Primera Parte. Avances de inmunología molecular y estructural: receptores, señales intracelulares y regulación transcripcional

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1 Primera Parte Avances de inmunología molecular y estructural: receptores, señales intracelulares y regulación transcripcional

2 Capítulo 1 GENERACIÓN DE LA DIVERSIDAD DE LOS ANTICUERPOS Y SU USO DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICO Osvaldo J. López* y Matías Ostrowski RESUMEN El mecanismo generador de la diversidad de anticuerpos tiene la capacidad de producir anticuerpos específicos contra cualquier agente infeccioso, aun contra las variantes que todavía no han aparecido en la naturaleza. La especificidad de un anticuerpo es una valoración cualitativa de un fenómeno cuantitativo: la constante de afinidad del anticuerpo por el antígeno. 1 Los anticuerpos son proteínas y los antígenos pueden ser proteínas, azúcares, lípidos, DNA e incluso sustancias químicas pequeñas. Las constantes de unión (K on ) y de liberación (K off ) del complejo anticuerpo-antígeno pueden ser medidas. La relación entre la K off y la K on se denomina constante de afinidad (K a ) de ese par anticuerpo-antígeno. En una respuesta inmune típica la K a es de alrededor de 10-6 M al comienzo de la inmunización y aumenta durante los días posteriores hasta llegar a valores entre y veces superiores. Este proceso de aumento de la afinidad de los anticuerpos por el antígeno se denomina maduración de la afinidad. 2 En el presente capítulo se exponen los avances moleculares relacionados con los mecanismos de diversidad en la generación de anticuerpos, como recombinación somática V(D)J, variabilidad de unión (joint) o soldadura, adición de nucleótidos, hipermutación somática y las aplicaciones biotecnológicas de anticuerpos en el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades inmunitarias. * olopez@fvet.uba.ar

3 4 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL ANTICUERPOS. NUEVOS AVANCES MOLECULARES ESTRUCTURA DE LOS ANTICUERPOS Para entender el mecanismo de generación de la diversidad es imprescindible el conocimiento de la estructura de los anticuerpos. 3 La figura 1-1 muestra un anticuerpo del tipo IgG y las distintas partes en que puede ser fraccionado por el uso de enzimas. Además de la IgG existen otros cuatro tipos de anticuerpos que se denominan isotipos: IgM, IgD, IgA e IgE. A su vez, la IgA y la IgG se dividen en subisotipos. Así, existen la IgA1 y la IgA2 y las IgG 1, 2, 3 y 4. La IgG es un tetrámero formado por dos heterodímeros. La cadena más larga se denomina cadena pesada o cadena H (heavy). Está formada por aproximadamente 470 aminoácidos. La cadena más corta se denomina liviana y está formada por unos 215 aminoácidos. Las cadenas pesadas y las livianas del mismo anticuerpo son idénticas entre sí. Cada cadena liviana está unida a una cadena pesada a través de un puente disulfuro entre dos aminoácidos cisteínas presentes en ambas cadenas. A su vez, las cadenas pesadas están unidas entre sí por puentes disulfuros entre cisteínas presentes en la región bisagra, ubicada en la parte media de cada una de esas cadenas pesadas. La cadena liviana se divide en dos dominios. Los dominios son estructuras cilíndricas formadas por alrededor de 110 aminoácidos que, si bien son parte de la misma proteína, están separadas en el espacio, división que se asocia con una función diferente. Los dominios de la cadena liviana se conocen como dominios constante o C L y variable o V L. El dominio constante de la cadena liviana se relaciona químicamente con la cadena pesada por el puente disulfuro entre cisteínas, y el variable se vincula al reconocimiento del antígeno. La cadena pesada está dividida en los dominios V H (variable pesada) y las constantes 1, 2 y 3 (C H 1, C H 2 y C H 3). Entre el dominio C H 1 y el C H 2 se extiende la región bisagra de unos 30 aminoácidos. El dímero formado por la V L /C L y la V H /C H 1 se denomina Fab. Los Fab se unen al epitope. Los anticuerpos pueden ser digeridos para producir los dímeros correspondientes al V H /V L solamente. A estos se los denomina fragmentos variables (Fv). Esta es la mínima zona del anticuerpo que se une al epitope. Como su nombre lo indica, este fragmento es variable entre los distintos anticuerpos, lo que permite que distintos anticuerpos se unan, con distinto grado de afinidad, a distintos epitopes. El dímero formado por los dominios C H 2 y C H 3 se denomina Fc y allí se asocian las funciones auxiliares del anticuerpo, como la unión al receptor para el Fc que se encuentra en las membranas en distintas células del sistema inmune (macrófagos, mastocitos, eosinófilos). Esto permite la opsonización del antígeno para su eliminación del organismo. Las señales para la fijación de las moléculas del complemento y transcitosis a través de los tejidos también se encuentran en el Fc. La comparación de las secuencias de las regiones V L y V H de distintos anticuerpos permitió determinar que existen tres regiones que son más variables: son las regiones o dominios hipervariables o CDR (complementary determining regions). La resolución de la estructura cristalográfica permitió determinar que el anticuerpo establece contactos con el antígeno principalmente a través de los tres CDR de cada una de las regiones V L y V H. Las regiones CDR de las cadenas livianas y pesadas variables confluyen en el espacio en la parte apical del anticuerpo. En la figura 1-1 puede observarse que el anticuerpo tiene dos Fv idénticos y, por lo tanto, puede unirse a dos epitopes del antígeno por ambos. Los patógenos tienen epitopes repetitivos que permiten la interacción de los dos Fv de la IgG sobre su superficie, aumentando la avidez del anticuerpo por éstos. La región del anticuerpo que se une con el epitope se denomina paratope. Por consiguiente, la especificidad de un anticuerpo hacia un antígeno está determinada por los aminoácidos presentes en el paratope que es parte de las dos regiones variables (V L y V H ) y, en particular, de los CDR de ese Fv. El cambio de un aminoácido en alguna de las regiones CDR puede incrementar o disminuir la afinidad por el antígeno. Por ejemplo, cambiando un aminoácido por vez fue posible obtener anticuerpos con diferentes afinidades para el antígeno p-azofenilarsonato. Con algunas mutaciones se observó un aumento de la afinidad y con otras, una disminución de la afinidad. La maduración de la afinidad se debe a mutaciones en los aminoácidos de las regiones variables del Fv de los anticuerpos que ocurren durante el desarrollo de la respuesta inmune. 4 CÉLULA PRODUCTORA DE ANTICUERPOS La célula productora de anticuerpos es el linfocito B. 5 Su nombre deriva de bolsa de Fabricio (órgano linfoide ubicado en la cloaca de las aves), debido al descubrimiento fortuito de que gallinas bursectomizadas no producían anticuerpos. Este hallazgo permitió comprobar que las células productoras de anticuerpos se originan en la médula ósea pero necesitan pasar por un proceso de diferenciación que, en las gallinas, ocurre en la bolsa de Fabricio. En los seres humanos, los linfocitos B se diferencian en el mismo órgano que les da origen: la médula ósea. A diferencia de la mayoría de las otras células somáticas, los linfocitos B y T se caracterizan en que cada uno de ellos posee un receptor de membrana con una especificidad diferente. En el caso del linfocito B es el receptor de células B (B-cell receptor, BCR). El BCR es un anticuerpo IgM anclado en la membrana del linfocito B maduro y asociado con otras moléculas denominadas Igα e Igβ. La función de estas moléculas es transducir una señal de activación al núcleo cuando la IgM de membrana interacciona con un epitope específico. En los seres humanos, además de la IgM, hay también otra inmu-

4 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 5 V H F(ab)2 V L C H 1 Pepsina Papaína C L Pepsina Fab C H 2 Bisagra Fv C H 3 A B scfv FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Fragmento V H V H D J H FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Fragmento V L V L J L C D FIG Estructura de un anticuerpo IgG, sus dominios y fracciones. A. Esquema de una inmunoglobulina IgG con sus dominios. B. Diferentes fracciones de los anticuerpos que pueden obtenerse usando proteasas. Las mismas fracciones pueden obtenerse utilizando técnicas de DNA recombinante. Los fragmentos Fv de cadena simple (scfv) solo pueden ser producidos mediante esta tecnología. C. Estructura de un Fab obtenido por digestión con papaína proveniente de un anticuerpo monoclonal de ratón de isotipo IgG2a unido a su epitope (un péptido de 14 aminoácidos de la proteína VP2 del rinovirus serotipo 2). La cadena pesada se representa en azul y la liviana, en rojo. El péptido interacciona fundamentalmente con los CDR de las cadenas pesada (amarillo) y liviana (blanco). En el extremo inferior de la figura se observa la cisteína 214 (aminoácido carboxiterminal) de la cadena liviana (en blanco) y la cisteína 128 de la cadena pesada (en amarillo) que establecen el puente disulfuro que une ambas cadenas. D. Fragmentos variables pesados y livianos de los anticuerpos. Cada fragmento variable consta de tres CDR y cuatro regiones armazón (FR). El fragmento variable pesado está codificado por la unión de un gen V H (que codifica para las tres primeras FR y los dos primeros CDR). El CDR3 está codificado por la unión del extremo 3 del gen V H, el gen D y el extremo 5 del gen J H. La FR4 es codificada por el gen J H. De igual forma para la cadena liviana, con la diferencia de que el CDR3 solo está formado por la unión del gen V L y el J L.

