Determinación de coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I: Comparación con los medios de cultivo tradicionales

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1 INGENIERÍA HIDRÁULICA Y AMBIENTAL, VOL. XXIV, No. 3, 23 Determinación de coliformes totales y en aguas utilizando el (MERCK) I: Comparación con los medios de cultivo tradicionales INTRODUCCIÓN En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas basadas en la utilización de sustratos cromogénicos y fluorogénicos que detectan actividades enzimáticas muy específicas. Con la utilización de estos medios de cultivo se eleva la sensibilidad y la rapidez de detección de los microorganismos en aguas. La detección y cuantificación de coliformes totales y como microorganismos indicadores de contaminación fecal tiene gran importancia en el control microbiológico de la calidad sanitaria de las aguas. El análisis bacteriológico de las aguas es llevado a cabo por tres métodos diferentes, estos son: filtración a través de membranas, el test de presencia-ausencia y el método de los números más probables o tubos múltiples de fermentación, todos se basan en la capacidad que tienen los organismos coliformes de producir ácido y gas a partir de la lactosa. 2 Durante las últimas décadas se han venido desarrollando nuevos medios de cultivo para la detección directa de coliformes totales y. Estos medios contienen sustratos que son utilizados por enzimas específicas del grupo coliformes y respectivamente. Los sustratos se unen a algún compuesto que al ocurrir la reacción enzimática se libere al medio, produciendo un cambio de color o el desarrollo de fluorescencia. Por esta razón se conocen como compuestos cromogénicos y fluorógenicos. Estos métodos son altamente específicos y sensibles, además brindan la posibilidad de ofrecer los resultados en solo 24 h. Este trabajo tiene como objetivo establecer una comparación de la técnica de tubos múltiples de fermentación utilizando los medios establecidos Resumen / Abstract El presente trabajo tiene como objetivo comparar los medios de cultivo tradicionales para la detección de organismos indicadores de contaminación en aguas (Caldo Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y EC) y el nuevo medio de cultivo (Merck), el cual detecta simultáneamente coliformes totales y. El análisis estadístico de los valores obtenidos de coliformes totales demuestran que sí existen diferencias estadísticamente significativas entre los medios de cultivo. Los resultados obtenidos cuando se emplea el nuevo medio son superiores a los obtenidos cuando se emplean los medios de cultivos convencionales (CL-CBVB). Para el caso de la determinación de, no existen diferencias estadísticamente significativas, aunque los resultados obtenidos son ligeramente superiores cuando se emplea el Caldo. Palabras clave:, fluorogénicos y cromogénicos, detección rápida. The objective of the present work is to compare the traditional culture mediums for the detection of organisms indicators of contamination (Lactose Broth, Brilliant Green Bile Broth, and EC Broth) and the new medium (Merck) which detect at the same time total coliforms and. The statistical analysis of the obtained results of total coliforms shows that is differences statistically significative among the mediums. The results obtained when is used are superior than those obtained when the conventional mediums (LB-BGBB) are used. In the case of the detection of, there are not differences statistically significative, even though the obtained results are lightly superior when the is used. Key words:, fluorogenic, Cromogenic, rapid detection. Annarella Rodríguez Isaac, Licenciada en Microbiología, Aspirante a Investigador, OEE Andrés González Lines maydelin@isocomer.com.cu María del Carmen Novoa Deaño, Licenciada en Bioquímica, Investigadora Agregada, Oficina de Regulación Ambiental y Seguridad maricarmen@cnsn.cu María Antonieta Mieres Villa, Licenciada en Microbiología, Centro de Hidrología y Calidad del Agua, CENHICA, Ciudad de La Habana cenhica@ceniai.inf.cu Coautores: Rolando Herrera Maspoch, Licenciado en Microbiología, CENHICA, Yamilka González de Armas, Licenciada en Bioquímica, Investigadora Agregada, CENHICA

