Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. Contacto:

Transcripción

1 Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presión atmosférica Butler, Matías Tesis Doctoral Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

2 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Orgánica Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presión atmosférica Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Orgánica Matías Butler Director de tesis: Gabriela M. Cabrera Director Asistente: Pau Arroyo Mañez Consejero de Estudios: Gabriela M. Cabrera Buenos Aires, 23

3 Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presión atmosférica Resumen: Se realizaron estudios para diferenciar isómeros de posición en compuestos aromáticos, empleando un espectrómetro de masa híbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo acoplado con distintas fuentes de ionización a presión atmosférica, en modo positivo. Se utilizaron inicialmente dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina comerciales, que sirvieron luego como sistema modelo para el análisis de una serie de - y 4- N-óxidos de pirazinas monosustituídas sintetizados. Se investigaron dos metodologías para la diferenciación. La primera metodología consideró el comportamiento disociativo, comparando la relación de intensidades entre los iones observados en los espectros de iones producto de cada isómero a diferentes energías de colisión. En la otra metodología, la formación de iones aducto a partir del empleo de soluciones de cationes metálicos por electrospray, permitió identificar especies características en los espectros de masa obtenidos para cada N-óxido isómero. Los alcances de esta metodología fueron evaluados con isómeros de dihidroxiarenos comerciales, siendo aplicable como método de detección postcolumna para una mezcla de los mismos separada por cromatografía líquida. La complementación con cálculos computacionales permitió interpretar y analizar las diferencias observadas en los espectros de masa, en términos energéticos y estructurales de los iones. Además, se pudo confirmar la correcta asignación de las estructuras calculadas para los iones aducto de uno de los compuestos estudiados por medio de espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja. Se desarrolló una metodología alternativa para determinar la posición del grupo N-óxido en pirazinas sustituídas, empleando espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-3, a través del cálculo de un índice derivado del análisis quimiométrico de los datos. Palabras clave: diferenciación de isómeros; espectrometría de masa; ionización por electrospray; disociación de iones; complejación con metales; elucidación estructural; cálculos computacionales; N-óxidos de hidroxipiridina; N-óxidos de pirazina; dihidroxiarenos.

4 Development of methodologies for the differentiation of isomeric aromatic compounds by mass spectrometry employing atmospheric pressure ionization techniques Abstract: Differentiation studies among positional isomers in aromatic compounds were carried out with a hybrid quadrupole/time-of-flight mass spectrometer coupled with different atmospheric pressure ionization sources in positive ion mode. Firstly, two commercial isomeric hydroxypyridine N-oxides were used, which were useful later as a model system for the analysis of a set of monosubstituted pyrazine - and 4- N-oxides synthesized. Two methodologies for the differentiation were investigated. The first methodology considered the dissociative behavior, by comparing the ratio of intensities between the ions observed in the product ion spectra of each isomer at different collision energies. In the other methodology, upon adduct ions formation from metallic cations solutions by electrospray, the identification of characteristic species in the mass spectra obtained for each isomeric N-oxide was possible. The scope of this methodology was assessed using commercial isomers of dihydroxyarenes, being applicable as a postcolumn detection method to a mixture of them separated by liquid chromatography. Complementary computational calculations made possible the interpretation and analysis of the differences observed in the mass spectra in terms of the energetics and structures of ions. In addition, the correct assignment of the calculated structures of the ion adducts of one of the studied compounds could be confirmed by means of infrared multiphoton dissociation spectroscopy. An alternative methodology was developed to determine the position of the N-oxide moiety in substituted pyrazines, employing carbon-3 nuclear magnetic resonance spectroscopy, through the computation of an index derived from the chemometric analysis of the data. Keywords: isomer differentiation; mass spectrometry; electrospray ionization; ion dissociation; metal complexation; structure elucidation; computational calculations; hydroxypyridine N-oxides; pyrazine N-oxides; dihydroxyarenes.

5 A mi familia,

6 Agradezco a Gaby su confianza, apoyo, consejos y enseñanzas.

7 Quiero agradecer también a todos los que hicieron posible la realización de este trabajo, en particular: Al Dr. Pau Arroyo Mañez, por aceptar el compromiso y orientarme en el área de la química computacional. A UMyMFOR por facilitarme la utilización de los equipos y a todo su personal, en especial al Sr. Jorge Aznárez y al Bioq. Gabriel Cases por su buena predisposición y colaboración permanente, y a los Lic. Gernot Eskuche y Lic. José Gallardo por la realización de los espectros de RMN. Al Dr. Philippe Maître, de Laboratoire de Chimie Physique de la Université Paris Sud, por recibirme en su laboratorio cordialmente, dándome la oportunidad de realizar los experimentos de espectroscopía IRMPD, y por su generosidad. Al MSc. Oscar Hernández y Sr. Vincent Steinmetz, de Laboratoire de Chimie Physique de la Université Paris Sud, y al Dr. George Khairallah, de University of Melbourne, por compartir su experiencia y su ayuda durante mi estadía. Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por otorgarme una beca para realizar este trabajo. A la Universidad de Buenos Aires por otorgarme la posibilidad de asistir a un congreso internacional con los fondos UBA destinados a viajes para congresos. Al CONICET, UBA y Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) por el financiamiento brindado que hizo posible llevar a cabo este trabajo. A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales por la formación brindada. Al Departamento de Química Orgánica por aportarme un ambiente cómodo de trabajo, donde pude crecer en mi desempeño docente y en la investigación. Al Dr. Jorge Palermo por su experiencia y aportes en la realización de espectros RMN, y por sus valiosos puntos de vista en este área. Al Dr. Gerardo Burton por su asesoramiento en el campo del modelado molecular. Al Lic. Cristián Huck Iriart por su donación de una muestra de Ga 2 O 3. A la Sra. María del Carmen Ares y Sra. Nancy Aguirre, por hacerme más fácil y ayudarme en todos los trámites administrativos, siempre con simpatía y amabilidad. Al Sr. Sergio E. Jacobo y Sr. Hernán Salcedo y demás personal no docente del departamento por estar siempre bien dispuestos a prestar su colaboración con buena onda.