5 6 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL noglobulina de isotipo IgD que tiene el mismo Fv (por lo tanto, igual especificidad) que la IgM de ese linfocito. El mecanismo que lleva a que cada linfocito B tenga BCR diferentes ocurre a nivel de los genes que codifican para los anticuerpos. 6 Durante el proceso de maduración del linfocito B, se produce la edición de varios genes y minigenes. El resultado de este proceso será un gen codificante para el Fv que es particular para ese linfocito B. Hasta donde sabemos, este proceso ocurre al azar; cuando un linfocito B se está diferenciando en la médula ósea, no hay forma de prever la especificidad que tendrá su BCR. Este proceso se conoce como reordenamiento cromosómico y su mecanismo se verá más adelante. SELECCIÓN CLONAL La aparición de anticuerpos específicos de alta afinidad (K a >10-8 M) contra un antígeno luego de la inmunización fue el enigma que guió la investigación en inmunología durante toda la primera mitad del siglo XX. En la década de 1940, la formulación de la teoría de la selección clonal brindó un marco intelectual para la comprensión de estos mecanismos. 7 En su versión actualizada, esta teoría propone que los linfocitos B se diferencian en la médula ósea; durante este proceso de diferenciación se produce un reordenamiento cromosómico en los genes que codifican para las regiones Fv de los anticuerpos de tal manera que cada linfocito B tiene una especificidad diferente. Si bien en cada linfocito B hay dos copias (ubicadas en cromosomas homólogos) para cada uno de los genes que conforman el Fv (V H ), solo uno se reordena. Este proceso se denomina exclusión alélica. Por lo tanto, cada linfocito B tendrá un solo tipo de Fv, que se obtiene al unirse en el espacio el fragmento codificante del gen V H que se reordenaron. Como el reordenamiento es al azar, una población lo suficientemente grande de linfocitos B tendría algún clon capaz de unirse con cualquier sustancia presente en la naturaleza. Más aún, como se menciona en el resumen al principio de este capítulo, incluso contra sustancias que no existen todavía en la naturaleza. Cuando el linfocito B madura, porta en su BCR expresado en la membrana la especificidad de los anticuerpos que produce. Por un proceso que se denomina splicing alternativo (modificación postranscripcional), los genes para el Fv de ese anticuerpo pueden traducirse junto con los genes que codifican para la IgM o junto con los genes que codifican para la IgD. De esta manera, la IgM y la IgD de membrana tienen la misma especificidad. La presencia de ambas inmunoglobulinas sobre la superficie de un linfocito B permite determinar que se trata de un linfocito B maduro. El linfocito B emigra de la médula ósea hacia la periferia donde deambula por el sistema linfático. Si durante su tráfico por un órgano linfoide encuentra un antígeno con el cual su IgM de membrana establece una interacción suficientemente fuerte, es probable que ese linfocito B se active. Este antígeno es el que selecciona a los clones de linfocitos B específicos contra él. Para que esa activación se produzca es necesario que el linfocito B reciba una segunda señal. Esta señal está dada por citocinas que liberan los linfocitos T colaboradores o helper (Th) específicos para ese antígeno (particularmente los Th2). Los linfocitos Th reconocen un epitope T de ese antígeno que no es el mismo que reconoce el linfocito B. Este proceso ocurre en el centro germinal de los ganglios o en el bazo. La activación del linfocito B en el centro germinal es de importancia vital para una respuesta inmune. Solo algunos linfocitos B serán específicos para ese antígeno. El resto, la mayoría, saldrán del ganglio y seguirán en el flujo linfático, volcándose luego a la sangre hasta encontrar un antígeno específico o morir por un proceso apoptótico (véase cap. 26). El centro germinal se forma en los ganglios a partir de algunos linfocitos B y T específicos para un antígeno. 8 La activación lleva a la proliferación de ese linfocito B por mitosis, proceso denominado expansión clonal. A los pocos días, la proporción de linfocitos B que reconocen ese antígeno aumenta abruptamente. Algunos de esos linfocitos B migran a la médula ósea donde se diferencian en células plasmáticas y secretan anticuerpos del tipo IgM contra ese epitope. La IgM de membrana tiene 21 aminoácidos más que la secretada. Varios de estos aminoácidos son hidrofóbicos y se ubican en la membrana celular anclando la IgM a ésta. La IgM secretada es idéntica a la de membrana con la única diferencia de que no posee esos aminoácidos hidrofóbicos que la anclan a la membrana. Desde principios de siglo se conocía la existencia de anticuerpos sin especificidad aparente; eran los anticuerpos naturales, que se encuentran aún en animales de experimentación recién nacidos mantenidos en condiciones de asepsia. Esto se debe a que los reordenamientos cromosómicos son independientes del antígeno. Cada uno de estos clones preexistentes secreta pequeñas cantidades de anticuerpos que se detectan en todos los individuos sin necesidad de la presencia de antígenos. Si es posible producir anticuerpos contra cualquier sustancia presente en la naturaleza, por qué no se producen anticuerpos contra los antígenos propios? La ausencia de anticuerpos autorreactivos en individuos normales se debe a la eliminación de los clones reactivos contra moléculas propias durante el proceso de maduración de cada uno de ellos. A este mecanismo se lo denomina tolerancia central. Cuando este sistema falla, se producen autoanticuerpos, como ocurre en algunas enfermedades autoinmunes (véase cap. 44). 9 CAMBIO ISOTÍPICO Basados en datos experimentales, en 1965 W. J. Dreyer y J. C. Bennet propusieron que durante el desarrollo del linfocito B existe una recombinación entre los genes que codifican para una región variable y los que codifican para una

6 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 7 región constante. 10 El resultado sería la conformación de un nuevo gen que codificaría para una especificidad dada (por la región que codifica para la parte variable) y un isotipo dado (por la región que codifica para la parte constante del anticuerpo). Habría un grupo de genes que codifican para las partes variables y algunos pocos que codifican para las partes constantes (los isotipos de los anticuerpos). El mismo segmento variable se expresa con distintos isotipos a lo largo de una respuesta inmune. Primero se expresa con el isotipo IgM e IgD y, si el linfocito B es activado, prolifera y ese mismo Fv se expresa ahora con otro isotipo de anticuerpo (IgA, IgG o IgE). Este proceso de cambio de isotipo del anticuerpo en ese linfocito B específico contra el antígeno ocurre junto con el mecanismo que aumenta la afinidad por el antígeno en el centro germinal del ganglio linfático o en áreas específicas del bazo. UN GEN FUNCIONAL PARA ANTICUERPOS ES EL PRODUCTO DE RECOMBINACIÓN SOMÁTICA Básicamente, la hipótesis de Dreyer y Bennet demostró ser correcta. Sin embargo, el segmento V L no es codificado por un solo gen, sino por la unión de un gen (llamado V L ) que codifica para los primeros 95 codones del fragmento V L de la cadena variable liviana y un minigen (llamado J L ) que codifica para los últimos 11 codones de este fragmento. El segmento V H es codificado por la unión de un gen (denominado V H ) que codifica para los primeros 95 codones del fragmento V H de la cadena variable pesada, que se une con un minigen (denominado D) que codifica para unos 5-8 codones y un tercer minigen (denominado J H ) que codifica para los últimos 11 codones del fragmento V H. Por diversas razones históricas, la nomenclatura es un poco confusa,ya que al segmento proteico que constituye la parte variable de los anticuerpos se lo denomina V H y se halla constituido por unos 110 aminoácidos. Por otro lado, los genes que codifican para los primeros 95 aminoácidos de ese fragmento proteico se denominan también V H. En la figura 1-1 se observa que los genes V H codifican para las regiones armazón (framework) 1, 2 y 3 y los CDR 1 y 2 de los fragmentos variables. El CDR3 está constituido por los aminoácidos codificados por la unión de estos genes (V L más J L y V H más D más J H ). Por último, el armazón 4 está codificado por los genes J L y J H para la V L y la V H respectivamente. REORDENAMIENTO DE LOS GENES PARA LA CADENA LIVIANA El segmento variable de una cadena liviana kappa está conformado por 108 aminoácidos. En la línea germinal hay dos tipos de genes: los llamados V K que codifican para los aminoácidos 1 a 95 y los denominados J K que codifican para los aminoácidos 97 al 108. La cadena kappa constante codifica para los aminoácidos a partir del codón 109 hasta el carboxiterminal que corresponde al aminoácido 214 que es la cisteína involucrada en el puente disulfuro que une la cadena liviana con la cadena pesada. El nombre del gen J K proviene de joint (soldadura), pues se encuentra entre el gen V K y el C K. Esta recombinación V K -J K involucra un mecanismo que aumenta la diversidad de los anticuerpos, ya que genes V K diferentes se pueden empalmar con genes J K diferentes en forma combinada. La unión entre estos genes produce la región CDR3 de la cadena liviana, una de las seis zonas hipervariables del anticuerpo que está en contacto con el antígeno. Lo mismo ocurre con los genes para la cadena liviana lambda. En la figura 1-2 se describe un ejemplo del proceso de recombinación para la cadena liviana. Primero se combina alguno de los genes V K con alguno de los genes J K. En el ejemplo hipotético mostrado, el gen V K 2 se combina con el gen J K 4. Todo el DNA cromosómico que se encuentra entre el gen V K 2 y el J K 4 se pierde. El cromosoma del linfocito B que ha sufrido ese reordenamiento ha perdido todas las secuencias de genes V K 3 hasta J K 3. El RNA nuclear contendrá los genes J K que se encuentran localizados 3 con respecto a aquel que interviene en el reordenamiento más el gen constante y el intrón J K -C K. Como los anticuerpos son proteínas de secreción, cada gen V K tiene su correspondiente secuencia líder (L) que codifica para unos 19 aminoácidos. Esta secuencia y su correspondiente intrón se encuentran en el RNA nuclear. Por lo tanto, los linfocitos B (y también los linfocitos T) son las únicas células somáticas que sufren una pérdida de DNA. La conformación de los genes en el cromosoma antes del reordenamiento se conoce como línea germinal. Por consiguiente, los genes para anticuerpos se encuentran en la conformación de línea germinal en todas las células somáticas y germinales del organismo a excepción de los linfocitos maduros. Luego el RNA nuclear es procesado para producir el RNA mensajero maduro donde los cuatro exones (L-V K -J K - C K ) están unidos en el marco de lectura correcto para producir la cadena liviana. El péptido líder se elimina por acción de peptidasas al ingresar en el retículo endoplasmático. REORDENAMIENTO DE LA CADENA PESADA Las cadenas variables pesadas de los anticuerpos son el producto de la recombinación de tres genes: V H, D y J H (fig. 1-2). Al igual que los genes V K, los genes V H codifican para los primeros 95 aminoácidos de la cadena variable pesada, los minigenes J H para los últimos aminoácidos de la cadena variable. Los minigenes D (llamados así por-

7 8 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL DNA línea germinal para cadena pesada Genes V H Genes D Genes J H Gen Cμ L V H 1 L V H 2 L V H n-1 L V H n 1 2 n-1 n Reordenamiento D J H Reordenamiento V H DJ H RNA mensajero AAAA Cadena μ Anticuerpo Cadena kappa RNA mensajero AAAAA Cadena liviana reordenada DNA línea germinal para cadena kappa L V k 1 L V k 2 L V k n-1 L V k n Genes V K Genes J K Gen C K FIG Recombinación cromosómica de una cadena pesada y de una cadena liviana del locus inmunoglobulina durante el desarrollo de un linfocito B. En este ejemplo de reordenamiento cromosómico, los minigenes D2 y J H 3 para la cadena pesada se reordenan primero. Luego se produce el reordenamiento entre el gen V H 1 y el fragmento reordenado D 2 J H 3. Por lo tanto, todos los genes comprendidos entre el gen V H 1 y el minigen J H 3 son eliminados del cromosoma donde se produce el reordenamiento en ese prolinfocito B que está madurando en la médula ósea. El gen reordenado se transcribe a RNA mensajero, para luego traducirse en una cadena pesada IgM. El gen μ, que codifica para la cadena pesada de la IgM, se ilustra sin intrones para simplificación. Los demás genes constantes que se ubican 3 con respecto a Cμ no se muestran en la figura. En este ejemplo, el gen V K 2 se ha yuxtapuesto al gen J K 4, originando un nuevo gen V K 2J K 4C K. Todos los genes desde el gen V K 3 hasta el minigen J K 3 son eliminados del cromosoma. El gen reordenado se transcribe a RNA mensajero, para luego traducirse en una cadena kappa completa. La secuencia líder de cada gen variable se indica como L. que aumentan la diversidad) solo se encuentran en la cadena variable pesada y se ubican entre los V H y los J H. La zona de unión de estos tres genes corresponde a la zona que codifica para el CDR3 de la cadena variable pesada (véase fig. 1-1). Primero se produce la recombinación de un minigen D con un minigen J H. Luego se produce la recombinación entre uno de los genes V H y el segmento DJ H reordenado. Todos los genes y minigenes ubicados entre aquellos que sufren reordenamientos son eliminados del cromosoma. Por lo tanto, un linfocito B maduro tiene menor contenido de DNA que las otras células somáticas. La cadena variable pesada puede ser expresada con diferentes isotipos de anticuerpos. Como se explicó para los genes variables de cadena liviana, no todos los ge-

