TOLERANCIA DE Oenococcus oeni RS1 A LAS CONDICIONES DE ESTRÉS DEL VINO

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1 Cienc. Tecnol. Aliment. Vol. 4, No. 4, pp 78-8, 4 Copyright 4 Asociación de Licenciados en Ciencia y Tecnología de los Alimentos de Galicia (ALTAGA). ISSN 35-8 TOLERANCIA DE Oenococcus oeni RS A LAS CONDICIONES DE ESTRÉS DEL VINO TOLERANCE OF Oenococcus oeni RS TO STRESS ENVIRONMENTAL CONDITIONS OF WINE TOLERANCIA DE Oenococcus oeni RS ÁS CONDICIÓNS DE ESTRÉS DO VIÑO Mesas, J. M. * ; Rodríguez, M. C. ; Alegre, M. T. 3 Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología (Área de Tecnología de Alimentos). Escuela Politécnica Superior. Universidad de Santiago de Compostela. 7 Lugo. España. Departamento de Fisiología Vegetal. Escuela Politécnica Superior. Universidad de Santiago de Compostela. 7 Lugo. España. 3 Departamento de Microbiología y Parasitología. Escuela Politécnica Superior. Universidad de Santiago de Compostela. 7 Lugo. España. *Autor para la correspondencia: jmesas@lugo.usc.es Recibido: 5 de Mayo de 4; aceptado: 8 de Septiembre de 4 Received: 5 May 4; accepted: 8 September 4 Abstract The tolerance of Oenococcus oeni RS to different stress conditions of the wine, its natural habitat, has been studied. The results obtained indicate that, in our assay conditions, the O. oeni RS strain exhibit high tolerance to the adverse environmental conditions given by the wine (temperature, high acidity, presence of SO, ethanol, aromas and metals). In the other hand, when the RS strain, who carries the plasmid prs, is compared with the RSC7 strain, who lacks it, the implication of the plasmid prs on the resistance mechanism to the stress conditions gave by antioxidant compounds as SO and geraniol can be concluded. 4 Altaga. All rights reserved. Keywords: Oenococcus oeni, plasmids, stress conditions. Resumen Se ha estudiado la tolerancia de Oenococcus oeni RS frente a distintos factores estresantes propios del vino, su hábitat natural. Los resultados obtenidos indican que, en nuestras condiciones de ensayo, la cepa O. oeni RS muestra altos niveles de tolerancia a las condiciones adversas propias del vino (temperatura, acidez elevada, presencia de SO, etanol, aromas y metales). Por otro lado, comparando la cepa RS, portadora del plásmido prs, con la cepa RSC7 carente del mismo, puede concluirse la implicación del plásmido prs en el mecanismo de resistencia a las condiciones de estrés provocadas por compuestos antioxidantes como el SO y el geraniol. 4 Altaga. Todos los derechos reservados. Palabras clave: Oenococcus oeni, plásmidos, condiciones de estrés. Resumo Estudiouse a tolerancia de Oenococcus oeni RS fronte ós factores estresantes do viño, o seu hábitat natural. Os resultados obtidos indican que, nas nosas condicións de ensaio, a cepa de O. oeni RS mostra altos niveis de tolerancia ás condicións adversas que lle proporciona o viño (temperatura, acidez elevada, presencia de SO, etanol, aromas e metais). Por outra banda, comparando a cepa RS, portadora do plásmido prs, coa cepa RSC7 carente deste plásmido, pode concluírse a implicación do plásmido prs no mecanismo de resistencia ás condicións de estrés provocadas por compostos antioxidantes coma o SO e o geraniol. 4 Altaga. Tódolos dereitos reservados. Palabras chave: Oenococcus oeni, plásmidos, condicións de estrés. 78