8 A la Dra. María Florencia Rodriguez Brasco por introducirme al mundo de la investigación y presentarme mi grupo de trabajo, prestándome siempre su ayuda desinteresada. A mis actuales compañeros de equipo, Dra. Adriana Cirigliano, Dr. Gastón Siless y Lic. Andrés Brunetti por acompañarme con sus canciones, discusiones, historias, experiencias, aportando buenos momentos diarios. A mis ex compañeras de equipo, Dra. Gabriela Gallardo y Dra. Brenda Bertinetti, por haberme prestado asistencia en mis inicios y continuar luego colaborando e intercambiando ideas, sin importar las distancias. A la Dra. Marta Maier y todo su grupo de trabajo, en especial, Dra. Valeria Careaga Quiroga, Dra. Alejandra Fazio, Lic. Victoria Richmond, Lic. Irene Lantos, Lic. Blanca Gómez y Srta. Ivana Canosa por soportar mi selección de estaciones de radio, compartir almuerzos y meriendas y contagiarme su buena onda. Al Dr. Jorge Palermo y su grupo de trabajo, en particular, Dra. Marianela Sánchez, Lic. Lucía Fernández, MSc. Laura Patiño y Dra. Aurèlie Leverrier por las visitas e intercambios cotidianos y por su buena voluntad para colaborar frente a la diversidad. Al Dr. Javier Ramirez y su grupo de trabajo, en especial, Lic. Lorena Acebedo, Lic. Fernando Alonso y Lic. María Eugenia Dávola, así como al Lic. Javier Eiras, por su cooperación para la realización de actividades y tareas varias, dentro y fuera del Departamento, siempre dando una mano con buena predisposición. A todas las personas que tuve la suerte de conocer dentro (y también fuera) del Departamento, en especial a Ale, Andrés, Aure, Blan, Fer, Ire, Javi, Lu, Luchi,Mario, Maru, Pau, Romi, Vicky y Vir por acompañarme en tantos momentos disfrutados. A Marian y Pipi por su calidez y su paciencia con mis preguntas. A Bren, Vale y Vicky por bancarme, por su alegría y por más también. A Marie por tener presentes y recordarme las cosas que se me pasan. A Pil por compartir una mirada diferente y por su generosidad infinita. A Andi, Cris, Dani, Ithu, Sil, Vani, Vero y Tam por las experiencias compartidas y por marcar momentos en cada encuentro. A mis abuelos, mis padres y mis hermanos que siempre me apoyan, me siguen dando lo mejor todos los días y los quiero.

9 Qué hacés? ; Cómo andás? Quién es? ; Cuándo nos vemos? Dónde está? ; Cuánto tarda? Para qué lo querés? ; Por qué no? Hay respuestas obvias y preguntas sin respuesta? Si las preguntas perduran, las respuestas pueden cambiar.

10 Lista de abreviaturas comúnmente utilizadas* APCI API APPI BIRD CAD CE CI CID CIS Cy δ DFT DMSO ECD EI ESI FEL f K - FM FT FT-ICR FWHM GC-MS HOMO HPLC Ionización química a presión atmosférica (atmospheric pressure chemical ionization) Ionización a presión atmosférica (atmospheric pressure ionization) Fotoionización a presión atmosférica (atmospheric pressure photoionization) Disociación por radiación infrarroja de cuerpo negro (blackbody infrared radiative dissociation) Disociación por activación colisional (collisionally activated dissociation) Energía de colisión (collision energy) Ionización química (chemical ionization) Disociación inducida por colisión (collision- induced dissociation) Coordinación por ionspray (ionspray coordination) Ciclohexano Desplazamiento químico Teoría del funcional de la densidad (density functional theory) Dimetilsulfóxido Disociación por captura de electrones (electron capture dissociation) Ionización por electrones (electron ionization) Ionización por electrospray (electrospray ionization) Láser de electrones libres (free electron laser) Función electrofílica de Fukui Fórmula molecular Transformada de Fourier (Fourier transform) Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (Fourier transformion cyclotron resonance) Ancho a media altura (full width at half maximum) Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa Orbital molecular ocupado más alto (highest occupied molecular orbital) Cromatografía líquida de alta eficiencia (high performance liquid chromatography) i

11 HR IMS IR IRC IRMPD J LC-MS LUMO m/z MALDI MPA MS MS/MS MS n NC NPA OPA OPO PCA Pf PFP ppm Q q QIT QqQ QqTOF RF alta resolución (high resolution) Espectrometría de Movilidad Iónica (ion mobility spectrometry) Infrarrojo Coordenada de reacción intrínseca (intrinsic reaction coordinate) Disociación multifotónica infrarroja (infrared multi-photon dissociation) Constante de acoplamiento Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masa Orbital molecular desocupado más bajo (lowest unoccupied molecular orbital) Relación masa/carga Desorción/ionización por láser asistida por matriz (matrix assisted laser desorption/ ionization) Análisis de poblaciones de Mulliken (Mulliken population analysis) Espectrometría de Masa Espectrometría de Masa Tándem Espectrometría de Masa Tándem en múltiples etapas (secuencial en el tiempo) Número de coordinación Análisis de poblaciones naturales (natural population analysis) Amplificador paramétrico óptico Oscilador paramétrico óptico Análisis de componentes principales (principal component analysis) Punto de fusión Pentafluorofenilo Parte por millón Cuadrupolo Cuadrupolo de colisión en instrumentos híbridos Trampa iónica cuadrupolar (quadrupole ion trap) Triple cuadrupolo Cuadrupolo/ tiempo de vuelo Radiofrecuencia ii

12 RMN SEP SID SY TIC TMAOH TMS TOF TOF/TOF T R UV ZPE Resonancia Magnética Nuclear Superficie de energía potencial Disociación inducida por superficie (surface- induced dissociation) Proporción subsistente (survival yield) Corriente total de iones (total ion current) Hidróxido de tetrametilamonio Tetrametilsilano Tiempo de vuelo (time of flight) Instrumento tiempo de vuelo/ tiempo de vuelo Tiempo de retención Ultravioleta Energía de punto cero (zero-point energy) * La nomenclatura utilizada para espectrometría de masa es la recomendada por IUPAC. Se utilizaron las abreviaturas en inglés ya que son las corrientemente usadas y la mayoría de los términos no posee traducción al español aún. iii

13 iv

14 Indice Capítulo. Introducción. Preliminar.2 Métodos de ionización.2. Técnicas de ionización suave y fuerte Ionización por electrones (EI) Ionización química (CI) Técnicas de ionización a presión atmosférica (API) Ionización por electrospray (ESI) Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica 7.3 Aspectos generales en relación a la generación de los iones.3. Carga de los iones Formación de iones aducto 8.4 Analizadores de masa 9.4. Cuadrupolo (Q) y trampa iónica cuadrupolar (QIT) Tiempo de vuelo (TOF).4.3 Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR).5 Aspectos generales en relación a la disociación de los iones.5. Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS) Métodos de disociación de iones Naturaleza de los iones producto de disociación 5.6 Diferenciación de isómeros por MS 6.6. Espectrometría de movilidad iónica (IMS) Espectroscopía IRMPD 8.7 Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa 9.8 Objetivos 2 v

15 Capítulo 2. Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina 2. Introducción Comportamiento frente a la disociación 2.2. Efecto de las fuentes de ionización Efecto de la temperatura Efecto del intercambio H/D Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional 2.3. Sitios de protonación Energía de los iones Caminos de disociación Complejación con metales Metales trivalentes Metales divalentes (y escandio) Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional Estructuras de los complejos neutros Sitios de protonación de los complejos Estabilidad de los complejos ionizados Conclusiones 69 Capítulo 3. Diferenciación de N-óxidos de pirazina 3. Introducción Síntesis de los compuestos Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID Análisis de la formación de complejos con metales Calcio Cobre Aluminio Análisis por Espectroscopía RMN 32 vi