8 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 9 nes variables que se ubican en dirección 5 del gen variable reordenado son eliminados del cromosoma. MECANISMOS PARA LA RECOMBINACIÓN CROMOSÓMICA Cuando los genes V H, D, J H, V K, J K, V λ y J λ fueron secuenciados se encontró que aquellos que son funcionales tienen unas secuencias de 7 (CACAGTG) y 9 (ACAAAA- ACC) nucleótidos y sus complementarias. 11 Estas secuencias de nucleótidos son muy conservadas a lo largo de la evolución y están separadas por secuencias no conservadas de nucleótidos. Estas secuencias señal para la recombinación (RSS) se encuentran 3 con respecto a los genes V y 5 con respecto a los genes J. Los genes D tienen secuencias RSS a ambos lados, lo que les permite recombinarse primero con el minigen J H y luego con el gen V H. Las primeras proteínas relacionadas con este proceso que se descubrieron fueron las denominadas RAG-1 y RAG-2. Los ratones transgénicos cuyos genes RAG-1 o RAG -2 han sido eliminados no pueden producir linfocitos B ni T. Esto sugiere que ambas proteínas son necesarias para la recombinación y que el proceso de recombinación para los anticuerpos y los receptores antigénicos de células T (T cell receptor, TCR) usan el mismo mecanismo. 12 Se describió un síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (ausencia de linfocitos maduros) debido a mutaciones en alguno de estos genes en seres humanos. Los genes RAG-1 y RAG- 2 no son homólogos entre sí, no tienen intrones y se ubican muy cercanos en el genoma. Estas características son compatibles con su adquisición por recombinación con genes de otros organismos (algún virus o bacteria). Esto ocurrió con anterioridad a la expansión evolutiva de los vertebrados, ya que todos los organismos de esta clase tienen el mecanismo descripto de generación de la diversidad de los anticuerpos. Este evento les permitió a los vertebrados contar con un mecanismo capaz de identificar microorganismos patógenos con alto grado de especificidad. Las moléculas de reconocimiento del sistema inmune innato identifican patrones conservados presentes en las superficies de los patógenos (PRR, Pattern Recognition Receptors). La posibilidad de poseer moléculas como los anticuerpos que pueden reconocer a un patógeno (por medio del Fv) permite que se recluten (a través del Fc) funciones efectoras muy agresivas sobre ese patógeno. Sin duda, la adquisición de este mecanismo ha tenido un profundo efecto en la evolución de los vertebrados. OTROS MECANISMOS QUE AUMENTAN LA DIVERSIDAD La tecnología de los hibridomas, que permite producir anticuerpos de un solo tipo (anticuerpos monoclonales) hizo posible el estudio detallado de los procesos de generación de diversidad. El estudio de la secuencia de los genes livianos de varios de estos anticuerpos monoclonales muestra que existe una variabilidad inducida por la unión o soldadura de los genes V K y J K. La imprecisión en la unión, que lleva a que se cambie el aminoácido que debería codificarse en esta área del V L que corresponde al aminoácido 96 del CDR3, permite que los mismos genes codifiquen para distintas proteínas. Este mecanismo es utilizado también en las uniones V H -D y D-J H cuya unión codifica para el CDR3 del V H. A este mecanismo que ayuda a incrementar la diversidad de los anticuerpos se lo denomina variabilidad de unión o soldadura. Otro mecanismo que aumenta la diversidad de las cadenas variables se produce por la acción de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Esta enzima se expresa en el momento en que reordenan los genes variables pesados. Luego de la doble ruptura del DNA y antes de que el sistema de reparación de DNA ligue los extremos libres de los genes V H -D o D-J H, la enzima TdT agrega nucleótidos sin templado al extremo 3 del DNA de ambos genes. Si al final del proceso de unión V H -D-J H los nucleótidos agregados son múltiplos de tres, es decir no se modifica el marco de lectura, esa cadena variable queda con más codones de los codificados en sus tres genes. A este mecanismo se lo denomina adición de nucleótidos N. Como la adición se produce en ambas uniones, una adición de un número no múltiplo de tres entre los genes V H -D produce un cambio en el marco de lectura del gen D. Si la adición entre D-J H restablece el marco de lectura correcto, este gen variable es funcional. La lectura de los genes D en los tres marcos de lectura posibles le agrega variabilidad al sistema. Este mecanismo que involucra la lectura de los genes D en los tres marcos posibles de lectura solo ocurre en los seres humanos y en las gallinas. El resultado es que el CDR3 de la cadena pesada aumenta aún más la diversidad de los anticuerpos debido, primero, al agregado de aminoácidos que no están codificados en el genoma y segundo, a la traducción de los genes D en más de un marco de lectura. Los aminoácidos presentes en el CDR3 que están codificados por los genes D serán diferentes entre dos anticuerpos usando el mismo gen D, dependiendo a partir de qué nucleótido comience la lectura. Estos dos mecanismos le agregan mayor variabilidad al sistema. GENERACIÓN DE DIVERSIDAD: APROXIMACIÓN CUANTITATIVA Cerca del telómero del brazo largo del cromosoma 14 se encuentran los aproximadamente 107 a 114 genes V H extendidos en una región a lo largo de cerca de un millón de bases. 13 De ellos, 44 son considerados seudogenes debido a la presencia de codones de terminación o señales de recombinación (RSS) deficientes. De los restantes, 12 no han si-

9 10 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL do detectados nunca en reordenamientos cromosómicos aunque no parecerían ser seudogenes. Los genes D se agrupan en siete familias de genes. Las seis primeras familias se encuentran repetidas 23 veces en segmentos de 2,8 kb. La última familia representada por un solo gen denominado DHQ52 es la más proximal a los genes J H. Los genes J H están representados por 9 genes de los cuales 3 son seudogenes. A continuación de éstos se encuentran los genes para cadena pesada separados del J H proximal por unas 7 kb. Los genes V K se encuentran en el brazo corto del cromosoma 2 y están compuestos por 76 genes que se agrupan en siete familias (V K 1 a V K 7). Solo los genes para las familias V K 1 a V K 4 han sido detectados en reordenamientos que han dado una cadena liviana funcional. Del total de los genes pertenecientes a estas cuatro familias solo 27 han sido identificados en reordenamientos. Además, existen 5 J K que están a unos 23 kb 3 del V K más proximal. Los genes V λ se encuentran en una región de alrededor de de bases en el cromosoma 22 que contiene 36 posibles genes funcionales y 33 seudogenes distribuidos en diez familias. Los genes J λ son seis de los cuales al menos cuatro son funcionales. Sobre la base del mapeo genómico y la expresión de genes detectados pueden estimarse las posibles combinaciones algebraicas para la variabilidad de los anticuerpos. La diversidad de las cadenas livianas se estima multiplicando los genes V L funcionales expresados por el número de genes J por un factor 2 debido a la diversidad de la unión. Lo mismo puede hacerse con la cadena variable pesada multiplicando por un factor 4 (2 2) debido a la diversidad de la unión entre V H -D y D-J H. En la cadena variable pesada debe multiplicarse por el factor 2 debido a la variabilidad del marco de lectura de los genes D (uno de los tres marcos de lectura normalmente produce codones de terminación). El resultado es: 27 (V K ) 5 (J K ) 2 = (Vλ) 4 (Jλ) 2 = (V H ) 23 (D) 6 (J H ) 4 2 = Aceptando que todos los genes se expresan en igual proporción y toda cadena pesada puede asociarse con cualquier cadena liviana: ( ) > 2, son las combinaciones posibles. El signo mayor se debe a que en este cálculo no se toma en cuenta la variabilidad debido a los codones adicionados por la TdT. El estudio de la generación de diversidad de anticuerpos en otros animales permite inferir una respuesta a esta pregunta. Por