2 ALTAGA 4 INTRODUCCIÓN Mesas et al.: Tolerancia de Oenococcus oeni RS a las condiciones de estrés del vino. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Oenococcus oeni, denominada con anterioridad Leuconostoc oenos (Dicks et al., 995), es una bacteria láctica habitual en el vino (Van Vuuren and Dicks, 993) y es la principal responsable de la fermentación maloláctica, proceso mediante el cual los vinos sufren una desacidificación biológica que mejora sus propiedades organolépticas (Lafon-Lafourcade, 983; Davis et al., 985; Kunkee,99; Holt et al., 994; Lonvaud-Funel, 995; Versari, et al., 999). El interés comercial de esta bacteria como cultivo iniciador en procesos de vinificación ha potenciado su estudio en los últimos 5 años, centrándose las investigaciones en tres aspectos básicos, la secuenciación de su genoma (Klaenhammer et al., ; Mills, 4), la genética extracromosomal (Fremaux et al., 993; Brito et al., 996; Zúñiga et al., 996; Alegre et al., 999; Brito & Paveia, 999; Mesas et al., ; Mesas et al., 4) y el comportamiento de O. oeni bajo las condiciones de estrés que le proporciona el vino, su hábitat natural (Masqué et al., 99; Guzzo et al., 998; Vidal et al., ; Teixeira et al., ; G-Alegría et al., 4). El objetivo del presente trabajo ha consistido en el estudio de la tolerancia de O. oeni RS a los diversos agentes propios del vino que pueden resultar adversos para el normal desarrollo de esta bacteria y en el estudio de la posible implicación de elementos genéticos extracromosomales en los mecanismos de resistencia a esas condiciones adversas. MATERIAL Y MÉTODOS Bacterias y medios de cultivo Oenococcus oeni RS, cepa silvestre portadora del plásmido prs (Alegre et al., 999), fue aislada en nuestro laboratorio a partir de vinos de la Ribeira Sacra, Denominación de Origen (D.O.) situada en Galicia (España). O. oeni RSC7 es una cepa carente del plásmido prs (Mesas et al., 4) que fue obtenida por curación de la cepa O. oeni RS. El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de ambas cepas fue caldo MRS (Biolife) suplementado con jugo de tomate (3 ml/l). Este medio de cultivo, denominado MRST, es un medio complejo que permite un crecimiento relativamente rápido de O. oeni y permite analizar uno a uno los distintos factores estresantes propios del vino. La temperatura de incubación fue 7ºC, salvo indicación en contra. Ensayo de factores estresantes del crecimiento La inhibición del crecimiento de O. oeni por los distintos agentes estresantes se analizó midiendo biomasa (absorbancia a 6 nm) a distintos tiempos de incubación en un espectrofotómetro Ultrospec (Amersham- Pharmacia-Biotech). Todos los ensayos fueron realizados por cuadruplicado. Determinación de factores de estrés sobre el crecimiento de O. oeni RS Temperatura La Figura muestra el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de O. oeni RS en medio MRST. En ella se puede observar que la mayor velocidad de crecimiento se consigue a 3ºC. Oscilaciones de 5ºC por encima (37ºC) y por debajo (7ºC) conllevan ligera disminución en la velocidad de crecimiento, disminución que se hace mucho más patente si se baja la temperatura de incubación a ºC. Sin embargo, mientras que a ºC, 7ºC y 3ºC se alcanza el máximo de absorbancia posible en este medio y condiciones, a 37ºC se detiene el crecimiento en torno al 4º o 5º día, lo que sugiere que 37ºC es una temperatura subletal para el desarrollo de O. oeni RS. Estos resultados son congruentes con los obtenidos por G-Alegría et al. (4), quienes observaron una mayor velocidad de crecimiento a 3ºC que a 8ºC para distintas cepas de O. oeni, pero difieren de los resultados obtenidos por Dicks et al. (995) quienes dan como temperatura óptima de crecimiento para O. oeni ºC. Acidez La acidez de los mostos es debida básicamente a los dos ácidos mayoritarios de la uva, el ácido tartárico y el ácido málico, por lo que se estudió el efecto de