2 Determinación de coliformes totales y en aguas utilizando el (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales tradicionalmente (Caldo Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y Caldo EC) y el nuevo medio de cultivo Caldo, tanto en aguas subterráneas, como superficiales. MATERIALES Y MÉTODOS Para comparar la Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación con la sustitución de los medios de cultivo tradicionales () por el medio de cultivo Caldo en aguas subterráneas y superficiales se tomaron muestras de las siguientes fuentes. Agua subterránea: Pozo de Abasto del Centro de Hidrología y Calidad del Agua. Agua superficial: Laguna Artificial del Zoológico Nacional. Se colectaron y analizaron un total de 4 muestras de aguas, 2 de agua subterránea y 2 de agua superficial. Las mismas fueron colectadas siguiendo la metodología para el muestro de aguas descrita en los Métodos Estándares para el Análisis de Aguas y Aguas Residuales, se utilizaron frascos de cristal con tapa esmerilada de 25 ml esterilizados en autoclave por 3 min a 2 o C. La siembra se efectuó 3 min después del muestro. METODOLOGÍA PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Aguas subterráneas Se sembraron volúmenes de, y,, ml de muestra. Aguas superficiales Se realizaron diluciones de la muestra ( -, -2 y -3 ), de la cuales se sembró ml de cada una. Cada una de las muestras fue sembrada paralelamente mediante la Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación empleando los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVB- EC) y con la sustitución de estos por el medio de cultivo Caldo. Se siguió el procedimiento establecido para la técnica de tubos múltiple de fermentación. Medios de cultivo empleados 3 Caldo Lactosado (MERCK). Caldo Bilis Verde Brillante (MERCK). Caldo EC (MERCK). Caldo (MERCK). Expresión de los resultados La densidad de coliformes se expresa como el Número Más Probable de coliformes (NMP) en ml de aguas. Aguas subterráneas El NMP se busca en tablas estadísticas de acuerdo con un código formado por la combinación de los tubos positivos y negativos obtenidos. Aguas superficiales A partir del código obtenido en las tablas estadísticas se calcula el NMP de coliformes por cada ml de muestra empleando la siguiente fórmula: NMP = CÓDIGO DI donde: DI: Dilución inicial en la que todos los tubos resultaron positivos. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó en el Departamento de Estadística del Instituto de Cibernética, Matemática y Física (ICIMAF) del CITMA. Se empleó una transformación de los datos en sus correspondientes logaritmos para que se cumpliera una distribución normal. Se determinó la media geométrica, aritmética, la desviación estándar y la t de student para muestras apareadas dependientes de dos colas. Para ello se utilizaron los paquetes de programas STATISTICA (Versión 5.) y Microsoft Excel (997). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Como puede observarse en la tabla los coliformes totales presentaron una media geométrica mucho mayor cuando se utiliza el Caldo que cuando se emplean los medios tradicionales, lo cual indica la superioridad de este medio en el recobrado de estas bacterias con respecto a los medios tradicionales. En el caso de no se observan grandes diferencias en las medias geométricas obtenidas por ambos métodos. En la tabla 2, los resultados obtenidos en el análisis de coliformes totales y en las aguas superficiales de la laguna artificial del Zoológico Nacional mantienen el mismo comportamiento que para el análisis de aguas subterráneas, existe un mayor recobrado de bacterias con el Caldo. La media geométrica del NMP de coliformes, cuando se emplea este medio, es mucho mayor que la obtenida cuando se emplean en el análisis los medios de cultivo tradicionales (). No obstante, en el caso de la diferencia que se observa en las medias geométricas no es tan grande como la obtenida para coliformes totales. Estos resultados se deben a que la detección y cuantificación de los coliformes mediante los medios tradicionales se realiza de manera indirecta, a través de un subproducto de la reacción de fermentación de la Lactosa, el gas, y según Ciebin y colaboradores 4 los métodos tradicionales basados en la capacidad de fermentar la lactosa con producción de gas como factor diferencial, proporcionan resultados falsos, negativos, ya que el % de las cepas de aisladas por ellos no son capaces de producir ácido ni gas a partir de la lactosa. 6

3 A. Rodríguez, M. del C. Novoa, M. A. Mieres, Tabla Resultados del análisis de coliformes totales y, en aguas subterráneas, Aguas subterráneas Aguas subrterráneas Tabla 2 Resultados del análisis de coliformes totales y, en aguas superficiales Aguas superficiales Muestras Muestras CL-CBVB CL-EC CL-CBVB CL-EC geométrica 27,73 82,48 2,58 2,97 geométrica 3 34,9 9 64,2 79, , 7

4 Determinación de coliformes totales y en aguas utilizando el (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales Sin embargo, el uso de la temperatura como factor diferencial para el caso de parece ser un factor determinante, pues las diferencias entre las medias de los NMP por los medios tradicionales y el no es tan marcada como en el caso de los coliformes totales. Eckner 5 en un estudio realizado en Suecia obtuvo resultados similares empleando los métodos tradicionales y el sistema Colilert. Este sistema al igual que el está diseñado para la detección simultánea de coliformes y en aguas mediante sustratos cromogénicos y fluorogénicos, solamente difiere de este último en el compuesto fluorogénico o cromogénico que se une al sustrato de las enzimas. Grant, en 997, obtuvo resultados similares empleando el medio de cultivo m-coliblue24. Este medio detecta y cuantifica simultáneamente coliformes totales y. Este autor encontró que ese medio era superior a otros, en términos de especificidad, sensibilidad y errores de falsos positivos. Resultados similares a los de Grant fueron obtenidos en este estudio. Las figuras, 2, 3 y 4 ilustran, de forma gráfica, los resultados una vez transformados los valores obtenidos en sus correspondientes logaritmos. Como bien se puede apreciar, los resultados obtenidos al emplear el nuevo medio de cultivo son muy superiores para el caso de los coliformes totales. Para el caso de son iguales o ligeramente superiores. Estos resultados son razonables ya que la detección y cuantificación de los coliformes totales se realiza de manera indirecta a través de un subproducto de la reacción de fermentación como es la producción de gas; y como ya se ha planteado, existen cepas que no son capaces de producir gas. Por el contrario, la detección de se realiza utilizando un factor mucho más selectivo como es la temperatura. Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los obtenidos por Grant (997) al comparar el m-coliblue24 con los medios de cultivo tradicionales; y con los que obtuvieron Brenner y colaboradores (996) al comparar el Agar MI con el m-endo Agar. Estos investigadores concluyeron que los nuevos medios de cultivo brindan recobrados significativamente superiores, tanto de organismos coliformes como. La tabla 3 muestra los resultados obtenidos en el análisis de t-student dependiente de dos colas, para muestras pareadas. De esta forma se comparan los resultados obtenidos, tanto para coliformes totales como para cuando se emplean los medios de cultivo tradicionales () y el Caldo para aguas subterráneas. En la tabla 4, se dan los resultados del análisis estadístico de coliformes totales y E. coli para muestras apareadas en aguas superficiales. FLUOROCULT 3 2 FLUOROCULT Número de muestras FIG. Resultados del análisis de en aguas subterráneas Número de muestras. FIG. 2 Resultados del análisis de coliformes totales en aguas subterráneas. 8