ejemplo, las gallinas solo poseen alrededor de clones de linfocitos B, los suficientes para reconocer cualquier patógeno que surja durante su vida. Esto no significa que solo existan conformaciones espaciales posibles para epitopes. En realidad, el sistema de reconocimiento se basa en dos etapas. Primero se produce un reconocimiento por parte del BCR de un linfocito B. Este anticuerpo es una IgM de membrana. El proceso de sintonía fina que lleva a la alta especificidad (alta K a ) ocurre luego de la activación del linfocito B y consiste en la remodelación del Fv por medio de mutaciones puntuales del DNA que lo codifica. Estas mutaciones ocurren principalmente en la zona que codifica para los CDR, es decir en la zona que codifica para el paratope. Experimentos realizados con ratones quasi-monoclonales (genéticamente modificados para que expresen especificidad únicamente contra una pequeña sustancia química) demostraron que estos ratones luego de ser infectados con diversos virus, a través de reordenamientos secundarios e hipermutaciones en los genes de inmunoglobulinas, pueden generar suficiente diversidad de células B, al punto que les permite generar una respuesta de anticuerpos protectora contra el virus. Esto fue también demostrado en ratones, en los que se midió la respuesta al virus de la estomatitis vesicular por dilución límite de linfocitos B inyectados en animales congénitamente deficientes en linfocitos (ratones SCID). En esta serie de experimentos se demostró que entre 100 y linfocitos B eran suficientes para inducir una respuesta contra este virus. Estos experimentos demostraron la plasticidad de la molécula de anticuerpo para adaptarse, a través de mutaciones en las zonas que codifican para los CDR, al reconocimiento de diferentes epitopes, característica usada en la industria biotecnológica. La expresión de fracciones de anticuerpos (Fv o Fab) en bacterias puede ser ineficiente para ciertos genes V H o V L. Una alternativa consiste en partir de un clon de bacterias que produzca un Fv o Fab que se exprese con buen rendimiento. Luego se inducen mutaciones en estos genes y se seleccionan los que reconocen el antígeno deseado. En suma, estos experimentos y observaciones demuestran que en realidad no es necesaria tanta diversidad preexistente (repertorio primario de anticuerpos). Una cantidad de diferentes paratopes, en sendos BCR sobre los linfocitos B, en el orden de las decenas de miles, es suficiente para iniciar la respuesta que va a llevar a la generación de anticuerpos de mayor afinidad por el mecanismo de hipermutación somática. 14 ES NECESARIA LA GENERACIÓN DE TANTA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS? LA MADURACIÓN DE LA AFINIDAD ES EL PRODUCTO DE HIPERMUTACIONES SOMÁTICAS PUNTUALES Cuando un linfocito B se activa por contacto con el antígeno específico a través de su IgM de membrana, comienzan los procesos que llevan a su activación. Como resulta-

10 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 11 do tienen lugar dos procesos independientes entre sí pero simultáneos en el espacio y en el tiempo. Estos procesos son el cambio de isotipo y las hipermutaciones somáticas que llevan a la maduración de la afinidad. Si bien el mecanismo involucrado en el proceso de hipermutación somática no se conoce todavía, se han podido identificar secuencias que son puntos calientes (blanco para mutaciones). Por ejemplo, los codones AGC y AGT, que codifican para el aminoácido serina, se conservan a lo largo de la evolución de los vertebrados en los CDR de los genes variables de anticuerpos. Estos codones se encuentran altamente mutados luego de la maduración de la afinidad. No solo se han conservado estos codones en los CDR sino que, a la inversa, se han conservado puntos fríos, por fuera de ellos. Por ejemplo, el aminoácido serina también puede ser codificado por el codón TCN (donde N = A/T/C o G). Las serinas codificadas por este codón no son blanco para hipermutación. Durante la evolución de los vertebrados se han conservado las secuencias blanco para mutación (AGC/AGT) en el segmento de los genes que codifican para los CDR. ANTICUERPOS PRODUCIDOS POR TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE Los anticuerpos fueron descubiertos en 1890 por E. von Berhing y S. Kitasato. 15 Seis años después de su descubrimiento, ya eran comercializados como antisueros producidos en ovejas contra la toxina diftérica. A partir de allí se elaboraron antisueros contra diferentes toxinas, bacterias y otros patógenos. Sin embargo, la aparición de efectos secundarios, como la hipersensibilidad de tipo III, sumada al advenimiento de vacunas eficaces y, por último, al descubrimiento de los antibióticos, produjo una disminución de su uso. En los últimos años dos sucesos independientes despertaron un nuevo interés por el empleo de anticuerpos como productos preventivos o curativos. Por un lado, la creación de nuevas técnicas biotecnológicas, como los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales y por el otro, el perfeccionamiento de las técnicas de DNA recombinante. Estas tecnologías permiten la aplicación de lo que la Organización Mundial de la Salud (OMS) denomina terapias naturales. ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES Los anticuerpos inducidos en una respuesta inmune son policlonales. Cada epitope presente en una inmunización selecciona diferentes clones de linfocitos B a través del BCR específico. Por lo tanto, en un suero, habrá diferentes anticuerpos contra el mismo epitope. Además, como un antígeno posee múltiples epitopes, en un suero inmune habrá muchos tipos de anticuerpos capaces de interaccionar con ese antígeno. Por ejemplo, en el caso del virus Influenza, habrá diferentes anticuerpos que reaccionen con los diferentes epitopes presentes en la proteína hemaglutinina. A su vez, cada epitope de esta proteína reaccionará con diferentes anticuerpos que han sido secretados por diferentes clones de linfocitos. Los sueros policlonales se utilizan en inmunodiagnóstico e inmunoterapia. Un ejemplo de un suero policlonal es el suero antitetánico producido en el caballo. Como ya se dijo, este suero puede producir una hipersensibilidad de tipo III debido a la respuesta inmune del huésped contra las partes constantes de los anticuerpos. Una solución a este problema es la producción de sueros hiperinmunes a partir de dadores voluntarios con anticuerpos debido a la infección natural o a una vacunación. Estos anticuerpos de tipo IgG se utilizan normalmente por vía intravenosa contra enfermedades bacterianas (infección por C. tetanis o tétanos, H. influenza) y virales (sarampión, hepatitis A y B, citomegalovirus), etc. Los sueros policlonales se usan también para la producción de reactivos de diagnóstico aplicables a métodos de enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunotransferencia (Western blot), inmunofluorescencia, etc. En 1975, H. Kolher y C. Milstein crearon una técnica para producir anticuerpos monoclonales, es decir anticuerpos que no solo tienen una única especificidad (epitope específico), sino que la secuencia de aminoácidos de su Fv es la misma pues provienen de un solo clon de linfocitos B específicos para ese epitope. La técnica se