Genética molecular (IV)
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- Ana Isabel Cortés del Río
- hace 8 años
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1 Genética molecular (IV)
2 Sistemas de reparación del DNA Durante la replicación Corrección de pruebas de la DNA-polimerasa Durante el resto del ciclo celular Reparación con escisión Sistema SOS Reparación sin escisión o directa
3 REPARACIÓN CON ESCISIÓN 1-una endonucleasa detecta el error y corta a ambos lados la hebra; 2-una exonucleasa, elimina el segmento delimitado; 3-una ADN-polimerasa, sintetiza el fragmento correctamente 4-una ADN-ligasa lo empalma con los extremos Mutaciones en los genes que codifican a las enzimas reparadoras de estos mecanismos originan enfermedades humanas como la Xeroderma Pigmentosum Vídeo xerordema pigmentosum
4 REPARACIÓN DIRECTA (FOTOENZIMÁTICA) Es aquella en la que se revierte la lesión, por ejemplo, la reparación de dímeros de timina (dos timinas adyacentes en una misma hebra de DNA unidas covalentemente por un anillo ciclobutano) producidos por la luz ultravioleta, mediante la enzima fotoliasa: 1-la fotoliasa reconoce la lesión y se une a ella. 2-la luz visible de nm (azul) activa dicha enzima 3-la enzima activada cataliza la rotura del anillo ciclobutano y a continuación se libera. Animación Otra animación
5 SISTEMA SOS Cuando se acumula un gran número de mutaciones que dañan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación anteriores no sean suficientes para reparar todos los daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo de emergencia que tiende a salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con frecuencia elevada. Las enzimas correctoras SOS incorporan al azar un nucleótido en el punto en que la replicación se detiene debido a una lesión. El resultado es que la célula se divide pero incorporando gran número de mutaciones
6 MUTACIONES Y CÁNCER Agentes cancerígenos: físicos, químicos, biológicos Mutaciones en genes específicos del ADN de las células Reparación o muerte celular Información: apoptosis METÁSTASIS Migración a otros tejidos, a través de la sangre o la linfa, donde crecen y reemplazan al tejido normal No hay reparación Células alteradas Proliferación rápida e incontrolada TUMOR Formación de una masa celular Distintas proteínas de membrana Cambios en la estructura del citosqueleto...
7 Autosuficiencia en el crecimiento Evasión de la Apoptosis Resistencia a estímulos antiproliferativos Las capacidades que adquieren las células para el desarrollo de la enfermedad (Hanahan y Weinberg, 2000) Cada uno de estos cambios en la fisiología celular, adquiridos durante el desarrollo de los tumores, representa una ventaja en la lucha contra los complejos sistemas de defensa con que cuentan las células para mantener estable la armonía funcional de los tejidos. Angiogénesis sostenida Invasión y Metástasis Inmortalidad Vídeo de Angiogénesis Vídeo de Metástasis Información
8 Genes reguladores del ciclo celular PROTOONCOGENES GENES SUPRESORES DE TUMORES Activan los procesos de crecimiento y proliferación celular Inhiben los procesos de crecimiento y proliferación celular Activación permanente por mutación ONCOGENES Ganancia de función (efecto dominante) Inactivación por mutación Transformación de una célula normal en maligna Pérdida de función (efecto recesivo) Para que un cáncer pueda progresar y desarrollarse, deben producirse al menos media docena de mutaciones que afecten a varios genes reguladores. Sin embargo, otros tipos de genes también pueden participar en la malignidad, facilitando la capacidad invasiva del tumor (por ejemplo, mutaciones en las proteínas del citoesqueleto que favorecen la motilidad celular). genes supr. tumores oncogenes
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10 RELACIÓN DE LAS MUTACIONES CON LA EVOLUCIÓN: La mutación genera los cambios sobre los que puede operar la Selección ADAPTACIÓN VARIABILIDAD GENÉTICA Diferencias anatómicas / funcionales entre los individuos de la población. Las diferencias pueden ser beneficiosas, aumentando la tasa de supervivencia de los individuos que las poseen, que dejan mas descendientes, o perjudiciales. SELECCIÓN NATURAL Las diferencias ventajosas tienden a permanecer en la población y las perjudiciales tienden a desaparecer. Generan MUTACIONES Son aleatorias, no se producen como respuesta a una necesidad EVOLUCIÓN La población va cambiando conforme cambian las condiciones ambientales.
11 CHARLES DARWIN Y LA SELECCIÓN NATURAL (I) A lo largo de cinco años entre 1831 y 1836 viajando a bordo del Beagle, Charles Darwin, recogió datos botánicos, zoológicos y geológicos que le permitirían formular, durante los siguientes veinte años, una explicación coherente sobre la diversidad de la vida. En 1858, Darwin se vio obligado a presentar sus trabajos, cuando recibió el manuscrito de un joven naturalista, A. R. Wallace, que había llegado de manera independiente a sus mismas conclusiones, es decir, a la idea de la evolución por medio de la selección natural.
12 CHARLES DARWIN Y LA SELECCIÓN NATURAL (II) Darwin publicó su obra Sobre el origen de las especies por medio de la selección natural en 1859, en la que introduce los conceptos de variabilidad de la descendencia y selección natural. En ella Darwin postuló que: -Los individuos de una misma especie no son iguales entre sí, sino que presentan variaciones que se pueden transmitir a la descendencia. Estas variaciones hacen que cada uno tenga distintas capacidades para adaptarse al medio natural, reproducirse exitosamente y transmitir sus rasgos a su descendencia. -El crecimiento de las poblaciones es exponencial y los recursos son limitados. En la competencia por la supervivencia tiene lugar una selección natural que favorecerá a los individuos mejor adaptados, que tendrán así mas oportunidades de reproducirse y transmitir sus caracteres a la siguiente generación, mientras que los peor adaptados serán eliminados.
13 CHARLES DARWIN Y LA SELECCIÓN NATURAL (III) -Con el tiempo, los rasgos de los individuos que mejor se adaptan a las condiciones naturales se vuelven más comunes y la población evoluciona. La acumulación gradual de caracteres ventajosos para distintos ambientes daría lugar, con el tiempo, a la aparición de nuevas especies. Las enormes orejas del fenec son una adaptación al medio desértico, que ayudan a irradiar el exceso de calor hacia el exterior Las pequeñas orejas del zorro ártico son una adaptación al frío pues así su cuerpo pierde menos calor por irradaiación. Darwin murió sin conocer las causas de la variabilidad en las poblaciones, ya que los resultados de los experimentos de Mendel son posteriores (1866) y apenas tuvieron difusión hasta 1900.
14 Biston betularia, la mariposa del abedul, es una mariposa nocturna, de la que existen dos variedades: una gris claro y moteada y otra melánica, gris oscura, resultante de una mutación. En Inglaterra, a mediados del siglo XIX, la forma clara era la predominante, pero la contaminación provocada por la revolución industrial mató los líquenes de los troncos de los bosques y los ennegreció. La consecuencia fue un progresivo aumento de la variedad melánica, que remplazó casi completamente a la variedadad clara en las zonas industrializadas. El aumento se debía a que las formas claras destacaban durante el día sobre el tronco negruzco de los árboles, siendo presa fácil de los pájaros que se alimentaban de ellas, mientras que las formas oscuras quedaban ahora camufladas. La selección natural, que en esta caso actúa mediante la contaminación y la depredación,eliminó en mayor medida las formas claras y aumentó la frecuencia de las oscuras, que tienen mayor probabilidad de supervivencia y, por lo tanto, de reproducción. Hoy día, gracias a las medidas anticontaminantes, el proceso se ha invertido y está aumentando la frecuencia de las formas claras. Este fenómeno, que se ha observado en otras mariposas similares, tanto americanas como europeas, se denomina melanismo industrial. MELANISMO INDUSTRIAL: UN EJEMPLO DE EVOLUCIÓN POR SELECCIÓN NATURAL
15 BIOTECNOLOGÍA La biotecnología es la utilización de seres vivos, o partes de ellos, para obtener produtos de interés para las personas, sean de tipo alimentario, terapeútico, para mejora del medio ambiente, etc.
16 ORÍGENES DE LA BIOTECNOLOGÍA Desde los comienzos de la agricultura y de la ganadería (hace unos años), los seres humanos realizaron múltiples cruzamientos entre variedades distintas de una misma planta o entre razas diferentes de una especie animal, con el fin de obtener más y mejores cosechas y razas animales más eficientes para el fin al que fueran destinadas. Estas técnicas de selección artificial produjeron las especies actuales de ganado y cultivos, muy diferentes a las especies silvestres originarias y en las que se mezclaron ADNs de distintas variedades. Si quieres conocer la evolución del maíz haz clik aquí
17 INGENIERÍA GENÉTICA En la actualidad, gracias a los avances de la genética, disponemos de un conjunto de técnicas que permiten la manipulación de los genomas de los seres vivos con distintos propósitos. Esta tecnología y la manipulación genética a ella debida se denominan ingeniería genética. Entre sus logros se pueden citar la mejora de plantas y animales con fines alimentarios, la obtención de proteínas de interés terapéutico, de vacunas o la obtención de múltiples copias de un fragmento de ADN (clonación de ADN), también con distintos fines como el estudio de la actividad de un gen, la detección de enfermedades infecciosas o la identificación de individuos (huella genética) con fines policiales o jurídicos.
18 INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN REQUERIMIENTOS ENZIMAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN VECTORES LIGASAS Unen covalentemente fragmentos de ADN del mismo o distinto origen Cortan ADN por sitios precisos POLIMERASAS Sintetizan ácidos nucleicos complementarios a un molde De ADN ADN y ARN polimerasas De ARN Transcriptasa inversa PLÁSMIDOS Y FAGOS Para introducir genes en bacterias Transportan fragmentos de ADN exógenos a una célula donde se multiplican o expresan Plásmidos ( de Levadura y plásmido Ti) Virus eucariotas Cromosomas artificiales de levadura Para introducir genes en células eucariotas
19 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN Son tijeras moleculares, de una gran precisión y especificidad que reconocen dianas específicas en el ADN y cortan cada vez que las encuentran. A diferencia de otras nucleasas, no degradan el ADN sino que solo lo cortan produciendo fragmentos cuyo número dependerá de las veces que exista la diana en el ADN. Existen distintos tipos de enzimas de restricción, obtenidas de diferentes microorganismos y con distintas secuencias diana. Las más utilizadas tienen secuencias diana palindrómicas y pueden producir 2 tipos de cortes: -en bases no enfrentadas, generando fragmentos con extremos monocatenarios o cohesivos, capaces de aparearse con otros fragmentos de ADN con extremos complementarios, generados por la misma enzima -en bases enfrentadas de la secuencia diana generando fragmentos con extremos romos. Animación
20 VECTORES Son moléculas de DNA utilizadas para introducir en una célula huésped un fragmento de DNA foráneo y, una vez en su interior, posibilitar su replicación (vectores de clonación) e incluso su expresión (vectores de expresión). Vector de Los vectores deben reunir las siguientes clonación características: Un origen de replicación Tamaño global pequeño para facilitar su entrada en la célula hospedadora y garantizar su estabilidad dentro de la misma. Varias dianas para diferentes endonucleasas de restricción en regiones no esenciales que permitan intercalar el DNA exógeno Genes de resistencia a antibióticos para seleccionar las células hospedadoras que lo contienen. Si se trata de un vector de expresión deberá tener las secuencias necesarias para la transcripción (promotor y terminador) y la traducción. Vector de expresión
21 POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN Mutaciones distintas en los distintos individuos de la población (variabilidad) Cambios en las secuencias diana de diferentes enzimas de restricción Diferencias en el tamaño y número de los fragmentos producidos por las enzima de restricción (RFLP= polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción) Los fragmentos se separan en función de su tamaño cuando se colocan en un gel al que se aplica una corriente eléctrica, provocando la migración de los fragmentos hacia el cátodo (por la presencia de grupos fosfato), tanto mas rapidamente cuanto menor es su longitud ( Electroforesis en gel) Video Animación Para cada individuo se obtienen distintas bandas, que vienen a ser como su código de barras genético. El análisis de los RFLP permite, no solo obtener la huella genética, sino también el diagnóstico (incluso prenatal) de determinadas enfermedades congénitas.
22 CLONACIÓN= OBTENCIÓN DE COPIAS IDÉNTICAS Del genoma de un ser vivo De un gen o un fragmento de ADN In vivo Dentro de una célula hospedadora De células Introduciendo todo el genoma en una célula reproductora (óvulo) previamente enucleada (transferencia nuclear) In vitro Mediante la PCR Se induce el desarrollo embrionario Implantación en el útero de una madre portadora donde se completará el desarrollo embrionario Clonación terapeútica Se aísla una célula y se permite su reproducción para generar muchas células idénticas (un clon de células) Utilización del blastocisto para obtener células madre de las que se pueden obtener distintos tejidos Clonación reproductiva
23 CLONACIÓN DE ADN IN VIVO (MULTIPLICACIÓN EN EL INTERIOR CELULAR) 1- Cortar el ADN y el plásmido vector (que contiene un gen marcador de resistencia a un antibiótico) con la misma enzima de restricción. 2- Unión del fragmento y el vector con ADN ligasa, generando moléculas híbridas (ADN recombinante). 3- Introducción del ADN recombinante en una célula hospedadora (bacteria) para su replicación. 4- Selección de las células que contienen el ADN recombinante por crecimiento en presencia de antibiótico. 5-Purificación del ADN que ha sido clonado Animación
24 CLONACIÓN REPRODUCTIVA
25 CLONACIÓN TERAPÉUTICA La obtención de un embrión genéticamente idéntico a un individuo puede tener una aplicación terapéutica, pues en ese embrión hay células madre de las que pueden obtenerse células diferenciadas de cualquier tejido. Estos tejidos podrían ser trasplantados a un paciente que los precisara sin producir rechazo, como ocurre con los trasplantes de tejidos de donantes distintos.
26 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA 1-aislamiento del gen humano cortándolo con la misma enzima de restricción con la que se abre el plásmido, generando extremos cohesivos 2-obtención del plásmido recombinante (DNA humano + DNA bacteriano) 3-introducción del plásmido recombinante en la bacteria 4-clonación y expresión del gen (obtención de grandes cantidades de proteína humana) Actualmente se obtienen por ingeniería genética: el factor VIII de coagulación, la hormona del crecimiento, la insulina, el interferón y algunas vacunas antivirales como las de la hepatitis A y B.
27 ORGANISMOS TRANSGÉNICOS Los organismos modificados genéticamente (abreviado OMG, OGM o GMO) son organismos cuyo material genético o genoma ha sido manipulado mediante técnicas de ingeniería genética con el fin de otorgarle alguna característica específica. Cuando dicha manipulación consiste en introducir en el genoma de un organismo genes pertenecientes a organismos de otras especies, el organismo genéticamente modificado se denomina organismo transgénico. El gen foráneo que porta el organismo transgénico se denomina transgen y al proceso de transferencia de estos genes se le denomina transgénesis Familia de ratones fluorescentes desarrollados por la compañía taiwanesa Level Biotech en Información El arroz dorado está modificado genéticamente (con dos genes del narciso y un gen bacteriano) para producir una gran cantidad de betacaroteno (precursor de la Vitamina A). Información aquí
28 OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS 1- Preparación del transgén para su entrada en la célula,uniéndolo a un vector, como el plásmido Ti de Agrobacterium (bacteria del suelo que, de forma natural, introduce el plásmido en las células de la planta) o bien utilizándolo como revestimiento de microesferas metálicas que se disparan sobre las células con pistolas génicas, técnica denominada biobalística. 2- Introducción del transgén en células en cultivo de la planta. 3- Selección de las células que contienen el transgén. 4- Multiplicación de las células seleccionadas para formar plantas transgénicas. Animación
29 OBTENCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOS
30 TERAPIA GÉNICA La terapia génica es el tratamiento de una enfermedad por medio de la manipulación genética, utilizando un gen, que se introduce en el individuo enfermo, como agente terapeútico. La introducción del gen foráneo se limita, actualmente, a las células somáticas de un determinado órgano o tejido. Esta terapia se realiza normalmente ex vivo, es decir, en células blanco que se extraen del cuerpo, se cultivan y se les introduce el gen terapeútico en el laboratorio y luego se reintroducen en el organismo del enfermo. Para introducir el gen terapeútico en las células diana suelen utilizarse vectores víricos. Las enfermedades con mayores posibilidades de poder ser tratadas por terapia génica son las producidas por un solo gen defectuoso como la fibrosis quística, la hemofilia A, la deficiencia de la enzima ADA (un tipo de inmunodeficiencia), la distrofia muscular de Duchenne, etc.
31 APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA (I) APLICACIONES EN MEDICINA Y EN LA INDUSTRIA FARMACEÚTICA Producción de proteínas para tratar o prevenir enfermedades (hormonas, factores de coagulación, interferón, vacunas...). Terapia génica. Diagnóstico de enfermedades de origen genético
32 APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA (II) APLICACIONES EN AGRICULTURA. Obtención de plantas transgénicas con distintos objetivos: Conseguir plantas resistentes a herbicidas, al ataque de insectos o a enfermedades víricas. Mejora del producto: aumento del valor nutritivo. Conseguir plantas fijadoras de nitrógeno atmosférico, lo que evitaría la utilización de elevadas cantidades de fertilizantes químicos. Maduración controlada de frutos y flores. Tolerancia a condiciones ambientales extremas de temperatura, salinidad... Biorremediación mediante plantas con genes bacterianos que les confieren la capacidad de descontaminar campos contaminados con material explosivo, eliminar la toxicidad por mercurio del suelo... El maíz Bt es un maíz transgénico que produce en sus flores una proteína de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis que es tóxica para las larvas de un parásito que se alimenta de este maíz. Así, cuando las larvas de estos insectos, comúnmente denominados "barrenadores del tallo", intentan alimentarse de la hoja o del tallo del maíz Bt, mueren.
33 APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA (III) APLICACIONES EN LA CRÍA DE ANIMALES (GANADERÍA, ACUICULTURA). Obtención de animales transgénicos con distintos objetivos: Mejoras en la producción. Los mejores resultados se han obtenido con peces, como el salmón, la carpa y la lubina, a los que se les ha añadido el gen de la hormona del crecimiento de otras especies, lo que produce un aumento de tamaño del pez en muy poco tiempo y el gen de la "proteína anticongelante" de peces árticos, que permite su cría en aguas muy frías. Conocimiento del papel de un gen determinado (su regulación y la función de la proteína) o estudio de enfermedades humanas de origen genético. Producción de proteínas de interés (humanas o de otro tipo). Obtención de órganos para xenotransplantes (por ej. de cerdos a los que se les eliminan los genes que codifican las proteínas responsables del rechazo), etc. Salmón transgénico junto a otro no transgénico de la misma edad
34 PROYECTO GENOMA HUMANO Genoma es el conjunto de todos los genes de un organismo, que en nuestra especie están distribuidos entre los 23 pares de cromosomas que tenemos en nuestras células. En 1991 se puso en marcha un ambicioso proyecto, el Proyecto Genoma Humano, concebido para localizar, secuenciar y estudiar la función de todos los genes de la especie humana. Guía del genoma humano La Organización del Genoma Humano (HUGO) fue la entidad destinada a la coordinación internacional, para evitar duplicaciones de esfuerzos, y para difundir el conocimiento En este Proyecto se involucraron centros de investigación de todo el mundo y debido a la amplia colaboración internacional y a los avances en la tecnología computacional, el borrador inicial del genoma fue terminado en el año En febrero de 2001 el Proyecto de Genoma Humano y Celera Genomics (empresa fundada por Craig Venter que competía con el consorcio público) publican, simultáneamente, su secuenciación del genoma humano en Nature y Science, respectivamente. Finalmente el genoma completo fue presentado en abril del 2003, dos años antes de lo esperado.
35 GENOMA HUMANO pares de bases genes aprox. que codifican entre y proteínas 2000 Genes aprox. responsables de enfermedades humanas
36 DNA codificante (10%) Genes y secuencias relacionadas (25%) DNA no codificante: Intrones... (90%) Genoma nuclear ( genes) Genom a human o DNA intergénico o extragénico (75%) Secuencias únicas o bajo nº copias (60%) -Telómeros Secuencias moderada -Centrómeros a altamente Transposones repetitivas -Retrovirus (40%) endógenos... 2 genes de rrna Genoma mitocondrial (37 genes) 22 genes de trna 13 genes de mrna
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