5 A. Rodríguez, M. del C. Novoa, M. A. Mieres, FLUOROCULT Número de muestras. FIG. 3 Resultados del análisis de coliformes totales en aguas superficiales. 5 FLUOROCULT Número de muestras. FIG. 4 Resultados del análisis de E. coli en aguas superficiales. Tabla 3 Resultados del análisis estadístico de coliformes totales y, para muestras apareadas, en aguas subterráneas Estadígrafo (CL-CBVB)/ (CL-EC)/ t-student (tabla) 2,9 2,9 t-student (calculada) -4,97 * * El análisis estadístico no se justifica porque en la mayoría de los casos los resultados obtenidos por ambos métodos dan negativos. Tabla 4 Resulados del análisis estadístico de coliformes totales y E. Coli, para muestras apareadas, en aguas superficiales Estadígrafo (CL-CBVB)/ (CL-EC)/ t-student (tabla) 2,9 2,9 t-student (calculada) -,4-2,4 9

6 Determinación de coliformes totales y en aguas utilizando el (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales Los resultados demuestran que en el análisis de coliformes totales existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos métodos. Esta mayor sensibilidad del Caldo radica en que el principio de detección y cuantificación se basa directamente en una reacción enzimática, la cual es altamente específica. Por lo tanto, la reacción solamente se llevará a cabo si está presente la enzima (bacterias coliformes) y así se liberará al medio el compuesto cromogénico y/o fluorogénico. En el caso de la determinación de no existen diferencias estadísticamente significativas, ni en el agua superficial ni en la subterránea. La tabla 5 muestra los resultados obtenidos al sembrar réplicas de una misma muestra de agua en el Caldo. Si se analizan los valores de desviación estándar y coeficiente de variación obtenidos tanto para Tabla 5 Resultados del análisis de reproducibilidad para el nuevo medio de cultivo Caldo en la detección y cuantificación de coliformes totales y en aguas superficiales Muestras (NMP/ Ml) geométrica coliformes totales como para, se aprecia que su dispersión es pequeña (valor del coeficiente de variación); si tenemos en cuenta que se trata de agua superficial la cual por su naturaleza presenta altos valores de organismos coliformes y una alta dispersión en los resultados, por lo que se puede concluir que la técnica es altamente reproducible cuando se emplea este nuevo medio de cultivo. CONCLUSIONES. El análisis estadístico de los valores obtenidos en la detección y cuantificación de coliformes totales muestra que existen diferencias estadísticamente significativas entre los medios de cultivo tradicionales y el. El recobrado de coliformes totales y es superior cuando se emplea el tanto en aguas subterráneas como en aguas superficiales. 2. Para la detección y cuantificación de, no existen diferencias estadísticamente significativas; aunque los resultados obtenidos son ligeramente superiores cuando se emplea el. 3. El medio muestra mayor sensibilidad, rapidez y reproducibilidad en la detección y cuantificación de coliforme totales y que los medios de cultivo tradicionales. REFERENCIAS. APHA: Standard Methods For The Examination Of Water And Wastewater, 2 Edition, Washington DC, MANAFI, M.: "Rapid Detection Of Total Coliforms And In Water Using Broth", Microbiol. 55, 32, MERCK: Manual de medios de cultivo, RFA, CIEBIN, B.W. Y OTROS: "Comparative Evaluation Of Modified M-Fc And M-Tec For Filter Enumeration Of Escherichia coli" in Water. J. Appl. Env. Microbiol, 6:, ECKNER, K.F.: "Comparison Of Membrane Filtration And Multiple Tube Fermentation By Colilert And Enterolert Methods For detection Of Waterborne Coliform Bacteria, Escherichia coli And Enterococci Use Drinking And Bathing Water Quality Monitoring" In Southern Sweden. Appl. Env. Microbiol. 64, 998. aritmética DS C. Variación Recibido: junio del 23 Aprobado: julio del 23 2