estos ácidos sobre el crecimiento de O. oeni RS en medio MRST. Los resultados obtenidos (Figuras y 3) indican que la presencia de estos ácidos, especialmente el ácido tartárico, en el medio de cultivo a baja concentración (5 g/l) incrementan la producción de biomasa sin alterar la velocidad de crecimiento, lo que sugiere un aprovechamiento de estos sustratos como suplemento al consumo de los nutrientes propios del MRST. Concentraciones de g/l de cualquiera de estos dos ácidos reducen drásticamente el crecimiento y concentraciones de 5 g/l lo bloquean prácticamente por completo sobre todo en el caso del ácido tartárico. Dado que esta inhibición del crecimiento puede atribuirse al ph del medio, se analizaron los phs iniciales del medio de cultivo en función de la concentración de los ácidos añadidos obteniéndose los datos de la Tabla. Estos datos sugieren que rangos de ph entre 4,5 y 5,8 son óptimos para el crecimiento de esta cepa, mientras que phs de 4, ó inferiores ralentizan notoriamente la velocidad de crecimiento hasta hacerse prácticamente cero a valores de ph de 3,. Estos resultados concuerdan con los de Dicks et al. (995) quienes establecen un ph óptimo de Tabla.- ph inicial del medio de cultivo en función de la concentración del ácido añadido. Medio MRST MRST + Ácido DL-málico MRST + Ácido L(+)-tartárico Concentración (g/l) ph 5,8 4,7 4, 3,5 4,5 3,9 3, 79

3 Cienc. Tecnol. Aliment. Vol. 4, No 4, pp 78-8, 4 ISSN ALTAGA,5,5 Absorbancia (6nm),5 ºC 7ºC 3ºC 37ºC Absorbancia (6 nm),5 g/l 5 g/l g/l 5 g/l,5,5 Figura. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento de O. oeni RS. Figura. Efecto del ácido DL-málico sobre el crecimiento de O. oeni RS.,5,5 Absorbancia (6nm),5,5 g/l 5 g/l g/l 5 g/l Absorbancia (6 nm),5,5 %Vol 5%Vol %Vol Figura 3. Efecto del ácido L(+)-tartárico sobre el crecimiento de O. oeni RS. Figura 4. Efecto del alcohol etílico sobre el crecimiento de O. oeni RS.,8,6, Absorbancia (6 nm),4,,8,6 mg/l 5 mg/l 3 mg/l 6 mg/l Absorbancia (6 nm),8,6,4 mg/l 5 mg/l 3 mg/l 6 mg/l,4,, Figura 5. Efecto del SO a ph 5,8 sobre el crecimiento de O. oeni RS. Figura 6. Efecto del SO a ph 4, sobre el crecimiento de O. oeni RS. 8

4 ALTAGA 4 Mesas et al.: Tolerancia de Oenococcus oeni RS a las condiciones de estrés del vino. crecimiento para O. oeni de 4,8. Por otro lado, dada la posibilidad de desarrollo de O. oeni RS a ph 3,5 y acidez superior a g/l en forma de ácido málico o tartárico, se puede considerar a esta cepa como altamente resistente a las condiciones de acidez de los mostos y vinos de la Ribeira Sacra. Etanol La tolerancia de O. oeni RS al etanol (Figura 4) no es demasiado alta si se compara con otras cepas de O. oeni como las analizadas por G-Alegría et al. (4), procedentes de la D.O.C. Rioja. Sin embargo, nuestros datos se asemejan bastante a los obtenidos por Teixeira et al. () con cepas de O. oeni procedentes de vinos de la región Centro-Oeste de Portugal. Este nivel de resistencia, que puede ser considerado como medio-alto, también resulta acorde con los tipos de vinos de la Ribeira Sacra, cuyas graduaciones alcohólicas no son demasiado elevadas. Anhídrido sulfuroso El efecto del anhídrido sulfuroso (SO ) sobre O. oeni RS se analizó inicialmente en MRST a su ph original (5.8), observándose que concentraciones de SO habituales en vinificación (5 mg/l, 3 mg/l y 6 mg/l) no tienen efecto sobre el crecimiento de esta cepa (Figura 5). Sin embargo, empleando MRST suplementado con ácido DL-málico ( g/l), cuyo ph es 4,, se obtuvo un efecto sinérgico de ralentización del crecimiento (Figura 6) que es tanto más acusado cuanto mayor es la concentración de SO. No