basa en la unión de las características de dos células que se fusionan por métodos físicos. Por un lado, un linfocito B productor de anticuerpos con la especificidad deseada y por el otro, un mieloma no secretor que aporta a esa nueva célula la inmortalidad. Esta nueva célula producto de la fusión del linfocito B con el mieloma se conoce como hibridoma. De esta manera, luego de fusionar linfocitos B provenientes de un ratón inmunizado con el antígeno deseado, con el mieloma no secretor, se producen muchos hibridomas que pueden crecer indefinidamente in vitro. Todos los hibridomas provenientes de esa fusión se chequean para determinar a los que reconocen al antígeno específico. Estos últimos se separan y se dejan crecer (cada clon por separado). Como cada clon proviene de un solo linfocito, ese hibridoma producirá un anticuerpo con un Fv determinado y por lo tanto con una afinidad determinada hacia el antígeno. Además, el isotipo del anticuerpo será único (IgA, IgG1, etc.), según el cambio de isotipo que aquel linfocito expresaba en el momento de la fusión. Los anticuerpos monoclonales permiten estudiar las características del epitope que reconocen íntimamente, pues solo se unen con un epitope del antígeno. Los anticuerpos monoclonales también se usan para el diagnóstico. Los sueros policlonales son una mezcla de an-

11 12 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL ticuerpos, algunos específicos contra los distintos epitopes del antígeno, y otros contra otros antígenos a los que fuera expuesto el animal. Por consiguiente, el background (señal vs. ruido) suele ser alto. Los anticuerpos monoclonales, como son específicos para un epitope, suelen presentar menor background. Como contrapartida, si el antígeno presenta epitopes variables; por ejemplo una proteína de un virus que ha mutado como mecanismo de escape hacia el sistema inmune, el anticuerpo monoclonal puede no reconocerlo debido a su alta especificidad. Los hibridomas poseen otra ventaja adicional: como son el producto de un linfocito B donde ya se ha producido el reordenamiento cromosómico, son una fuente inagotable del DNA o el RNA mensajero de ese reordenamiento en particular. Esto permite rescatar ese reordenamiento que produce un anticuerpo de especificidad deseada usando técnicas de DNA recombinante (ingeniería genética). La producción de anticuerpos por métodos biotecnológicos se convierte en una alternativa nueva en la lucha contra las enfermedades. Como proponía E. von Berhing, hoy es posible producir anticuerpos sin la necesidad de animales, lo que elimina el problema de la contaminación por patógenos emergentes. USO DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA A partir de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal contra un epitope en particular, se pueden obtener suficientes cantidades del RNA mensajero que codifique para el Fv del anticuerpo. Esto se realiza por una transcripción inversa, una reacción por la cual el RNA se copia como DNA complementario (cdna). Ese cdna se puede amplificar en millones de copias iguales por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una vez que se obtiene suficiente cantidad de cdna, éste se puede introducir en un elemento replicativo de bacterias (plásmido) y de esa manera guardarlo y amplificarlo las veces que sea necesario. Si ese cdna que codifica para cadenas V H se inserta en un plásmido que reúne las condiciones necesarias para la expresión proteica del inserto, es posible producir las proteínas V H en grandes cantidades. Como los dominios V H de un anticuerpo no están unidos entre sí por un puente disulfuro (véase fig. 1-1), para asegurar su unión en el espacio es posible clonar ambos fragmentos como anticuerpos de cadena simple (scfv), juntando ambas cadenas (V H ) con un péptido espaciador entre ellas. Así, luego de expresados, los scfv adoptan en el espacio la forma natural y pueden reconocer por lo tanto al epitope original. En algunos casos ha sido posible producir hasta 2 g/litro por fermentación de estos fragmentos. Los scfv pueden acoplarse a radioisótopos o sustancias fluorescentes y utilizarse para detectar antígenos tumorales en técnicas de diagnóstico por imágenes. 16 Su uso tiene varias ventajas respecto del de los anticuerpos monoclonales completos. En primer lugar, el uso de anticuerpos monoclonales en este caso induce efectos colaterales debido a que los anticuerpos se unen a receptores para el Fc que existen sobre distintas células del organismo. En segundo lugar, los anticuerpos monoclonales son productos de células murinas (hibridomas) y podrían portar algún virus murino, mientras que los scfvs se producen en bacterias, eliminando de esta manera ese riesgo. En tercer lugar, la rápida biodistribución debido a su pequeño tamaño (alrededor de 25 kd comparado con un anticuerpos IgG de alrededor de 150 kd). Por último, su rápida eliminación: un scfv anti- TAG72, un antígeno encontrado en muchos carcinomas, tiene un T1/2α de 3,7 minutos y un T1/2β de 1,5 horas, mientras que la IgG original tiene T1/2 de 39 minutos y 113 horas respectivamente. El aumento de la vida media de los anticuerpos se relaciona con ciertos aminoácidos que se encuentran entre el CH2 y CH3. Estos aminoácidos están involucrados en la unión a la molécula FcRN (receptor para el Fc de recién nacidos). Este receptor se describió originalmente como el responsable de transferir IgG de la madre al recién nacido por transcitosis a través de la placenta. En ratones knock-out para FcRN, es decir, deficientes en esta molécula, el catabolismo para las IgG está muy incrementado. Probablemente, el FcRN protege a la IgG de la degradación en el endosoma (el sitio de catabolismo de proteínas intracelulares) y luego se disocia en el medio extracelular, permitiendo el reciclaje de las IgG. La ausencia de Fc y el pequeño tamaño de los scfv ayudan a la rápida eliminación de éstos del organismo, hecho que adquiere relevancia cuando se utilizan isótopos radiactivos como marcadores acoplados a los scfv. Además, los scfv no inducen una respuesta inmune del huésped como ocurre cuando se inyectan anticuerpos enteros, pues los Fc son más inmunogénicos que los Fv. Los scfv pueden usarse también como proyectiles mágicos cuando se acoplan con toxinas, citocinas, receptores celulares, agentes citostáticos, enzimas, etc. Un scfv específico contra un antígeno en particular, por ejemplo un tumor asociado con antígeno, puede obtenerse como una proteína de fusión con interleucina-2 (IL-2). Cuando esta construcción (scfv-il2) se administra in vivo, se dirige específicamente contra el sitio donde se encuentra el antígeno aumentando la concentración de IL-2 y la respuesta celular contra éste. Los scfv presentan la ventaja de su alta permeabilidad para alcanzar el tejido en tumores sólidos. ANTICUERPOS QUIMÉRICOS Y HUMANIZADOS El uso terapéutico de anticuerpos monoclonales generados en ratón presenta el problema de la inmunogenicidad del huésped. Una manera de solucionarlo es producir anti-

