Causas del incremento de lipasa: Pancreatitis Gastrointestinales Renales

47 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA FOSFATASA ÁCIDA

48 DISTRIBUCIÓN TISULAR DE LA LACTATO DESHIDROGENASA

49 Las enzimas son indispensables en DIAGNÓSTICO CLÍNICO porque la alteración de la actividad enzimática puede estar asociada a un estado patológico