obstante, bajas concentraciones de SO (5 mg/l) parecen estimular ligeramente el crecimiento de O. oeni RS a bajo ph. Comparando estos resultados con los obtenidos en Borgoña por Guzzo et al. (998), se puede considerar a O. oeni RS como muy resistente al SO. Sustancias aromáticas Los mostos y vinos contienen gran cantidad de sustancias aromáticas procedentes de la uva con carácter potencialmente antiséptico en función de su concentración. En representación de estos aromas se eligieron dos relativamente abundantes en la uva, el geraniol y el linalol. La Figura 7 muestra el efecto de ambos compuestos sobre el crecimiento de O. oeni RS. Los resultados indican que ambos aromas impiden el crecimiento de esta cepa a concentraciones de 5 mm, sin embargo mientras que,5 mm de linalol apenas causa efecto inhibitorio del crecimiento, la misma concentración de geraniol reduce notoriamente el desarrollo de O. oeni RS. Metales Se analizó también el efecto de los cationes metálicos Cu +, Fe +, Fe 3+, Mg +, Mn + y Zn + (a menudo presentes en el vino como consecuencia del uso de pesticidas vitícolas o por el contacto de mostos y vinos con los equipos utilizados en el proceso de elaboración), sobre el crecimiento de O. oeni RS tras 7 días de incubación en presencia de concentraciones crecientes de tales cationes. Los resultados obtenidos (Tabla ) indican Absorbancia (6 nm),5,5,5 mm G.5 mm G 5 mm L.5 mm L 5 mm Figura 7. Efecto del geraniol (G) y del linalol (L) sobre el crecimiento de O. oeni RS. Tabla.- Tolerancia de O. oeni RS frente a cationes metálicos potencialmente presentes en el vino. Concentración Cu + Fe + Fe 3+ Mg + Mn + Zn + (mm) que el crecimiento de esta cepa no se ve afectado por la presencia de hierro, magnesio o manganeso hasta concentraciones de mm, sin embargo el cobre y el zinc inhiben el crecimiento a concentraciones de mm y 5 mm respectivamente. Estudios previos de inhibición de la fermentación maloláctica en O. oeni por Cu + (Vidal et al., ) señalan como inhibitorios del crecimiento de esta bacteria valores inferiores a 5 mg de Cu + /L. Nuestros resultados indican que O. oeni RS resiste concentraciones de Cu + un orden de magnitud superiores a las descritas por Vidal y sus colaboradores. Implicación del plásmido prs en la resistencia de su hospedador a condiciones de estrés Ensayos idénticos a los descritos para O. oeni RS en el apartado anterior fueron realizados en paralelo con la cepa O. oeni RSC7 obteniéndose resultados similares salvo en los siguientes dos casos. El anhidrido sulfuroso (Figura 8) y el geraniol (Figura 9) resultaron ser más nocivos para O. oeni RSC7 (carente de prs) que para la cepa parental O. oeni RS, portadora del plásmido, lo que sugiere una posible implicación del plásmido prs en la defensa de su hospedador frente a componentes antioxidantes como son el anhídrido sulfuroso y el geraniol. Guzzo et al. (998), encontraron una implicación de la síntesis de proteínas de estrés en la resistencia de O. oeni al SO. Nuestros resultados sugieren una posible relación entre prs y la síntesis de proteínas de estrés. 8

5 Cienc. Tecnol. Aliment. Vol. 4, No 4, pp 78-8, 4 ISSN ALTAGA Absorbancia (6 nm) Absorbancia (6 nm),7,6,5,4,3,,,8,7,6,5,4,3,, CONCLUSIONES O. oeni RS, cepa aislada de vinos de la D.O. Ribeira Sacra muestra alta tolerancia a las condiciones de estrés propias de su hábitat natural, los vinos de esta D.O. Por otro lado, su elemento extracromosomal, el plásmido prs parece estar implicado en la resistencia a las condiciones de estrés provocadas por los agentes antioxidantes SO y geraniol. Agradecimientos El presente trabajo ha sido financiado por