12 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 13 cuerpos quiméricos, que consisten en construcciones de DNA recombinante donde una región constante pesada y liviana (provenientes de la especie en la cual el anticuerpo va a ser administrado) se encuentra clonada a continuación de las regiones variables V H respectivamente, provenientes del hibridoma murino. Estas construcciones se expresan en células animales y el resultado es un anticuerpo que es en su mayoría humano, excepto la región que une al antígeno (el Fv). En 1997 se licenció en los Estados Unidos el Rituxan (rituximab, Genentech- Idec Pharmaceuticals) el primer anticuerpo para uso terapéutico en linfomas y leucemia linfocítica crónica en seres humanos. Éste es un anticuerpo quimérico (IgG1/κ) dirigido contra la molécula CD20, la cual se expresa en los linfocitos B y en mayor concentración, en los linfocitos B malignos. Sus extremos aminoterminal y carboxiterminal se encuentran en el citoplasma de la célula y solo 41 aminoácidos están por fuera de la membrana celular. Cuando un anticuerpo se une a ésta, no se produce la internalización rápida como ocurre con otras moléculas de membrana. Esto permite que el anticuerpo reclute las funciones efectoras a través del Fc. Si bien no está claro el mecanismo de eliminación de la célula in vivo, ha sido demostrada la acción del complemento y citotoxicidad dependiente de anticuerpos in vitro. Por ahora, la frecuencia de remisión completa usando rituximab es baja (8%) en los pacientes con enfermedad avanzada y no existe un estudio estadístico que indique el porcentaje de remisión completa cuando se lo utiliza en los primeros estadios de la enfermedad. Sin embargo, el uso de este anticuerpo combinado con quimioterapia es promisorio. Otro anticuerpo quimérico, Herceptin (trastuzumab, Genentech, EE.UU.) reconoce al antígeno Her2 (human epithelial growth factor receptor 2) que se expresa en altas cantidades sobre células de tumores mamarios. En los estudios clínicos, la administración de trastuzumab combinada con quimioterapia produjo un mayor índice de supervivencia en relación con el grupo de pacientes que solo recibieron quimioterapia. Otro anticuerpo quimérico licenciado recientemente denominado Simulect (basiliximab, Novartis, EE.UU.) reconoce al receptor para la cadena α de la IL-2. Este anticuerpo se utiliza en combinación con inmunosupresores para bloquear la activación de linfocitos T en los pacientes con trasplante de riñón. Solo un mínimo porcentaje de los pacientes produce anticuerpos contra el Fv de esta inmunoglobulina. Los anticuerpos quiméricos se utilizan en los pacientes inmunosuprimidos a causa de enfermedad o por efecto de agentes inmunosupresores. En las personas sanas el sistema inmune puede generar una respuesta contra el Fv del anticuerpo terapéutico. Una forma de disminuir este problema es humanizando al Fv. Diferentes disciplinas científicas han ayudado a desarrollar esta tecnología. Como se conoce la secuencia de aminoácidos del Fv específico (y en algunos casos se ha determinado la estructura mediante rayos X) es posible determinar qué V H humanos son más parecidos al Fv de ese anticuerpo de ratón. Manipulando el DNA de los genes V H de ambos anticuerpos (de ratón antígeno-específico y de ser humano con estructura similar en el espacio) es posible trasplantar los CDR del primero al segundo. De esta manera, solo la región que une al epitope proviene originalmente del ratón. Este anticuerpo humanizado no induce una respuesta inmune eficaz contra sí, pues es reconocido como propio por el sistema inmune del receptor. En 1998, fue aprobado en los Estados Unidos el anticuerpo humanizado Synagis (palivizumab, MedImmune, EE.UU.) contra un epitope neutralizante en la proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV). Se trata de un anticuerpo IgG1/κ en el que el 95% de la secuencia de aminoácidos proviene de seres humanos y el 5% de ratón y que fue usado en niños con riesgo de infección durante la temporada de infecciones por RSV. Su administración en forma mensual disminuyó un 55% la hospitalización de estos niños con alto riesgo con respecto al grupo control. 17 A la fecha, más de 60 anticuerpos obtenidos por ingeniería genética se encuentran en distintas fases de desarrollo. ANTICUERPOS EXPRESADOS SOBRE LA CUBIERTA DE BACTERIÓFAGOS Hasta hace pocos años, la única manera de obtener anticuerpos monoclonales (y los genes que los codifican) era por la técnica del hibridoma. Una importante limitación de esta técnica es que solo pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de ratón o de rata. La técnica se basa en la utilización del sistema inmune que produce los linfocitos B específicos y de alta afinidad contra el antígeno y permite luego seleccionar esos linfocitos B e inmortalizarlos. En los últimos años fue creada una nueva técnica que permite obtener Fv o Fab (y los genes que los codifican) sin necesidad de clonar los linfocitos B que los producen. Usando bacteriófagos (virus que infectan bacterias) filamentosos se ha podido analogar in vitro el proceso de desarrollo de los anticuerpos en linfocitos B, llevando a anticuerpos de mayor afinidad o con nuevas especificidades. 18 En la figura 1-3 se ilustra el proceso de selección de los bacteriófagos que portan sobre su cubierta fragmentos variables (Fv o Fab) de anticuerpos, proceso similar al de diferenciación de los linfocitos B. La tecnología consiste en inmunizar un ratón con el antígeno de elección y luego de que se ha generado una respuesta inmune eficaz, extraer RNA de las células del bazo de ese ratón. Por la técnica de RT-PCR se obtienen representantes de todos los V H que se están expresando en el bazo de ese ratón. Estos genes se clonan en un fásmido (plásmido que en determinadas ocasiones se comporta como un bacteriófago). Una vez obtenida la biblioteca de fásmidos provenientes de ese ratón, éstos se expresan como bacteriófagos. Cada bacteriófago es un clon que expresa un Fv de anticuerpo diferente sobre su

13 14 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL IgM IgD Antígeno IgM IgG Pro B B B B CP Genes V H sin reordenar Genes V H y V L reordenados Selección in vivo Mutaciones somáticas Secreción de anticuerpos Combinación de genes V H Fab o anticuerpo en superficie Selección por el antígeno Maduración de la afinidad Anticuerpo soluble Antígeno Clonado de genes V H reordenados Fab sobre la superficie del bacteriófago Selección in vitro Mutagénesis in vitro Secreción de Fab solubles FIG Comparación entre la maduración de un linfocito B y la selección in vitro en bacteriófagos Arriba: desarrollo y activación de un linfocito B. Abajo: comparación con la selección en bacteriófagos. La selección en bacteriófagos comienza con el clonado de los genes V H ya reordenados a partir de linfocitos de la especie deseada. La cadena V H (en azul) se expresa como proteína de fusión con una proteína de cubierta del bacteriófago (en negro). La cadena V L (en rojo) se une a la cadena V H antes de que ésta se libere de la bacteria donde se está replicando el bacteriófago. El Fv (V H + V L ) o el Fab (V H -C H 1 + V L -C L ) expresado sobre la cubierta es seleccionado por el antígeno deseado. La afinidad hacia el antígeno puede ser aumentada por mutación al azar o dirigida. Aquellos Fv o Fab con mayor afinidad son seleccionados. Los genes que los codifican son introducidos en bacterias en un plásmido. La bacteria es inducida a producir los fragmentos de anticuerpos Fv o Fab seleccionados in vitro. Adaptado de Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V- gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991; 222: cubierta. En una biblioteca de este tipo es posible tener unos bacteriófagos diferentes uno del otro en cuanto al Fv que portan. Esto es similar a lo que ocurre con los linfocitos B luego de su maduración en la médula ósea. Los bacteriófagos que expresan Fv tales que se unen al antígeno deseado son aislados de la biblioteca y crecidos por separado. Esto es similar a lo que ocurre al expandirse los clones de linfocitos B que se activan por la interacción con el antígeno durante el curso de una respuesta inmune. Una vez seleccionados, los genes para los Fv pueden ser clonados y utilizados para algunas de las aplicaciones ya detalladas. Este sistema presenta varias ventajas con respecto a la técnica del hibridoma. Por ejemplo, es posible utilizar el repertorio de Fv de anticuerpos que se producen al azar durante el desarrollo de los linfocitos B para encontrar Fv que interaccionan con antígenos contra los que no se pueden inmunizar animales. Así, utilizando esta estrategia fue posible obtener Fv que interactúan con el ion mercurio (Hg) a partir de un ratón no inmunizado. También es posible recrear el proceso de maduración de la afinidad hacia el antígeno que ocurre durante el desarrollo de una respuesta inmune. Una vez obtenido un Fv que interaccione con cierta afinidad con determinado antígeno, es posible amplificar ese gen en condiciones en que se produzca una alta frecuencia de mutaciones. Aquellos clones que sufran mutaciones que impliquen un aumento de afinidad pueden ser seleccionados cuando se enfrenta esta biblioteca con el an-

14 Generación de la diversidad de los anticuerpos y su uso diagnóstico y terapéutico 15 tígeno en condiciones más rigurosas (proceso realizado fisiológicamente por la célula folicular dendrítica en centros germinales de ganglios linfáticos). Mediante esta técnica pudo aumentarse casi diez veces la afinidad de un Fv contra el metal plomo (Pb). Esta técnica se puede refinar más, produciendo casettes donde solo se mutan los CDR y encontrar así solo las mutaciones que van a estar involucradas en un aumento de la afinidad por el antígeno. Utilizando esta tecnología fue posible obtener anticuerpos humanos de alta afinidad, partiendo de sangre periférica de individuos inmunizados contra diversos virus. Estos Fv pueden ser ahora clonados junto con los genes para las cadenas constantes, produciendo anticuerpos 100% humanos. Los anticuerpos monoclonales se han constituido en una herramienta diagnóstica y terapéutica muy importante. Sin embargo, tienen una limitación dada por la imposibilidad de producir hibridomas a partir de linfocitos B humanos que sean estables en cultivo. Esto se debe a que los mielomas usados para la fusión son de ratón. Una posibilidad de solucionar esta limitación es la producción de anticuerpos humanos en ratones transgénicos. 19 Estos ratones provienen de una línea de knock-out para el locus inmunoglobulina del ratón y no sintetizan anticuerpos. A partir de este punto se ha producido una línea de ratones transgénicos para anticuerpos humanos por adición de algunos genes para cadenas V H, un grupo de genes D, los genes J H y los genes para la cadena pesada mu (μ) y gamma (γ) de seres humanos. Luego se generó una línea de ratones que producen cadena liviana de anticuerpos humanos. El cruzamiento de ambas líneas de ratones produjo un ratón transgénico que produce anticuerpos 100% humanos. Estos ratones transgénicos reordenan los genes humanos como propios. Más aún, los linfocitos B de estos ratones hacen el cambio de isotipo de IgM a IgG, lo cual implica que los mecanismos de recombinación se hallan extremadamente conservados entre especies. Estas herramientas serán útiles en el futuro para la producción de anticuerpos monoclonales humanos para distintos patógenos, incluso contra antígenos propios que podrían ser de utilidad para inmunoterapia, como son las moléculas CD20 y CD25 (cadena α del receptor de IL- 2). El costo y el tiempo de producción van a decrecer debido a que probablemente no será necesario hacer anticuerpos quiméricos o humanizados. Estos anticuerpos obtenidos a partir de una fusión de células B y un mieloma de ratón estarán produciendo anticuerpos 100% humanos. Por ejemplo, en esta línea de ratones se han producido con éxito anticuerpos monoclonales contra la molécula CD4 humana, el receptor para el HIV humano. DIRECCIONES FUTURAS La investigación futura de los mecanismos de generación de diversidad de anticuerpos permitirá comprender con mayor profundidad los fenómenos evolutivos de reconocimiento antigénico. Este campo ha revelado descubrimientos recientes muy excitantes que asocian fenómenos de generación de diversidad como hipermutación somática, cambio o switch de isotipo, recombinación V(D)J y conversión génica. 20,21 El descubrimiento de una enzima de edición del RNA, denominada AID (citidina desaminasa inducida por activación, activation-induced cytidine deaminase), ha permitido asociar estos mecanismos de reordenamiento, considerados hasta hace poco fenómenos dinámicos individuales. A su vez, y paralelamente, los avances actuales en la tecnología de anticuerpos permitirán en un futuro cercano crear nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas para situaciones como el cáncer, el trasplante de órganos, las infecciones, las alergias y los trastornos de naturaleza autoinmune. 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15 16 AVANCES DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL 16. Huston JS, Mc Cartney J, Tai MS, Mottola-Hartshorn C, Jim D, Warren F, Heck P, Oppermann H. Medical applications of single-chain antibodies. Int Rev Immunol 1993; 10: Subramanian KN, Weisman LE, Rhodes T, Ariagno R, Sanchez PJ, Steichen J, Givner Jennings TL, Top FH, Carlin D, Connor E. Related articles safety, tolerance and pharmacokinetics of a humanized monoclonal antibody to respiratory syncytial virus in premature infants and infants with bronchopulmonary dysplasia. MEDI-493 Study Group Pediatr Infect Dis J 1998; 17: Barbas CF, Burton DR. Selection and evolution of high-affinity human anti-viral antibodies. Trends Biotechnol 1996;14: Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994; 368: Papavasiliou FN, Schatz DG. Somatic hypermutation of immunoglobulin genes: merging mechanisms for genetic diversity. Cell 2002; 109:S Bassing CH, Swat W, Alt FW. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell 2002; 109:S45. SITIOS EN INTERNET RELACIONADOS Aquí se encuentran publicadas la totalidad de las secuencias de anticuerpos que fueron enviadas al GenBank. Esta base de datos fue iniciada en 1970 por el recientemente desaparecido especialista en anticuerpos E. Kabat. Se la denomina Kabat database en su honor. Esta base de datos denominada V-BASE ofrece todas las secuencias publicadas de anticuerpos humanos. Un sitio para buscar secuencias y estructuras de anticuerpos. Este sitio ofrece conexiones con otros sitios relacionados con anticuerpos. En este sitio se explica cómo se producen anticuerpos por tecnología de DNA recombinante.