16 3.5. Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D Análisis quimiométrico de los datos de RMN 3 C Conclusiones 5 Capítulo 4. Diferenciación de dihidroxiarenos 4. Introducción Complejación con metales por ESI-MS 4.2. Estudio preliminar Estudio de la complejación con calcio de Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa Estudio preliminar del catecol libre Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados Estructuras de los clusters de calcio(ii) con catecol microhidratados Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS Conclusiones 22 Capítulo 5. Detalles experimentales 5. Espectrometría de Masa 5.. Equipamiento y metodología Preparación de las muestras Material suplementario de MS Espectroscopía RMN Otras técnicas empleadas para la caracterización de los compuestos Métodos cromatográficos Tratamiento de los datos para PCA 22 vii

17 5.6 Síntesis de los compuestos Métodos computacionales Optimización de geometrías Cálculo de las funciones de Fukui Caracterización de las estructuras calculadas 246 Conclusiones generales y perspectivas 255 Apéndice Funciones de Fukui Contaminación de Spin Parámetros relacionados con las energías de disociación 26 4 Análisis de Componentes principales (PCA) 26 5 Espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) 262 Anexos Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados Modos vibracionales calculados para el benceno identificados usando la notación de Wilson 266 Bibliografía 267 viii

18 Introducción Capítulo.. Preliminar La Espectrometría de Masa (MS) es una técnica analítica usada para la investigación de moléculas y mezclas complejas que ha tenido un crecimiento vertiginoso en los últimos años en cuanto al desarrollo de nuevos y mejores instrumentos, lo que ha traído como consecuencia un aumento considerable de su uso en todas las ramas de la química. El análisis por esta técnica de cualquier sustancia brinda información única ya que permite, con gran rapidez y óptima sensibilidad, identificar, cuantificar, aportar datos estructurales e isotópicos. La Química tiene sus orígenes como una ciencia cuantitativa en el pesado cuidadoso de productos y reactivos, que realizaban Lavoisier y sus seguidores, comenzado hace más de 2 años. Desde entonces, el siempre cambiante balance gravimétrico ha sido un servidor fiel del químico de laboratorio, jugando un rol importante en el desarrollo de los métodos analíticos sobre los que se fundamenta la ciencia química contemporánea. Tal vez, la última etapa en la evolución de ese balance esté representada por el espectrómetro de masa moderno. Éste es capaz de determinar con alta precisión las masas de átomos individuales y moléculas transformados previamente en iones, mediante la respuesta de sus trayectorias a varias combinaciones de campos eléctricos y magnéticos. Claramente, el sine qua non de dicha determinación de masa es la transformación de los átomos y moléculas de analito desde su estado inicial en la muestra a iones in vacuo listos para ser analizados. La Figura. muestra un dibujo esquemático de un espectrómetro de masa. La muestra es introducida por la entrada del equipo hacia la fuente de ionización. La fuente genera iones en fase gaseosa a partir de la muestra. Los métodos de ionización empleados se describirán en la sección.2. Los iones generados son transferidos al analizador de masas, responsable de su separación de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) mediante la interacción con campos eléctricos y/o magnéticos. Algunos de los analizadores más relevantes para el trabajo se describirán en la sección.4. Por último, el detector registra la intensidad relacionada con la cantidad

19 Capítulo Introducción de iones que llegan de una dada m/z. Una computadora controla los distintos componentes electrónicamente, almacenando y permitiendo manipular los datos para reconstruir el espectro de masa. Todos los espectrómetros cuentan además con un sistema de vacío que mantiene una baja presión (alto vacío) haciendo más eficiente la manipulación de los iones e impidiendo que se pierdan por colisiones entre sí. Sistema de Datos Entrada de Fuente de Analizador Detector muestra Ionización de masas Atmósfera/ vacío Alto vacío Figura.. Esquema de un Espectrómetro de Masa Para una correcta interpretación y entendimiento de los espectros de masa es necesario conocer las características, comportamiento y posibles mecanismos de formación de los iones en fase gaseosa, y es este conocimiento el que permite aplicar los resultados a iones similares más complejos. Ciertos aspectos relacionados con la generación de los iones se mencionarán en la sección.3. Además, es necesario asignar los iones inequívocamente por medio de EM de alta resolución y exactitud, teniendo en cuenta los perfiles isotópicos y los patrones de fragmentación que aportan información estructural adicional, como se discute en la sección Métodos de ionización.2.. Técnicas de ionización suave y fuerte De manera general, los métodos de ionización pueden separarse en dos grupos: de ionización suave y fuerte. En las técnicas de ionización fuerte, los iones generados poseen un gran contenido de energía interna residual, tendiendo a la disociación de enlaces químicos y por ende, a la obtención de un gran número de iones fragmento en 2

20 Introducción Capítulo los espectros de masa. Esto resulta de utilidad desde el punto de vista de la elucidación estructural al encontrarse iones fragmento diagnóstico de la estructura del ion precursor. En contraparte, los iones precursores intactos, o sea, aquellos que no se fragmentaron, son generalmente poco intensos lo que dificulta la determinación de la masa y la fórmula moleculares. El método de ionización fuerte más común es la ionización por electrones (EI) 2 que se describe en la sección.2.2. Por el contrario, en las técnicas de ionización suave, sólo una pequeña parte de energía interna residual es retenida en los iones. Así, los espectros de masa obtenidos exhiben pocos iones fragmento, preservándose la molécula mayormente intacta dando iones precursores relativamente intensos. A pesar de que esto facilita la determinación de la masa molecular, en virtud del número reducido de iones fragmento formado, se obtiene poca información estructural. Entre los métodos de ionización suave se encuentran la ionización química (CI), la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) 3, por nombrar algunos. A continuación se describirán aquellos métodos de ionización relacionados con el presente trabajo Ionización por electrones (EI) La ionización por electrones (EI) a 7 ev es el método de ionización más antiguo para análisis de rutina de moléculas pequeñas, hidrofóbicas y termoestables. La fuente de ionización consiste en una pequeña cámara (alrededor de cm 3 de volumen) aislada en alto vacío, donde la muestra ingresa vaporizada por calentamiento y se ioniza por interacción con un haz de electrones acelerado. Como resultado de esta interacción con electrones a 7 ev, se produce la eyección de un electrón a partir de la molécula neutra en fase gaseosa, dando lugar a un catión radical, es decir, con un número impar de electrones. Como este ión radical posee un gran exceso de energía interna, se escinde dando lugar a numerosos caminos de fragmentación 29. Debido a la energía de ionización constante empleada, los espectros de masa obtenidos por esta técnica resultan reproducibles y ricos en fragmentos (técnica de ionización fuerte), lo que permite utilizarlos fácilmente para búsquedas en bibliotecas de espectros de masa. Una gran desventaja de los espectros de masa obtenidos bajo 3

21 Capítulo Introducción condiciones EI es la ausencia o baja abundancia del ión molecular, es decir, el ión formado por remoción de un electrón de la molécula Ionización química (CI) La ionización química 2 (CI) se aplica a muestras con características similares a EI, siendo también similar la fuente de ionización, excepto por la presión en la cámara de ionización que es mucho mayor (típicamente.- torr versus -5 torr en EI) por la presencia de un gas reactivo (por ejemplo, metano o amoníaco) que se ioniza parcialmente por interacción con el haz de electrones. Así, las moléculas de la muestra se ionizan a partir de reacciones ión-molécula que ocurren en fase gaseosa con estos iones presentes. Siendo una técnica de ionización suave, en general permite obtener iones correspondientes a la molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado, positivo o negativo, respectivamente. Tanto CI como EI son métodos de ionización comúnmente usados en equipos de Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa (GC-MS) ya que requieren que las moléculas de interés estén en estado gaseoso Técnicas de ionización a presión atmosférica (API) La Espectrometría de Masa utilizando ionización a presión atmosférica (API-MS) abarca un conjunto de técnicas útiles para el análisis de muestras bajo condiciones abiertas al ambiente, a diferencia de las técnicas antes mencionadas donde la muestra se coloca en una cámara con vacío. A continuación se discutirán las más representativas, a saber, ionización por electrospray (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI) y fotoionización a presión atmosférica (APPI). Las técnicas API-MS 4 pueden combinarse con equipos de Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masa (LC-MS) para obtener condiciones de ionización suaves que permiten acceder a la masa molecular de moléculas intactas a partir de mezclas complejas. En la Figura.2 se observan las diferentes clases de moléculas cubiertas por los diferentes métodos de ionización previamente mencionados. 4

22 Introducción Capítulo Mr LC/MS (ESI) proteínas, GC/MS (EI, CI) LC/MS (APCI) esteroides, ácidos grasos, aceites esenciales, derivados alquilsililados, hidrocarburos drogas, aminoácidos, péptidos, Iones metálicos BAJA POLARIDAD ALTA POLARIDAD Figura.2. Diferentes clases de moléculas cubiertas por las diferentes técnicas de ionización mencionadas (adaptado de Ref. 5) Ionización por electrospray (ESI) La ionización por electrospray 6 (ESI) es usada para ionizar directamente los analitos solubles en muestras líquidas, siendo efectiva para analizar tanto grandes biomoléculas intactas 7 como moléculas orgánicas pequeñas 8. Para producir las moléculas ionizadas en fase gaseosa desde la solución líquida, se requiere un capilar que conduce un pequeño flujo de un solvente polar, creándose un fino spray de gotas que resultan altamente cargadas en presencia de un campo eléctrico generado por un voltaje de 2-5 kv (Ver Figura.3a). Se han propuesto dos modelos para dar cuenta de la formación de iones en fase gaseosa desde las pequeñas gotas altamente cargadas 9. El primer modelo asume que la carga en la molécula se origina a partir de las cargas en la superficie de la gota, que quedan en el ion del analito en fase gaseosa al evaporarse el solvente de la misma. Este modelo se conoce como el modelo de residuos cargados y fue propuesto para analitos de alta masa molecular. El otro modelo sugiere que los iones se desorben desde las gotas luego que estas se encogen hasta un valor crítico. Este proceso de escape de iones fue conocido como modelo de evaporación de iones y fue propuesto a partir del estudio de analitos iónicos pequeños. Mientras que este modelo está bien fundamentado para pequeños iones orgánicos o inorgánicos, no es aplicable a 5

23 Capítulo Introducción grandes iones como macromoléculas, para las que el primer modelo resulta más plausible. a) V Vacío Muestra Líquida Gas nebulizador Iones MS Gas de secado b) Corona Vacío Calor Muestra Líquida Iones MS Gas nebulizador Calor Gas de secado c) Vacío Calor Muestra Líquida h Iones MS Gas nebulizador Calor Gas de secado Figura.3. Diagramas esquemáticos de diferentes interfaces API: fuentes de ionización por a) electrospray (ESI); b) ionización química a presión atmosférica (APCI); c) fotoionización a presión atmosférica (APPI). 6

24 Introducción Capítulo.2.6. Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica La ionización química a presión atmosférica (APCI) y la fotoionización a presión atmosférica,2 (APPI) son técnicas de ionización a presión atmosférica capaces de analizar compuestos relativamente poco polares. De manera similar a ESI, los iones se generan directamente desde una solución en ambas técnicas, sin embargo, el proceso de ionización ocurre en fase gaseosa y no en la fase líquida. Las gotas no se encuentran cargadas, sino que se vaporizan pasando a través de un nebulizador calentado a presión atmosférica (Figura.3b y.3c). En el caso de APCI, la ionización ocurre por reacciones ión-molécula con especies reactivas (por ejemplo, electrones, protones, átomos o moléculas metaestables, iones hidronio, iones de solvente protonados, etc) generados por una descarga corona a presión atmosférica. Los iones de analito formados corresponden típicamente a la molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado, positivo o negativo, respectivamente. En el caso de APPI, la ionización ocurre a través de fotoionización por irradiación con una fuente de luz ultravioleta (UV) cuyos fotones tienen una energía próxima a ev. Frecuentemente, se emplean dopantes (modificadores en la fase móvil) como tolueno para generar el primer evento de ionización que por reacciones ion-molécula resulta luego en la ionización del analito..3. Aspectos generales en relación a la generación de los iones.3.. Carga de los iones Cuando la ionización ocurre en fase gaseosa, los iones formados son monocargados. Esto se debe a que resulta desfavorable, tanto termodinámica como cinéticamente, que dos o más especies reactivas reaccionen en fase gaseosa con la misma molécula neutra en un período corto de tiempo para generar un ión múltiplemente cargado, tanto por la repulsión de cargas como por la probabilidad de colisiones. En cambio, cuando la ionización ocurre en fase líquida como en ESI, la aparición de iones doble- o múltiplemente cargados es frecuente y puede estar influenciada por 7

25 Capítulo Introducción la concentración de buffers, analitos, cantidades de modificadores orgánicos o el flujo 3,4. Sin embargo, la mayoría de las moléculas orgánicas pequeñas aparecen frecuentemente como especies monocargadas en sus espectros de masa de ESI, probablemente por la fácil fragmentación a partir de iones múltiplemente cargados debido a la alta energía interna causada por la localización de cargas próximas Formación de iones aducto De manera general, existen tres procesos químicos principales por los cuales pueden generarse los iones gaseosos de una muestra por MS. El primero de ellos es la remoción/ adición de un electrón, del que resultan en iones radicales (M + o M - ). En segundo lugar, la protonación/desprotonación (reacciones ácido/base) que lleva a la formación de moléculas protonadas o desprotonadas ([M+H] + o ([M-H] -, respectivamente). Finalmente, la formación de aductos con cationes/aniones da como resultado iones aducto como por ejemplo, [M+Na] + o [M+Cl] -, respectivamente. Prácticamente en todos los métodos de ionización mencionados en la sección.2 ocurren uno o más de estos procesos químicos para la generación de los iones gaseosos. Por ejemplo, en los espectros de masa obtenidos con métodos de ionización como CI, MALDI o ESI, además de la molécula protonada o desprotonada, se observan múltiples conjuntos de iones aductos. Estos se forman a partir de la interacción de un ion con otros átomos o moléculas y la correcta detección e identificación del ión aducto resulta esencial para obtener la masa exacta de la molécula neutra original. En el caso de ESI, el solvente y la composición del buffer, ph, propiedades ácidobase de las sustancias y la acidez en fase gaseosa, son algunos de los factores que influyen en la formación de iones aductos. También el incremento en la concentración de iones específicos en la fase líquida permite obtener preferentemente aductos con esos iones 6. La adición de aniones o cationes a una solución de analitos para obtener aductos cargados es una estrategia bien conocida, en combinación con técnicas de ionización como ESI o APCI, para inducir la ionización de compuestos poco polares. La coordinación por ionspray (CIS) es el término usado para describir estas técnicas que utilizan reactivos iónicos para inducir la coordinación, siendo los aductos de Ag(I) los más populares 7. 8

26 Introducción Capítulo.4. Analizadores de Masa Actualmente están disponibles en el mercado seis tipos básicos de analizadores de masa: cuadrupolo, trampa iónica, sector magnético/eléctrico, tiempo de vuelo (TOF), Orbitrap y resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR), junto a numerosas combinaciones híbridas y variantes de estos analizadores. Típicamente, los analizadores de masa pueden dividirse en dos grupos de acuerdo a su resolución: baja versus alta, lo que está relacionado con la precisión y exactitud de la medición de masa. El grupo de analizadores de masa de baja resolución incluye a los cuadrupolos (Q) y a las trampas iónicas de varios tipos, como las cuadrupolares (QIT) que se describirán brevemente en la sección.4.. Generalmente, se dice que tienen resolución unitaria, lo que significa que pueden resolver iones que difieren en una unidad de masa, aunque típicamente su resolución es un poco mejor. Su bajo precio y tamaño, así como sus altas velocidades de barrido, les provee versatilidad para aplicaciones en espectrometría de masa tándem, como se describirá en la sección.5.. El desarrollo de analizadores de alta resolución, como el tiempo de vuelo (TOF), y de ultra-alta resolución como el Orbitrap 8,9 y la resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR), ha posibilitado medidas de masa precisas (<5 ppm para el TOF) y ultraprecisas (< ppm para el Orbitrap y FT-ICR), siendo la tendencia actual el reemplazo de los sectores magnéticos de gran tamaño por los otros analizadores mucho más compactos mencionados con anterioridad. Los analizadores de masa más relevantes para este trabajo: TOF y FT-ICR se describirán con cierto detalle en las secciones.4.2 y.4.3, respectivamente..4.. Cuadrupolo (Q) 2 y Trampa iónica cuadrupolar (QIT) 2 Un cuadrupolo consta de cuatro barras cilíndricas o hiperbólicas paralelas en un arreglo cuadrado a las que se aplica un voltaje dependiente del tiempo a cada par de barras opuestas. Bajo la influencia de esta combinación de campos electromagnéticos, los iones que ingresan al cuadrupolo por el espacio axial longitudinal entre las barras experimentan trayectorias complejas, que sólo son estables dentro de ciertos límites. 9

27 Capítulo Introducción La transmisión de iones de una dada m/z es permitida para un determinado potencial aplicado, mientras que iones con diferentes valores de m/z se pierden por colisiones a causa de trayectorias inestables. Así, el cuadrupolo actúa como un filtro de masas barriendo un rango de valores de m/z para analizar los iones al barrer el potencial. La trampa iónica cuadrupolar es la contraparte tridimensional del cuadrupolo y consiste en un electrodo con forma de anillo con tapas hiperbólicas en la parte superior e inferior, que por medio de la aplicación de voltajes, permite atrapar los iones en complicadas trayectorias tridimensionales que resultan estables para iones de un rango de m/z. Las trayectorias de los iones se estabilizan con una baja presión constante de helio (. Pa aprox.) en el interior de la trampa. La manipulación de los potenciales permite desestabilizar la trayectoria de ciertos iones y expulsarlos de la trampa de acuerdo a su relación m/z Tiempo de vuelo (TOF) 2 El analizador de tiempo de vuelo (TOF) opera midiendo el tiempo que le toma a un ión de energía cinética conocida viajar hasta el detector (típicamente -2 m). Con el fin de discriminar los iones con alta resolución en base a sus tiempos de vuelo, se deben eliminar las colisiones lo que requiere el uso de muy alto vacío ( -5 Pa). Por medio de una o más mallas (grids) de aceleración se imparten cerca de ev de energía cinética traslacional a todos los iones, de modo que estos se agrupen de forma más compacta y tengan la misma energía cinética inicial. Luego, los iones viajan en una zona libre de campos (un cilindro hueco) por lo que su velocidad se mantiene constante. Se puede mostrar fácilmente que el tiempo requerido para que un ión de carga z y energía cinética igual a zev viaje una distancia L está dado por t=l/(2zev/m) /2, por lo que el tiempo de vuelo medido por circuitos electrónicos rápidos que comparan el tiempo de salida del conjunto de iones con el de llegada de cada ión es proporcional a (m/z) /2. Como los iones no tienen exactamente los mismos tiempos de salida ni energía cinética, resulta necesario compensar esas diferencias. El reflectrón es un dispositivo de óptica de iones, el cual interactúa con los iones en el TOF como un espejo, revirtiendo el vuelo de los iones por un campo electrostático. Los iones con mayor energía cinética penetran más en el reflectrón que aquellos con menor energía,

28 Introducción Capítulo requiriendo entonces más tiempo en llegar al detector. De esta manera, el reflectrón enfoca iones de energías cinéticas diferentes en el tiempo, mejorando la resolución. Haz iones Reflectrón Electrodo pulsador Trayectoria de los iones Arreglo de detectores Figura.4. Diagrama esquemático de un analizador TOF ortogonal con reflectrón. A diferencia de los instrumentos de barrido descritos en la sección.4.., donde se detecta todo el tiempo sólo parte del rango de m/z, los instrumentos TOF detectan todo el rango de m/z pero sólo por cierto tiempo. Por esto, en el caso de métodos de ionización continuos, como ESI y otros descritos en la sección.2, se emplea una adaptación conocida como TOF ortogonal 22. El haz continuo de iones se acumula por unos microsegundos en un pozo de potencial que luego es sometido a un gradiente de campo eléctrico pulsado ortogonal a la dirección del haz, de manera de generar un pulso de iones (Figura.4). La independencia de los ejes del TOF y el haz tiene dos ventajas. Por un lado, se reduce la dispersión de velocidades iniciales en la dirección del TOF alrededor de una media de valor cero mejorando así la resolución. Por otro lado, aprovechando la independencia de ambos movimientos, la dispersión de velocidades en la dirección del haz permite aprovechar la colección de todos los iones por medio de la utilización de un arreglo de detectores mejorando así la sensibilidad Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR) 23 La resonancia iónica ciclotrónica (ICR) se basa en la ley de Lorentz que establece que iones moviéndose a través de un campo magnético B experimentan una fuerza que es perpendicular a su velocidad. Por lo tanto, en presencia de un campo uniforme perpendicular a su movimiento, los iones se moverán en una trayectoria circular con

29 Capítulo Introducción una frecuencia angular c. Puede mostrarse fácilmente que c = zeb/m, o m/z=eb/ c, donde c cae en el rango de radiofrecuencias (khz-mhz) para los valores de campo usados (> 5 Tesla usualmente). Como la relación m/z se manifiesta como una frecuencia, un parámetro experimental que puede ser medido muy precisamente, la resolución alcanzada es inherentemente muy alta 24. Un analizador de ICR básico consiste en una celda colocada en un campo magnético estático. Al excitar con radiofrecuencias, los iones almacenados dentro de la celda van a absorber energía cuando la frecuencia coincida con c de acuerdo a cada m/z particular, aumentando así el radio de sus orbitas. La corriente inducida por este movimiento circular (corriente imagen) puede luego ser medida por un detector. La aplicación de la transformada de Fourier (FT) a ICR, provee un modo más rápido de realizar el experimento. En lugar de realizar un barrido serial de frecuencias, un pulso de radiofrecuencia de corta duración y de banda ancha es usado para excitar todos los iones a la vez de manera coherente. La señal detectada (en el dominio temporal) está compuesta por las múltiples frecuencias correspondientes a todos los iones presentes. La transformada de Fourier de la señal en el dominio temporal resulta en una señal en el dominio de frecuencias que puede convertirse en el espectro de masa aplicando una calibración. Las condiciones experimentales requieren un número no muy grande de iones en la celda (< 7 ) para evitar colisiones durante el período de detección, por lo que se requiere muy alto vacío (< -5 Pa). La alta exactitud de masa, resolución, sensibilidad y rango dinámico de este analizador no es superado por ningún otro. Sin embargo, los analizadores de FT-ICR no son muy populares ya que requieren fuertes campos magnéticos de costoso mantenimiento suministrados por grandes imanes superconductores similares a los utilizados en los espectrómetros de RMN..5. Aspectos generales en relación a la disociación de los iones.5.. Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS) La dificultad para obtener información estructural empleando métodos de ionización suave por medio de la espectrometría de masa en una única etapa impulsó el desarrollo de la espectrometría de masa tándem 25. La espectrometría de masa 2

30 Introducción Capítulo tándem engloba numerosas técnicas donde un ion de m/z específica, llamado ion precursor, es seleccionado en una primera etapa (MS ) y es activado por métodos específicos de modo que adquiere energía interna suficiente como para disociarse en iones fragmento (o iones producto) que son sujetos a un segundo análisis de espectrometría de masa (MS 2 ). Las diferentes etapas de la espectrometría de masa tándem pueden estar separadas en el tiempo o en el espacio, de acuerdo a los analizadores empleados. Cuando están separados en el tiempo, la selección del ión precursor y el espectro de masa de los iones producto se registra en un único analizador (por ejemplo, el QIT o el FT-ICR), pudiendo realizarse múltiples etapas de MS (MS n ), secuencialmente aislando y fragmentando los iones seleccionados en pasos discretos a lo largo del tiempo. Los experimentos se logran manteniendo sólo iones de cierta relación m/z en el analizador a partir de la expulsión selectiva de todo el resto. Los iones que permanecen se disocian por alguna técnica (por ejemplo, en QIT, se fragmentan por colisiones con las moléculas de helio que siempre están presentes). Los iones fragmento son luego analizados generando el espectro de masa de los iones producto. Expulsando todos los iones fragmento del analizador excepto alguno de cierta m/z de interés, y repitiendo el ciclo de disociación y análisis se generan nuevos iones fragmento a partir del seleccionado lográndose así MS 3. Este proceso puede ser virtualmente repetido n veces (MS n ), donde n es el número de ciclos MS/MS realizados. Por otro lado, para realizar MS/MS en el espacio se requieren por lo menos 2 analizadores que se hallan separados en el espacio por una región intermedia donde ocurre la disociación. En general, esta última es una celda de colisión consistente en un elemento de enfoque, usualmente un cuadrupolo (q), donde ocurre el proceso de activación. Los iones precursores son seleccionados en el primer analizador, son disociados en la celda de colisión y los iones producto son transmitidos al segundo analizador originando el espectro de masa. Son frecuentes configuraciones tales como triple cuadrupolo (QqQ), o equipos híbridos donde se combinan distintos analizadores, como cuadrupolo/tiempo de vuelo (QqTOF). 3

31 Capítulo Introducción.5.2. Métodos de disociación de iones El paso de activación de los iones define el tipo de iones productos resultantes y varios métodos de disociación han sido desarrollados en vista de proveer información estructural complementaria a partir de la fragmentación. En la Tabla, se presentan algunos tales como la disociación inducida por superficie (SID), disociación por captura de electrones (ECD), disociación multifotónica infrarroja (IRMPD), disociación por radiación infrarroja de cuerpo negro (BIRD) 26. La disociación inducida por colisión (CID), o disociación activada colisionalmente (CAD) es el método de activación más comúnmente empleado para obtener espectros de masa tándem (MS/MS) debido a su fácil implementación. La activación se basa en la colisión entre el ion precursor y una especie neutra (típicamente nitrógeno o un gas noble como argón o helio). Como resultado, parte de la energía cinética del gas se convierte en energía interna del ion, aumentando así su tendencia a la fragmentación (si la energía sobrepasa el umbral de disociación). Así, variando el rango de energía cinética del gas resulta posible obtener información sobre la estabilidad y energía interna del ion precursor bajo CID 27. Tabla.. Descripción general de diferentes métodos de disociación de iones Método Rango de Energía Instrumentos Descripción CID Bajo QqQ, QIT, QqTOF, FTICR Colisión de iones precursores con ( ev) moléculas/ átomos blanco de gases Alto TOF/TOF, sector magnético inertes en una celda de colisión. (energía ~kev) SID Bajo QqQ, QIT, FTICR Colisión entre iones precursores y una Alto TOF/TOF superficie blanco sólida ECD Bajo FTICR Captura de un electrón por los iones precursores por interacción con haz de electrones de baja energía. IRMPD Bajo QIT, FTICR Activación de los iones precursores por absorción de múltiples fotones emitidos por un láser infrarrojo. BIRD Bajo QIT, FTICR Activación térmica de baja energía de los iones precursores, ideal para cálculos termodinámicos. 4

32 Introducción Capítulo Debido a las implicancias para el trabajo, se describirá también el método de disociación IRMPD. Los iones precursores pueden ser excitados y subsecuentemente fragmentados por la absorción de uno o más fotones usando láseres de diferentes longitudes de onda. La baja energía de los fotones en el infrarrojo (IR), requiere de múltiples fotones para alcanzar el umbral de disociación a diferencia del UV donde la absorción de un fotón puede proveer suficiente energía para disociar los iones precursores. Por este motivo, se requieren instrumentos con FT-ICR o trampas iónicas 28, donde los iones pueden ser atrapados por largos períodos de tiempo durante el cual pueden absorber múltiples fotones. Con el fin de observar fotodisociación, los iones además deben poseer una transición permitida en el rango de longitudes de onda accesibles por el láser y deben tener también caminos de disociación energéticamente permitidos desde los estados excitados que son alcanzados luego de la absorción de fotones. Los espectros de masa resultantes suelen ser similares a los obtenidos con CID de baja energía Naturaleza de los iones producto de disociación La mayoría de los procesos de fragmentación de iones están dirigidos por el sitio de carga o por el sitio de radical 29. En general, a partir de moléculas protonadas o desprotonadas (iones con un número par de electrones) se espera obtener iones producto con un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en lugar de iones producto de un número impar de electrones (por pérdida de radicales), ya que esta última ruta de disociación es generalmente más energética, lo que constituye el fundamento de la regla de paridad de electrones (even electron rule). A modo de ejemplo, a partir del análisis de pesticidas por EI y ESI, se observó que la formación de especies con un número impar de electrones es significativamente mayor bajo EI en comparación con ESI en modo positivo, donde la mayoría de los iones fragmento informados tienen un número par de electrones 3. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la pérdida de radicales puede también ocurrir bajo ESI en el caso de compuestos aromáticos 3, si los iones fragmento conservan la capacidad de estabilizar electrones desapareados. 5

33 Capítulo Introducción.6. Diferenciación de isómeros por MS La diferenciación de isómeros por MS permanece como un desafío analítico ya que la confirmación de la identidad de cada isómero resulta difícil aun cuando puedan ser separados adecuadamente de mezclas. Esto se debe a que tienen exactamente el mismo peso molecular, y frecuentemente sus caminos de fragmentación son similares. Así, la información estructural limitada de las medidas de MS, en comparación con otras técnicas como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la cristalografía de rayos X, ha generado un interés creciente en la implementación de herramientas adicionales para superar este problema específico. En la actualidad, existen numerosas técnicas que intentan incrementar la información estructural de las mediciones de MS midiendo propiedades adicionales de los iones además de su relación m/z, que incluyen la espectrometría de movilidad iónica (sección.6.), la espectroscopía IRMPD (sección.6.2), así como otras que se muestran en la Figura.5 y se discuten brevemente a continuación. MS/MS Disociación Rx ión-molécula Reactividad Aductos con metales (u otras especies) Caracterización complejos Mobilidad iónica Separación por Sección eficaz Espectro IRMPD Espectros Fotodisociación Intercambio H/D Cinética de Intercambio Figura.5. Esquema de técnicas disponibles para obtener información estructural por MS. Históricamente, las reacciones unimoleculares que conducen a la disociación de los iones se han empleado para obtener información estructural en experimentos de MS/MS. Hoy en día, la disociación de los iones causada por la energía extra provista por la ionización o por los métodos de disociación comentados en la sección.5.2, 6

34 Introducción Capítulo especialmente por colisiones de los iones con moléculas o átomos neutros (CID), es la técnica más frecuentemente utilizada para proveer información estructural. Teniendo en cuenta lo anterior, la diferenciación de isómeros por medio de MS/MS se basa muchas veces en diferencias en las abundancias relativas de los productos de disociación 32,33. Las reacciones en fase gaseosa ión-molécula resultaron interesantes como herramientas para la caracterización estructural a partir de la introducción de la ionización química (CI) y de la utilidad mostrada por este método de ionización para distinguir isómeros a partir de la utilización de ciertos gases reactivos 34. El uso de reacciones bimoleculares ion/molécula en fase gaseosa permite distinguir entre varios isómeros estructurales iónicos, basándose en su reactividad diferencial frente a reactivos selectivos, frecuentemente introducidos empleando equipos con analizadores de FT-ICR o QIT 35,36. Un caso particular es el uso de reacciones de intercambio hidrógeno/deuterio en fase gaseosa. Los iones pueden ser atrapados en una QIT o FT-ICR por diferentes períodos de tiempo mientras se liberan solventes deuterados, como D 2 O o CD 3 OD. De esta manera, pueden diferenciarse isómeros estudiando la cinética de intercambio 37. La adición de moléculas auxiliares como iones metálicos, en combinación con métodos de ionización en solución como ESI, permite producir complejos de coordinación estables para diferentes clases de compuestos. La facilidad con la que estos complejos son transferidos a la fase gaseosa por ESI ha sido utilizada para la caracterización de los aductos formados con diferentes iones metálicos. Así, la complejación con metales combinada con ESI ha permitido distinguir isómeros sin ambigüedades en ciertos casos 38, Espectrometría de Movilidad Iónica (IMS) 4 La espectrometría de movilidad iónica (IMS) tradicional de tiempo de arrastre (drift time) mide el tiempo que le toma a un ión migrar, en presencia de un campo eléctrico débil, a través de un tubo conteniendo un gas inerte a una dada presión (entre Torr y presión atmosférica según la configuración del equipo). La condición principal que debe cumplirse es que la energía térmica suministrada por las colisiones con el gas sea mayor que la energía que los iones obtienen del campo eléctrico. Así, 7

35 Capítulo Introducción la energía de los iones va a ser similar a la de las moléculas de gas y van a predominar los procesos de difusión. Bajo estas condiciones, la velocidad de los iones es directamente proporcional al campo eléctrico por una constante de proporcionalidad llamada constante de movilidad iónica, que está relacionada con la sección eficaz de colisión de los iones (relacionada con la forma y el tamaño). De esta manera, es posible obtener la sección eficaz de colisión de los iones a partir de mediciones directas del tiempo de arrastre, con la potencial derivación de información estructural y conformacional 4. Como ejemplo de aplicación, esta técnica se utilizó para estudiar la isomerización del catión radical benceno generado por EI, seleccionado por su valor de m/z antes de efectuar IMS 42. Las secciones eficaces de colisión de los cationes benceno y fulveno (5-Metilen-,3-ciclopentadieno) son muy similares, haciendo difícil la separación de ambos iones usando helio como gas. Sin embargo, ambos iones isómeros pudieron ser separados en presencia de benceno neutro en la celda, a pesar de poseer movilidades similares, debido a su distinta reactividad frente a la asociación con el precursor neutro por formación de dímeros Espectroscopía IRMPD El uso de láseres UV, visibles o IR para fotodisociar iones gaseosos es otro enfoque promisorio para la diferenciación de isómeros. Dada la imposibilidad de medir el espectro de absorción de un ión de manera directa por la baja concentración en el interior del espectrómetro, la fragmentación puede ser usada como huella de absorción de fotones. La aplicación más frecuente utiliza fotones en el rango del IR, como ya se comentó en relación a IRMPD. A modo de ejemplo, usando un láser infrarrojo de baja potencia (CO 2 ) se diferenciaron iones isómeros de hidrocarburos oxigenados originados a partir de distintos precursores por EI, observándose distintos productos de disociación 43. Cuando es posible variar la longitud de onda del láser, como ocurre en las facilidades que cuentan con un láser de electrones libres (FEL) infrarrojo, y seguir la fotodisociación en función de la longitud de onda, este tipo de experimento abre la posibilidad de la diferenciación de isómeros sobre la base del espectro de fotodisociación infrarrojo observado 44. Cuando la longitud de onda del láser coincide 8

36 Introducción Capítulo en energía con alguna transición permitida a los niveles vibracionales de los varios modos normales del ion, la excitación y luego la disociación se favorecerá, observándose un máximo en el gráfico de abundancia total de iones fragmento versus longitud de onda (es decir, en el espectro IRMPD). De esta manera, se puede obtener el espectro de fotodisociación de varios isómeros estructurales, el cual puede compararse luego con los espectros simulados de IR de varias estructuras de iones isómeros, confirmando así la estructura de los iones utilizando esta espectroscopía Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa La química computacional puede ayudar a la comprensión tanto de los fenómenos de generación de los iones como de los procesos de fragmentación de los mismos en conexión con la termodinámica y la cinética. Las condiciones de bajas presiones en el interior del espectrómetro de masa, donde los iones se encuentran en fase gaseosa, poseen similitudes con las condiciones comúnmente utilizadas en los estudios computacionales donde se utilizan como modelo moléculas aisladas en vacío. Respecto de los procesos de ionización es posible obtener parámetros como la energía de ionización adiabática, basicidad 46 y afinidad protónica 47, entre otros. El primer paso en la interpretación del espectro de masa de moléculas ionizadas por protonación, desprotonación, o formación de aductos, es la determinación del sitio donde estos procesos ocurren, ya que pueden perturbar significativamente la densidad electrónica y afectar la formación de iones y subsecuente fragmentación de enlaces en la molécula 48. Los métodos mecánico-cuánticos proveen de dos piezas importantes de información: la termoquímica de los iones y las estructuras de los estados de transición, que junto con las estructuras de los iones, permiten obtener las superficies de energía potencial (SEP) para los caminos de fragmentación e isomerización de iones 49. En algunos casos, este enfoque puede conducir a un mejor entendimiento de los caminos de fragmentación. Como ejemplo, el estudio computacional aplicado a los iones producto en espectros de masa, ha permitido el análisis de caminos de fragmentación competitivos en flavonas, determinándose las condiciones de prevalencia de uno u otro mecanismo según las características estructurales y la energía de colisión 5. 9

37 Capítulo Introducción En la última década, el uso de métodos computacionales ha ayudado a interpretar los espectros de masa para lograr una correcta asignación de las estructuras de iones, siendo hoy en día una parte integral en la exploración de nuevas estructuras 5. Para llevar a cabo esto es necesario realizar tres ejercicios computacionales básicos: optimización de geometrías de equilibrio y de estructuras de estados de transición, análisis de frecuencias vibracionales y determinación de datos termoquímicos para todas las especies. Para que una estructura sea significativa debe representar un punto estacionario de la SEP, es decir, un estado de equilibrio (mínimo) o un estado de transición (punto de ensilladura de primer orden). El proceso de identificar tales estructuras involucra la optimización de distancias de enlaces, ángulos y ángulos diedros para minimizar la energía de las especies en cuestión. En el caso de estados de transición, se optimizan todos los grados de libertad salvo el responsable del movimiento atómico que conecta una estructura de equilibrio con la otra. El cálculo de frecuencias vibracionales sirve a dos propósitos: verificar que una especie es una estructura de equilibrio (todas las frecuencias reales) o estado de transición (una única frecuencia imaginaria) y calcular la energía vibracional de punto cero (ZPE) para la estructura optimizada. Esta última es necesaria para la determinación de energías relativas más precisas. Cabe destacar que a partir del cálculo de frecuencias vibracionales de cada estructura se obtiene el espectro IR que puede compararse con el espectro IRMPD (sección.6.2). La información más relevante obtenida para estructuras de equilibrio y estados de transición son sus energías relativas. Para una dada SEP, cada nivel de teoría empleado producirá un conjunto único de energías relativas. El nivel de teoría comprende los dos componentes principales del método computacional: el método para el tratamiento de la correlación electrónica y el conjunto de funciones base para describir los orbitales moleculares. El nivel de teoría se selecciona buscando el mejor compromiso entre la consistencia de los resultados y el tiempo de cálculo. Por otra parte, el tiempo de cálculo puede alivianarse seleccionando un sistema químicamente equivalente pero más pequeño que el sistema original. 2

38 Introducción Capítulo.8. Objetivos El objetivo general de este trabajo es contribuir a la mejora de los métodos de análisis de drogas farmacéuticas y agroquímicos, tanto de origen natural como sintético así como también productos alimenticios, a través del desarrollo de nuevas metodologías de análisis. Esto traería aparejado una mejora en la calidad de dichos productos o en el desarrollo de nuevos. El objetivo específico del presente trabajo es el desarrollo de nuevas metodologías de análisis para la diferenciación de isómeros en compuestos aromáticos empleando espectrometría de masa. La hipótesis de que es posible desarrollar nuevos métodos analíticos mediante el empleo de la espectrometría de masa para diferenciar isómeros, ha sido puesta a prueba para numerosas moléculas, mejorando así los métodos preexistentes para su identificación. Sin embargo, aún es limitada su aplicación para la diferenciación de isómeros de posición en compuestos aromáticos. Además, se busca mediante estudios computacionales lograr una comprensión más cabal de los procesos que tienen lugar para lograr una interpretación correcta de los espectros de masa, dilucidar las diferencias entre isómeros y poder aplicar los resultados a sistemas similares más complejos. El interés del trabajo está centrado en la identificación unívoca de pares de regioisómeros de compuestos aromáticos. En particular, se trataron los N-óxidos de 2- y 3-hidroxipiridina (capítulo 2), utilizados como sistema prototipo para el estudio posterior de los - y 4- N-óxidos de pirazinas monosustituídas (capítulo 3), evaluando luego la extensión de la metodología a otra familia relacionada de compuestos, los dihidroxiarenos (capítulo 4). 2

39 Capítulo Introducción 22

40 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina 2 Capítulo 2.. Introducción Si bien son conocidos y empleados desde hace mucho tiempo, los compuestos heterocíclicos aromáticos nitrogenados han recibido mucha atención recientemente, debido a su presencia en el ambiente y su potencial impacto ambiental. En particular, la piridina y sus derivados tienen mucha relevancia a causa de sus conocidas propiedades tóxicas y carcinogénicas y sus efectos letales en el ambiente biogénico natural 52. Los N-óxidos heterocíclicos están presentes en productos naturales, drogas farmacéuticas, agroquímicos e intermediarios sintéticos 53, aunque también son metabolitos comunes que pueden formarse por oxidación en el átomo de nitrógeno durante la biotransformación metabólica de muchas drogas y xenobióticos 54. La diferenciación por espectrometría de masa de N-óxidos heterocíclicos y sus metabolitos isómeros hidroxilados es de interés ya que, en general, los espectros de masa tándem de baja energía suelen ser similares cuando la N-oxidación o hidroxilación ocurren en el mismo anillo aromático. Por ejemplo, la similitud de los espectros de masa tándem de las moléculas protonadas de la 8-hidroxiquinolina y el N-óxido de quinolina obtenidos por ESI, reveló que estos compuestos isómeros oxigenados son indistinguibles por este método 55. Por este motivo, un entendimiento detallado de la ionización y fragmentación de los N-óxidos heterocíclicos puede resultar valioso para el desarrollo de metodologías alternativas para su diferenciación por MS. Teniendo en cuenta estos precedentes, se seleccionaron como sistema de estudio prototipo dos compuestos comerciales (Figura 2.), N-óxidos de la 2-hidroxipiridina y la 3-hidroxipiridina 2, con el objetivo de diferenciar ambos isómeros por espectrometría de masa con el fin de extender la metodología posteriormente a otros heterociclos más complejos. