ESTRATEGIAS PARA REDUCIR EL DESGASTE MUSCULAR ASOCIADO A LA CAQUEXIA BASADAS EN FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

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1 CAPITULO II ESTRATEGIAS PARA REDUCIR EL DESGASTE MUSCULAR ASOCIADO A LA CAQUEXIA BASADAS EN FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN 129

2 130 Capítulo II

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL Gran parte de los esfuerzos que hoy en día se destinan al estudio de la caquexia están dirigidos a la búsqueda de estrategias que permitan mejorar la calidad de vida de los pacientes, así como también a contrarrestar los mecanismos que conducen al desarrollo de la pérdida de masa muscular. Teniendo esto en mente, los objetivos de este capítulo son: 1.- Intentar contrarrestar el desgaste muscular asociado al crecimiento tumoral en el modelo de hepatoma ascítico Yoshida AH-130, utilizando el SP030, un inhibidor de AP-1 y NF-κB. 2.- Determinar la implicación de los glucocorticoides in vivo en la regulación de AP-1 y NF-κB, en el modelo de hepatoma ascítico Yoshida AH-130, mediante el uso del RU , un antagonista del receptor de glucocorticoides. 3.- Intentar revertir el desgaste muscular asociado a la caquexia mediante la utilización de GW1929, un agonista de PPARγ, en el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis. Para el desarrollo de estos objetivos, utilizamos dos modelos tumorales: el hepatoma ascítico Yoshida AH-130 y el carcinoma pulmonar de Lewis. Los animales fueron mantenidos en las condiciones normales de estabulación y tratados con los distintos compuestos como se indica en la sección de materiales y métodos. Al término del periodo experimental los animales fueron anestesiados y sacrificados, procediendo a la extracción de los tejidos que fueron congelados y mantenidos a -80ºC hasta el momento en que se realizaron los análisis moleculares. 131

4 1. Efecto del tratamiento con el SP030, un inhibidor de NF-κB y AP-1, en la caquexia en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Con los resultados ya existentes y la posibilidad de usar este inhibidor (cedido por la empresa Signal Pharmaceuticals), decidimos probar su eficacia contrarrestando la caquexia en el modelo tumoral de rata Yoshida AH-130. Este modelo se caracteriza por su alta caquexia asociada a una anorexia marcada y altas concentraciones de TNF-α en circulación (Tessitore et al., 1993a; Llovera et al., 1995). El compuesto usado es un inhibidor doble que es capaz de bloquear la transactivación de AP-1 y NFκB en células inmunes, tanto in vitro (Gerlag et al., 2000; Phippard and Manning, 2003), como in vivo (Goldman et al., 1996; Morikawa et al., 1997; Huang et al., 2001). La dosis usada para este experimento fue de 1 mg por kg de peso y la duración del tratamiento fue de 6 días, iniciándose el día de la inoculación del tumor. Las ratas Wistar macho, mantenidas en las condiciones normales de estabulación (ver sección de materiales y métodos), fueron divididas en 2 grupos: controles y tumores. Ambos grupos fueron a su vez divididos en tratados y no tratados. La administración del compuesto disuelto en carboximetilcelulosa al 1% en agua bidestilada, previa disolución del compuesto en DMSO a una concentración final del 1%, fue realizada por vía subcutánea (s.c.). A los 7 días de crecimiento tumoral, los animales fueron anestesiados y sacrificados. Se procedió a la extracción de la sangre desde la arteria aorta y los tejidos fueron rápidamente extraídos, pesados y congelados en nitrógeno líquido. En la tabla 1 se muestran los pesos de los 4 grupos del estudio. Los resultados observados demuestran un efecto beneficioso del tratamiento con este compuesto en los animales portadores de tumor. El efecto se pudo observar de forma clara en índices como el incremento de peso, donde los animales portadores de tumor tratados con el compuesto, a pesar de tener un índice negativo, pierden un 16% menos peso que los animales portadores de tumor no tratados. El peso de la carcasa también se encontró aumentado en un 10% en los animales con tumor tratados con el inhibidor. Otro efecto que produce el tratamiento es que los animales tratados comen un 15% más que los animales no tratados en el grupo tumor, y un 4% más en los controles. Cuando analizamos los pesos de los músculos, observamos un incremento generalizado que fue de un 15% para el músculo tibialis, un 26% para el músculo EDL, un 17% para el músculo GSN y un 6% para el músculo soleus. La administración del compuesto en los animales portadores de tumor produjo una importante recuperación del peso del tejido adiposo: así, para el tejido adiposo blanco dorsal fue de un 26% y para el tejido adiposo marrón fue de un 47%. Cuando analizamos los pesos de los órganos, encontramos que el tratamiento produjo una recuperación de un 8% en el peso del hígado, mientras que el aumento de peso en el músculo cardiaco representado por el peso del corazón fue de un 15% en los animales portadores de tumor tratados. Los riñones también presentaron una marcada mejoría, con un 21% más de peso en los animales tratados del grupo tumor. Todos estos efectos no se presentaron asociados a cambios en el contenido de células tumorales (tabla 1). 132

5 Peso corporal e ingesta no tratado tratado Tumor no tratado Tumor tratado Peso corporal inicial (g) 134±3(12) 134±2(12) 138±3(12) 135±2(14) Peso corporal final sin tumor (g) Incremento peso corporal (g) 175±5(12) 172±3(12) 128±4(9)*** 129±4(9)*** 30±2(12) 29±2(12) -6±2(9)*** -5±2(9)*** Carcasa (g) 97±2(11) 94±1(12) 70±2(9)*** 77±3(14)*** Ingesta total media (g) 120±2(12) 125±1(12) 95±1(9)*** 109±5(14)* Bebida total media (ml) 251±19(12) 201±20(12) 260±22(9) 286±36(14) Pesos de los músculos Tibialis (mg) 212±4(11) 201±4(12) 152±5(10)*** 175±10(13)* EDL (mg) 49±1(10) 47±1(12) 34±2(10)*** 43±3(12) Gastrocnemius (mg) 685±18(11) 661±17(12) 500±23(10)*** 586±31(13)* Soleus (mg) 40±2(11) 42±2(12) 32±2(10)** 34±1(14)** Pesos de los tejidos adiposos TAB (mg) 821±56(11) 960±85(11) 408±61(8)*** 513±70(11)*** TAM (mg) 224±27(11) 240±23(12) 113±13(8)** 166±25(11)* Pesos de los órganos Hígado (mg) 5435±146( ±129(12) 4680±218(10)* 5044±162(14) Corazón (mg) ) 416±12(11) 422±11(12) 315±7(10)*** 362±10(13)*** Riñones (mg) 523±13(11) 509±14(12) 353±14(9)*** 427±18(14)*** Bazo (mg) 379±15(12) 395±22(11) 317±30(10) 320±32(13)* Células tumorales 85,8±7(10) 90,5±8(11) Tabla 1. Efectos del SP030, inhibidor doble de los factores de transcripción AP-1 y NFκB, en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los pesos de los tejidos están expresados como porcentaje del peso inicial. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño de la muestra se indica entre paréntesis. TAB = tejido adiposo blanco (dorsal), TAM = tejido adiposo marrón (interescapular), EDL = extensor digitorum longus. El número de células tumorales está expresado como millones de células totales. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores de los animales tratados y no tratados. Para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados los resultados estadísticos están representados como:, p<0,05;, p<0,05;, p<0,

6 Para poder demostrar que el compuesto tenía el efecto deseado en el músculo, realizamos ensayos de retardo en gel para ambos factores de transcripción en los músculos gastrocnemius de los animales. Los resultados (figura 1) demostraron que este compuesto es eficiente en la inhibición de la actividad de unión al DNA para el factor de transcripción AP-1. La disminución de AP-1 se observó en los grupos tratados, tanto en controles como en los portadores de tumor. Para el factor NF-κB los resultados mostraron que el compuesto no es capaz de inhibir la actividad de unión al DNA en los animales tratados, al menos a la dosis utilizada en el presente estudio. Teniendo en cuenta estos resultados, decidimos buscar el mecanismo implicado en la recuperación de la caquexia en los animales con tumor y tratados con el compuesto. Centrando nuestro trabajo en el músculo esquelético, analizamos la expresión de uno de los factores miogénicos más importantes, MyoD, que como ya se ha indicado previamente está directamente involucrado en la diferenciación y regeneración del músculo. Además, MyoD se ha propuesto como un factor clave en el desarrollo de la caquexia, ya que está disminuido en el músculo de dos modelos experimentales de caquexia. Cuando analizamos la expresión de MyoD por Northern blot, observamos que el mrna de este factor estaba disminuido en el gastrocnemius de los animales portadores de tumor, y que su expresión era parcialmente recuperada por el tratamiento con SP030 (figura 2). El tratamiento con este compuesto produjo además una reducción muy importante de los niveles circulantes de triacilglicéridos (TAG) en los animales portadores de tumor; esta disminución también se pudo observar en los controles, pero sólo como una tendencia. Los niveles de los otros metabolitos estudiados no sufrieron variaciones con el tratamiento (tabla 2). Con la finalidad de esclarecer un poco más el mecanismo de acción del SP030, decidimos analizar si era capaz de reducir la activación de uno de los sistemas proteolíticos que están activados en la caquexia: el sistema proteolítico dependiente de ATP y ubiquitina. Para esto realizamos ensayos de Northern blot para la ubiquitina (figura 3, A y B) y la enzima conjugadora E2 (figura 3, C y D). Los resultados de la expresión de la ubiquitina, obtenidos en los músculos de los animales tanto controles como portadores de tumor, no fueron diferentes entre los animales tratados con el compuesto y los no tratados, pero cuando analizamos los resultados en la expresión de E2 observamos claramente que el incremento de expresión de E2 que se produce en los animales portadores de tumor se normaliza cuando los animales son tratados con el SP030, aunque la disminución entre animales portadores de tumor tratados y no tratados no llegó a ser estadísticamente significativa se observo que la activación de la expresión génica de esta proteína presente en los animales portadores de tumor no se observo en los animales portadores de tumor tratados (figura 3 (C y D) y tabla 3). 134

7 A. AP B. Unidades arbitrarias * * 20 SP Tumor Tumor SP C. NF-κB 120 D. Unidades arbitrarias SP Tumor Tumor SP Figura 1. Actividad de unión al DNA para los factores de transcripción AP-1 y NFκB en los músculos GSN de ratas portadores del hepatoma ascítico AH-130 y tratadas con SP030. Panel A: EMSA representativo de AP-1; los carriles son: control (1), control tratado (control SP) (2), tumor (3) y tumor tratado (tumor SP) (4). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05 animales tratados vs no tratados. Panel C: EMSA representativo de NF-κB; los carriles son: control (1), control SP (2), tumor (3) y tumor SP (4). Panel D: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. 135

8 A. MyoD 18S 120 B. Unidades arbitrarias * 20 SP Tumor Tumor SP Figura 2. Expresión del factor miogénico MyoD en el músculo GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 y tratadas con SP030. Panel A: Northern blot representativo de la expresión del factor MyoD; los carriles son: control (1), control SP (2), tumor (3) y tumor SP (4). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0.05 control v/s tumor;, p<0.05 tumor vs tumor SP. SP Tumor Tumor SP Glucosa (mm) 12,3±0,7(11) 13,2±0,7(12) 7,1±0,4(10)*** 7,7±0,6(13)*** Lactato (mm) 1,3±0,2(12) 1,7±0,2(12) 3,0±0,2(8)*** 2,7±0,2(12)** TAG (mg/ ml) 115±10(12) 91±10(12) 236±39(8)** 109±18(12) Alanina (µm) 401±22(5) 394±21(5) 553±57(5)* 479±27(5)* Tabla 2. Efectos del inhibidor SP030 sobre los niveles de metabolitos circulantes en ratas portadoras del tumor Yoshida AH-130. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. TAG = triacilglicéridos. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores de los animales tratados y no tratados. Para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados, los resultados estadísticos están representados como:, p<0,

9 A. Ubiquitina 2.4 Kb 1.2 Kb 18S *** *** B. Unidades arbitrarias * * 2,4 Kb 1,2 Kb 50 SP Tumor Tumor SP C. E2 1.8 Kb 1.2 Kb 18S * * D. Unidades arbitrarias ,8 Kb 1,2 Kb SP Tumor Tumor SP Figura 3. Expresión de la ubiquitina y E2 en el músculo GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 y tratadas con el SP030. Panel A: Northern blot representativo de la expresión de la ubiquitina. Los carriles son: control (1), control SP (2), tumor (3) y tumor SP (4). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: ***, p<0,001 control vs tumor; ***, p<0,001 control SP vs tumor SP. *, p<0,05 control vs tumor. Panel C: Northern blot representativo de la expresión de E2. Los carriles son: control (1), control SP (2), tumor (3) y tumor SP (4). Panel D: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05 control vs tumor. 137

10 Para intentar buscar otra vía por la cual este compuesto podría ser capaz de revertir el desgaste muscular, realizamos un análisis de la expresión de la proteína desacopladora de la cadena respiratoria UCP3. Esta proteína está íntimamente ligada al desgaste muscular asociado a la perdida de masa muscular en condiciones catabólicas (Sanchís et al., 1998). Los resultados obtenidos (figura 4) descartan que este compuesto pudiera actuar por la vía de la UCP3, a la concentración estudiada y en las condiciones experimentales utilizadas. UCP S Unidades arbitrarias * ** SP Tumor Tumor SP Figura 4. Expresión de la UCP3 en el músculo GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 y tratadas con el SP030. Panel A: Northern blot representativo de la expresión de la UCP3; los carriles son: control (1), control SP (2), tumor (3) y tumor SP (4). Panel B. Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0.05 control vs tumor y control SP vs tumor SP Resumen de los resultados para el tratamiento con el SP030 en el modelo de hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los resultados obtenidos en las determinaciones que se realizaron, con el músculo GSN de los animales, se pueden observar de forma resumida en la tabla

11 SP Tumor Tumor SP NF-κB ± 12 (7) 78 ± 7 (5) 107 ± 8 (9) 117 ± 2 (6) AP-1 ± 11 (5) 70 ± 4 (5)* 101 ± 8 (7) 72 ± 8 (5)* MyoD ± 13 (3) 97 ± 7 (5) 61 ± 6 (3)* 83 ± 5 (5) Ubiquitina 2,4 Kb ± 10 (6) 114 ± 3 (5) 248 ± 18 (6)*** 243 ± 11 (7)*** Ubiquitina 1,2 Kb ± 6 (6) 104 ± 9 (5) 139 ± 10 (6)** 148 ± 16 (7)* E2 1,8 Kb ± 9 (5) 116 ± 13 (4) 142 ± 13 (3)* 130 ± 6 (6) E2 1,2 Kb ± 8 (5) 113 ± 6 (4) 171 ± 36 (3)* 128 ± 11 (6) UCP3 ± 13 (4) 102 ± 12 (6) 181 ± 23 (5)* 177 ± 15 (6)** Tabla 3. Resumen de los resultados del efecto del SP030 en el músculo GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores de los animales tratados y no tratados. Para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados, los resultados estadísticos están representados como:, p<0, Determinación de la tasa de degradación proteica en músculos EDL de rata incubados en presencia del SP030. Para determinar si el inhibidor era capaz de actuar directamente sobre el músculo, esquelético se determinó la tasa de degradación proteica mediante la incubación de músculos EDL, en presencia y ausencia del SP030. Los resultados, representados en la figura 5, demuestran que este compuesto es capaz de revertir la proteólisis basal de los músculos EDL, determinado mediante la liberación de tirosina al medio de incubación en presencia de cicloheximida. Los resultados demuestran que la presencia del compuesto produce una disminución de un 16% de la tirosina liberada al medio, lo que pone de manifiesto un efecto directo del inhibidor sobre la proteólisis muscular. Proteólisis Muscular mmoles tirosina/g/2h * (8) SP030 (11) Figura 5. Tasa proteolítica en músculos EDL de rata incubados con SP030. Los datos estás presentados como media ± s.e.m y expresados como los nmoles de tirosina liberada al medio por gramo de tejido en dos horas de incubación. La concentración de SP030 utilizada fue µm. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. La tasa proteolítica se midió en presencia de cicloheximida 500 nm. *, expresa un valor de p<0,05 entre controles y SP

12 2. Efecto del RU38486 sobre la regulación de los factores de transcripción en el músculo de animales portadores de tumor. Con los datos existentes en la bibliografía y los resultados ya expuestos, decidimos analizar la importancia de los glucocorticoides en la regulación de AP-1 y NF-κB en el músculo de ratas con caquexia. Para desarrollar este objetivo, utilizamos el modelo tumoral de rata Yoshida AH-130 y el RU38486, un antagonista del receptor de glucocorticoides. Los animales fueron divididos en controles y tumores, y cada grupo se subdividió a su vez en tratados y no tratados. La dosis utilizada fue de 5 mg/kg de peso corporal. Con anterioridad en nuestro grupo se determinó que este antagonista del receptor de glucocorticoides no presentaba efectos beneficiosos sobre la caquexia asociada al crecimiento tumoral (Llovera et al., 1996a), ya que no revirtió la activación de la expresión de la ubiquitina (figura 6), así como tampoco logró revertir el desgaste muscular asociado a la caquexia. Sin embargo, la tendencia observada con anterioridad en una reducción del número de células tumorales en este experimento se confirmo de forma significativa (tabla 4). (5) RU38486 (5) Tumor (6) Tumor RU38486 (6) GSN (mg) 673 ± ± ± 19*** 515 ± 6*** Soleus (mg) 47 ± 2 42 ± 2 36 ± 1*** 37 ± 2 Tibialis (mg) 217 ± ± ± 3*** 169 ± 1*** EDL (mg) 54 ± 1 54 ± 2 41 ± 1*** 40 ± 0,2*** TAB (mg) 897 ± ± ±73** 436 ± 70*** Hígado (mg) 5886 ± ± ± ± 123 Células tumorales (x10 6 ) ± 7 59 ± 2 Tabla 4. Efectos del tratamiento con RU38486 en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. TAB = tejido adiposo blanco (dorsal), EDL = extensor digitorum longus. El número de células está expresado en millones de células totales. Significatividad estadística de los resultados: **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores de los animales tratados y no tratados. Para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados, los resultados estadísticos están representados como:, p<0,

13 Los resultados del presente estudio confirmaron los ya obtenidos por nuestro grupo (Llovera et al., 1996a), donde no se observó ninguna variación en la expresión de la ubiquitina. El tratamiento con el RU38486 no logró revertir la activación de la expresión de esta proteína en los animales portadores de tumor; por el contrario, la utilización del RU38486 produjo un aumento de la expresión de la ubiquitina en los músculos GSN de los animales del grupo control tratado (figura 6) A. Ubiquitina 2.4 Kb 1.2 Kb 18S *** *** B. Unidades arbitrarias ** ** 2,4 Kb 1,2 Kb 50 RU38486 Tumor Tumor RU38486 Figura 6. Expresión de la ubiquitina en el GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 tratadas con RU Panel A: Northern blot representativo de la expresión de la ubiquitina. Los carriles son: control (1), control RU38486 (2), tumor (3) y tumor RU38486 (4). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01, ***, p<0,001 para las comparaciones entre control y tumor., p<0,05 para las comparaciones entre los grupos tratados y los no tratados. 141

14 Cuando analizamos la actividad de unión al DNA para los factores de transcripción AP-1 y NF-κB, observamos que este compuesto presentó una tendencia a aumentar la actividad de unión al DNA de ambos factores, aunque los valores no llegaron a ser estadísticamente significativos (figura 7) A. AP B. C. D. Unidades arbitrarias Unidades arbitrarias Tumor Tumor RU486 NFκB Tumor Tumor RU486 Figura 7. Actividad de unión al DNA para los factores de transcripción AP-1 y NFκB en los músculos GSN de ratas portadores del hepatoma ascítico AH-130 y tratadas con RU Panel A: EMSA representativo de AP-1; los carriles son: control (1), tumor (2) y tumor RU38486 (3). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Panel C: EMSA representativo de NF-κB, los carriles son: control (1), tumor (2) y tumor RU38486 (3). Panel D: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. 142

15 A partir de estos resultados, quisimos analizar la regulación de MyoD en el músculo de los animales tratados con el RU Los resultados demostraron que el tratamiento con el RU38486 provoca una disminución en la expresión de MyoD en los animales portadores de tumor, estimada por Northern blot (figura 8) A. MyoD 18 S B. Unidades arbitrarias *** ** 20 RU486 Tumor Tumor RU486 Figura 8. Expresión del factor miogénico MyoD en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 tratadas con RU Panel A: Northern blot representativo de la expresión del factor MyoD; los carriles son: control (1), control RU38486 (2), tumor (3) y tumor RU38486 (4). Panel B: Análisis densitométrico de los resultados, expresados como la media ± s.e.m. y presentados como porcentaje del control. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01, ***, p<0,001 para las comparaciones entre control y tumor., p<0,05 para las comparaciones entre los grupos tratados y no tratados. 143

16 2.1. Resumen de resultados para el tratamiento con RU38486 en animales portadores de tumor. Los resultados pertenecientes a este experimento se pueden observar de forma resumida en la tabla 5. RU486 Tumor Tumor RU486 Ubiquitina 2,4 Kb ±15(5) 171±25(5) 407±20(6)*** 368±4(5)*** Ubiquitina 1,2 Kb ±13(5) 127±18(5) 246±33(6)** 214±8(5)** AP-1 ±8(4) n.d. 96±10(5) 114±10(4) NFκB ±16(4) n.d. 95±13(5) 142±38(4) MyoD ±6(5) 121±22(5) 47±5(6)*** 31±5(5)** Tabla 5. Resumen de los resultados del efecto del tratamiento con RU38486 en los músculos GSN de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores., p<0,05 para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados. n.d.= no determinado. 144

17 3. Efecto del agonista de PPARγ GW1929 en la caquexia asociada al crecimiento tumoral. La familia de receptores nucleares PPARs (peroxisome proliferator activated receptor) aparecen como dianas muy interesantes en el estudio de estrategias dirigidas a contrarrestar la caquexia. Por ello, en el presente estudio hemos querido probar el GW1929, un potente agonista de PPARγ, como un posible compuesto anticaquéctico. Escogimos el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis en ratón, porque los datos encontrados en la bibliografía habían sido obtenidos en esta especie; además, la dosis utilizada y el número de días de tratamiento estaban limitados por la cantidad de compuesto disponible. Por último, el que este modelo no presente anorexia es un requisito importante en la realización de este experimento, dado que los PPARs están altamente regulados por la ingesta. Los ratones de la cepa C57BL/6 fueron divididos en dos grupos: controles y portadores de tumor. La dosis utilizada fue 10 mg por kg de peso y por día, administrado intraperitonealmente y disuelto en PEG400/DMSO al 5%. El tratamiento tuvo una duración de 5 días, a partir del día 8 y hasta el día 12 de crecimiento tumoral. A los 13 días de crecimiento tumoral los animales fueron anestesiados y sacrificados. Se procedió a la extracción de la sangre de la aorta abdominal, y los tejidos fueron rápidamente extraídos, pesados y congelados. En la tabla 6 se muestran los resultados de los pesos de los tejidos. Se puede observar que la implantación del tumor produjo una pérdida del peso corporal en los animales muy importante, de un 32% de la masa muscular y una disminución del % del tejido adiposo blanco dorsal. El tratamiento con el compuesto no supuso una mejoría en los pesos de los tejidos de los animales portadores tumor, ni tampoco un aumento en los controles tratados, excepto en el músculo EDL de los animales portadores de tumor tratados, que presentó un aumento del 27% del peso comparado con los EDL de los animales portadores de tumor sin tratamiento. También pudimos observar que los animales tratados comían más que los no tratados, pero bebían menos. El hígado de los animales portadores de tumor tratados también presentó una considerable recuperación de un 18% con respecto al hígado de los animales portadores de tumor no tratados. Peso corporal e ingesta Tumor Tumor (4) GW1929 (6) GW1929 (4) (6) Peso corporal inicial (g) 18,6±1,1 19,3±0,7 18,5±0,3 18,7±0,5 Peso corporal final (g) sin 20,4±0,8 21,2±0,3 15,7±0,6*** 16,6±0,7*** tumor Incremento peso corporal (g) 1,8±0,5 1,9±0,5-2,8±0,4*** -2,2±0,3*** Carcasa (g) 89±2,4 89±2,6 65±1,7*** 66±1,4*** Ingesta total media (g) 34,5±0,3 36,5±0,3 30±0,9** 33±0.9* Bebida total media (ml) 103±1,7 61,5±0,3 48,5±1,6*** 37,5±2*** Pesos de los músculos Tibialis (mg) 178±12 181±6 118±6*** 116±4*** EDL (mg) 32±3 33±4 22±2** 28±2 Gastrocnemius (mg) 562±25 563±14 389±20*** 382±20*** Soleus (mg) 23±1 30±5 19±2 21±2 145

18 Peso tejido adiposo TAB (mg) 188±43 153± Pesos de los órganos Hígado (mg) 6127± ± ±360** 5801±182 Corazón (mg) 533±30 472±10 424±8** 419±18* Riñones (mg) 649±27 637±26 598±26 590±18 Bazo (mg) 312±24 315± ±93*** 1061±62*** Peso Tumor 2,8±0,3 3,4±0,1 Tabla 6. Efectos del GW1929, en ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Los pesos de los tejidos están expresados como porcentaje del peso inicial. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. TAB = tejido adiposo blanco (dorsal), EDL = extensor digitorum longus, el peso del tumor esta expresado en gramos. Significatividad estadística de las diferencias: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 para las comparaciones entre controles y tumores., p<0,05;, p<0,01;, p<0,001 para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados los resultados estadísticos están representados como: Para analizar si esta mejoría era realmente debida al uso de este compuesto, comparamos los niveles de expresión de la proteína GLUT4, un transportador de glucosa que está presente en las células musculares diferenciadas y cuyo gen es diana de PPARγ. Los resultados demostraron que la implantación del tumor producía una marcada reducción en el transportador GLUT4 del músculo EDL, pero no del GSN. El tratamiento con el GW1929 resultó en una recuperación clara de los niveles de GLUT4 para los músculos EDL de los animales tratados; esta recuperación no se observó en los músculos GSN de los mismos animales (figura 9). La disminución de GLUT4 que se observó en los músculos EDL de controles comparados con los animales portadores de tumor fue de un 40%. La recuperación observada en los músculos EDL de los animales tratados fue de un 51% para GLUT4, al comparar los animales portadores de tumor tratados con los no tratados. En los músculos GSN de los animales tratados comparados con los no tratados, se observó un discreto aumento de GLUT4, pero estas diferencias no llegaron a ser estadísticamente significativas. 146

19 A. GLUT4 Tubulina B. Unidades arbitrarias ** GW1929 LLC LLC GW C. GLUT4 Tubulina D. Unidades arbitrarias GW1929 LLC LLC GW1929 Figura 9. Niveles del transportador de glucosa GLUT 4 en los músculos EDL y GSN de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis y tratados con GW1929. Panel A: Western blot representativo de la expresión de GLUT4 en los músculos EDL; los carriles son: control (1), control GW1929 (2), LLC (3) y LLC GW1929 (4). La carga de proteína es corregida con la expresión de la tubulina. Panel B: Análisis densitométrico de la expresión de GLUT 4. Los resultados se presentan como porcentaje del control y están expresados como la media ± s.e.m. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01 control vs LLC. Panel C. Western blot representativo de la expresión de GLUT4 en los músculos GSN; los carriles son: control (1), control GW1929 (2), LLC (3) y LLC GW1929 (4). La carga de proteína es corregida con la expresión de la tubulina. Panel D: Análisis densitométrico de la expresión de GLUT4. Los resultados se presentan como porcentaje del control y están expresados como la media ± s.e.m. Quisimos analizar otro gen involucrado de forma clara en la miogénesis y regeneración del músculo y además en el desarrollo de la caquexia. Por este motivo determinamos mediante la técnica de Western blot el factor miogénico MyoD en los músculos EDL y GSN de los animales de este experimento. Los resultados concordaron con los obtenidos para el transportador GLUT4, es decir, mientras MyoD 147

20 disminuyó un 69% en los músculos EDL, los músculos GSN no presentaron una variación significativa. Así mismo, la recuperación observada en los músculos EDL para GLUT4 también la pudimos observar para el factor de transcripción MyoD en un 75%, al comparar los animales portadores de tumor tratados y los no tratados (figura 10) A. MyoD Tubulina B. Unidades arbitrarias ** GW1929 LLC LLC GW C. MyoD Tubulina D. Unidades arbitrarias Contr GW1929 LLC LLC GW1929 Figura 10. Expresión del factor miogénico MyoD en los músculos EDL y GSN de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis y tratados con GW1929. Panel A: Western blot representativo de la expresión de MyoD en los músculos EDL; los carriles son: control (1), control GW1929 (2), LLC (3) y LLC GW1929 (4). La carga de proteína es corregida con la expresión de la tubulina. Panel B: Análisis densitométrico de la expresión de MyoD. Los resultados se presentan como porcentaje del control y están expresados como la media ± s.e.m. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01 control vs LLC;, p<0.05 LLC vs LLC GW1929. Panel C: Western blot representativo de la expresión de MyoD en los músculos GSN; los carriles son: control (1), control GW1929 (2), LLC (3) y LLC GW1929 (4). La carga de proteína es corregida con la expresión de la tubulina. Panel D. Análisis densitométrico de la expresión de MyoD. Los resultados se presentan como porcentaje del control y están expresados como la media ± s.e.m. 148

21 3.1. Resumen de los resultados obtenidos en el tratamiento de ratones portadores del LLC con el GW1929. La tabla 7 muestra los resultados en forma de resumen de las determinaciones realizadas por Western blot en los músculos EDL y GSN de los animales de este experimento. GW1929 LLC LLC GW1929 EDL MyoD ±12(3) 85±2(2) 31±3(4)** 106±31(3) GLUT4 ±9(3) 96±7(2) 60±7(4)** 111±31(3) GSN MyoD ±10(2) 153±16(3) 116±1(2) 112±13(3) GLUT4 ±8(3) 119±16(4) 107±3(4) 122±14(4) Tabla 7. Resumen de los resultados del efectos del GW1929 en el músculo esquelético de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Los datos están presentados como media ± s.e.m. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. Significatividad estadística de las diferencias: **, p<0,01 para las comparaciones entre controles y tumores., p<0,05 para las comparaciones entre los animales tratados y no tratados Determinación de la tasa de degradación proteica en músculos EDL de rata incubados en presencia de GW1929. Para intentar esclarecer si este compuesto era capaz de actuar directamente sobre el músculo, realizamos incubaciones de músculos EDL en presencia y ausencia del GW1929. Los resultados demostraron un efecto directo del compuesto sobre la proteolisis muscular, ya que era capaz de reducir la proteólisis en un 17% en los músculos EDL incubados en presencia del GW1929, determinado mediante la liberación de tirosina al medio de incubación en presencia de cicloheximida (figura 11). 149

22 Proteólisis muscular nmoles Tirosina/g/2h (7) GW1929 (10) * Figura 11. Tasa proteolítica en músculos EDL de rata incubados con GW1929. Los datos estás presentados como media ± s.e.m y expresados como los nmoles de tirosina liberada al medio por gramo de tejido en dos horas de incubación. La concentración de GW1929 utilizada fue 50 µm. El tamaño muestral se indica entre paréntesis. La tasa proteolítica se midió en presencia de cicloheximida 500 nm. *, expresa un valor de p<0,05 entre controles y GW

23 DISCUSIÓN 1. Efecto del tratamiento con el SP030 en la caquexia en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Los factores de transcripción AP-1 y NF-κB se han relacionado directamente con el desarrollo de la caquexia in vivo en un modelo de infección aguda (Penner et al., 2001). Por otra parte, experimentos in vitro demuestran que el TNF-α bloquea la diferenciación de los miogénica por un mecanismo mediado por NF-κB y que provoca una importante disminución de MyoD, un miembro de la familia de factores miogénicos bhlh (Miller et al., 1998; Guttridge et al., 2000; Langen et al., 2004). Nosotros hemos podido determinar que en la caquexia inducida por el crecimiento tumoral, la actividad de unión al DNA para NF-κB no varía en el transcurso del crecimiento tumoral, y que la actividad de unión al DNA para AP-1 aumenta drásticamente a día 4 de crecimiento tumoral para luego regresar a los niveles del control. La utilización de SP030, un inhibidor doble de NF-κB y AP-1 en el tratamiento de la caquexia cancerosa, ha resultado en una leve mejoría de algunos de los tejidos, principalmente músculo esquelético; los animales tratados presentan más tejido adiposo blanco que los animales no tratados, aunque esta diferencia no llega a ser estadísticamente significativa. Otros órganos que presentan una importante mejoría son corazón, riñones e hígado (tabla 1), todo ello sin afectar el crecimiento tumoral, ya que la cantidad de células tumorales entre tumores tratados y no tratados no presenta diferencias significativas (tabla1). Cuando analizamos la actividad de unión al DNA para AP-1 y NF-κB en los músculos GSN de los animales tratados y no tratados, observamos que la actividad de unión al DNA de AP-1 se veía disminuida estadísticamente significativamente por el tratamiento con este compuesto (figura 1, A y B; tabla 3). Por otra parte, la actividad de unión al DNA para NF-κB no presento diferencias significativas entre los animales portadores de tumor tratados y no tratados, aunque el control tratado presenta una menor actividad de unión al DNA que el control no tratado, la diferencia no llega a ser estadísticamente significativa (figura 1, C y D; tabla 3). Cuando analizamos la expresión del factor miogénico MyoD, observamos una importante disminución entre control y tumor, diferencia que no se observó en los animales tratados (figura 2); además, los animales portadores de tumor tratados presentaron niveles de expresión para MyoD significativamente superiores a los de los portadores de tumor no tratados (tabla 3). Este dato contrasta con los observados en modelos de infección aguda (Pender et al., 2001) y con los datos que postulan a NFκB como el factor clave en el desarrollo de la caquexia y la pérdida de MyoD. El aumento de este factor miogénico podría estar favoreciendo la recuperación del músculo ante el daño causado por el crecimiento tumoral. Los resultados obtenidos nos permiten proponer al factor de transcripción AP-1 como un factor clave en el desarrollo de la caquexia. Los animales portadores del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 sufren variadas alteraciones metabólicas (Argilés et al., 1997), algunas de las más importantes a nivel del metabolismo lipídico, donde el crecimiento tumoral provoca una marcada hipertrigliceridemia. El tratamiento con el SP030 provocó una disminución de la cantidad de TAG en circulación (tabla 2). Esta disminución podría ser resultado de una menor lipólisis en el tejido adiposo, dato que concuerda con el aumento en la masa de TAB en los animales tratados. Por otra parte, también podría ser el resultado de una mejoría de las alteraciones que presenta el metabolismo lipídico en el hígado, o una mayor utilización por parte de músculo. Para terminar de esclarecer este efecto, se deben llevar a cabo más estudios. El tratamiento con el SP030, si bien no logró disminuir la expresión de la ubiquitina (figura 3, A y B; tabla 3), altamente aumentada en este modelo (Llovera et 151

24 al., 1994), sí que fue capaz de disminuir la activación en la expresión de la enzima conjugadora de la ubiquitina E2 (figura 3, C y D; tabla 3). La menor expresión de E2 puede estar disminuyendo la actividad de este sistema proteolítico, ya que una menor expresión de E2 puede dar lugar a una menor cantidad de proteínas unidas a la ubiquitina y, por consiguiente, una menor cantidad de sustrato para el proteasoma. Este resultado podría explicar en parte la recuperación que produce este tratamiento. Otro factor que contribuye al gasto energético aumentado en el músculo esquelético de animales portadores del hepatoma ascítico Yoshida AH-130, es la activación de las proteínas desacopladoras de la cadena respiratoria (Sanchís et al., 1998). El tratamiento con el SP030 no logró revertir la activación de la UCP3 en los músculos GSN de los animales portadores de tumor (figura 4, tabla 3). Por último, el SP030 disminuyó la tasa de proteolisis en músculos EDL incubados en presencia de cicloheximida; esto nos permite concluir que el efecto del SP030 es directo sobre el músculo esquelético. En resumen, y con los datos recogidos, podemos decir que el SP030 es un compuesto con características anticaquécticas, debido principalmente a que los animales presentan una menor pérdida de masa muscular. En el músculo esquelético de los animales tratados, la recuperación de la expresión de MyoD (un factor miogénico clave en el desarrollo de la caquexia) y la disminución de E2 (enzima conjugadora de la ubiquitina), podrían ser los principales efectos moleculares que inducen la recuperación en las ratas portadoras del Yoshida AH Efecto del RU38486 sobre la regulación de los factores de transcripción en el músculo de animales portadores de tumor y que presentan caquexia. Como fue determinado con anterioridad en nuestro grupo, el tratamiento con el RU38486 no fue capaz de revertir la caquexia inducida por el crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 (Llovera et al., 1996). La implantación del tumor produjo una importante pérdida de peso en músculos, TAB y otros órganos que el tratamiento no fue capaz de revertir (tabla 4). En este experimento se confirmó el efecto antitumoral de este compuesto, reduciendo el número total de células tumorales (tabla 4), tendencia que ya se observó con anterioridad en el citado estudio. El tratamiento con el RU38486 no revirtió la activación de la expresión de la ubiquitina; por el contrarío, el RU38486 aumentó la expresión de uno de los transcritos que codifican para la ubiquitina en los animales controles tratados con este compuesto. El tratamiento con este compuesto produjo una activación de los factores de transcripción AP-1 y NF-κB, aunque no significativos (figura 7). Los glucocorticoides, por medio de su receptor, pueden reprimir la actividad de AP-1 y NFκB (revisado por Bosscher et al., 2003); asimismo, los glucocorticoides antagonizan AP-1 inhibiendo la activación de las JNK (Gonzalez et al., 2000). La concentración de glucocorticoides circulantes en caquexia están aumentada (Rivadeneira et al., 1999), pero el papel que pueden estar realizando aún no se conoce. El tratamiento con el RU38486, al inhibir la actividad de los glucocorticoides, aumenta la actividad de unión al DNA de AP-1 y NFκB, lo que provoca un efecto negativo. La expresión de MyoD está más disminuida en los animales portadores de tumor tratados con el RU38486 que en los animales portadores de tumor no tratados (figura 8). Esto nos permite proponer un papel protector de los glucocorticoides en la disminución de la expresión de MyoD inducida por el crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH

25 3. Efecto del GW1929 en la caquexia asociada al crecimiento del carcinoma pulmonar de Lewis en ratón. El desarrollo y crecimiento del carcinoma pulmonar de Lewis produce una amplia cantidad de alteraciones metabólicas, que terminan por provocar una fuerte pérdida de peso corporal y un marcado desgaste de los tejidos y órganos. El tratamiento con el agonista de PPARγ GW1929 no logró revertir las alteraciones en los pesos de los tejidos y órganos, excepto en los músculos EDL y en el hígado de los ratones portadores de tumor tratados (tabla 5). Este compuesto logró revertir la pérdida observada de uno de los transportadores de glucosa más importante para el músculo, el GLUT4, en los EDL de los animales portadores de tumor (figura 9, A y B, tabla 7). En cambio, para los músculos GSN de los mismos animales, no se observaron cambios (figura 9, C y D; tabla 7). También analizamos la expresión proteica del factor miogénico MyoD en los músculos EDL y GSN de los animales controles y portadores de tumor, tratados y no tratados. Observamos que este factor no sufrió modificaciones en su expresión proteica en los músculos GSN (figura 10, C y D; tabla 7). En cambio, los niveles de MyoD bajaron drásticamente en los EDL de los animales con tumor. El tratamiento con el GW1929 revirtió en parte la perdida de MyoD en estos músculos (figura 10, A y B; tabla 7). También hemos podido determinar que el efecto del GW1929 es directo sobre el músculo, ya que reduce significativamente la tasa de proteólisis en músculos EDL incubados en presencia del compuesto (figura 11). Este modelo tumoral cursa con niveles elevados de TNF-α. Estos niveles podrían explicar las alteraciones observadas en MyoD y GLUT4. Los integrantes de la familia de receptores nucleares PPAR s están estrechamente relacionados con la regulación de la respuesta inflamatoria (revisado por Delerive et al., 2001). PPARγ es capaz de inhibir la transactivación de AP-1 y NFκB por diversos mecanismos (Delerive et al., 1999b; Castrillo et al., 2000; Rossi et al., 2000). Esta regulación negativa que ejercen sobre los factores de transcripción NFκB y AP-1, podría explicar en parte el efecto positivo que tiene este compuesto sobre la caquexia y específicamente sobre los músculos EDL de los animales tratados. 153

26 154 Capítulo II