la Xunta de Galicia mediante la concesión del proyecto (PGIDITO9PR). Los autores agradecen la asistencia técnica de Lara Expósito Enes. BIBLIOGRAFÍA RS RSC7 Figura 9. Efecto del geraniol (,5mM) sobre el crecimiento de O. oeni RS y O. oeni RSC7. Alegre, M. T., Rodríguez, M. C., and Mesas, J. M. (999). Nucleotide sequence analysis of prs, a cryptic plasmid from Oenococcus oeni. Plasmid 4, Brito, L., Vieira, G., Santos, M. A., and Paveia, H. (996). Nucleotide sequence analysis of pog3, a cryptic plasmid from Leuconostoc oenos. Plasmid 36, RS RSC7 Figura 8. Efecto del SO (6mg/mL) a ph 4, sobre el crecimiento de O. oeni RS y O. oeni RSC7. 8 Brito, L., and Paveia, H. (999). Presence and analysis of large plasmids in Oenococcus oeni. Plasmid 4, Davis, C. R., Wibowo, D., Eschenbruch, R., Lee, T. H., and Fleet, G. H. (985). Practical implications of malolactic fermentation: A review. American Journal Enology Viticulture 36, 9-3. Dicks, L. M. T., Dellaglio, F., and Collins, M. D. (995). Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 45, Fremaux, C., Aigle, M., and Lonvaud-Funel, A. (993). Sequence analysis of Leuconostoc oenos DNA: Organization of plo3, a cryptic plasmid. Plasmid 3, -3. G-Alegría, E., López, I., Ruiz, J.I., Sáenz, J., Fernández, E., Zarazaga, M., Dizy, M., Torres, C. and Ruiz-Larrea, F. (4). High tolerance of wild Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni strains to lyophilisation and stress environmental conditions of acid ph and ethanol. FEMS Microbiology Letters. 3, Guzzo, J., Jobin, M-Ph. and Diviès, C. (998). Increase of sulfite tolerance in Oenococcus oeni by means of acidic adaptation. FEMS Microbiology Letters 6, Holt, J., Krieg, N., Sneath, P., Staley, J. and Williams, S. (eds) (994). Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore, MD. Editorial Williams & Wilkins. Klaenhammer, T. et al. (). Discovering lactic acid bacteria by genomics. Antonie Van Leeuvenhoek 8, Kunkee, R. E. (99). Some roles of malic acid in the malolactic fermentation in wine making. FEMS Microbiology Reviews 88, Lafon-Lafourcade, S. (983). Wine and Brandy. En: G. Reed., (ed.), Biotechnology. Heidelberg. Editorial VCH. pp Lonvaud-Funel, A. (995). Microbiology of the malolactic fermentation: Molecular aspects. FEMS Microbiology Letters 6, 9-4. Masqué, M. C., Guardiola, S. y Bordons, A. (99). Control de la fermentación maloláctica mediante cepas de bacterias aisladas del vino. VitiVinicultura -, Mesas, J. M., Rodríguez, M. C., and Alegre, M. T. (). Nucleotide sequence analysis of prs and prs3, two small cryptic plasmids from Oenococcus oeni. Plasmid 46, Mesas, J. M., Rodríguez, M. C. and Alegre, M. T. (4). Plasmid curing of Oenococcus oeni. Plasmid 5, Mills, D. A. (4). The lactic acid bacteria genome project. Food Science 69, 8-3. Teixeira, H., Gonçalves, M. G., Rocès, N., Ramos, A. and San Româo, M. V. (). Lactobacillic acid accumulation in the plasma membrane of Oenococcus oeni: a response to ethanol stress. Microbial Ecology 43, Van Vuuren, H.J.J., and Dicks, L.M.T. (993). Leuconostoc oenos: A review. American Journal of Enology and Viticulture 44, 99-. Versari, A., Parpinello, G. P., and Cattaneo, M. (999). Leuconostoc oenos and malolactic fermentation in wine: A review. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 3, Vidal, M. T., Poblet, M., Constantí, M. and Bordons, A. (). Inhibitory effect of copper and dichlofluanid on Oenococcus oeni and malolactic fermentation. American Journal Enology and Viticulture 5, 3-9. Zúñiga, M., Pardo, I., and Ferrer, S. (996). Nucleotide sequence of plasmid p48, a cryptic plasmid from Leuconostoc oenos. Plasmid 35,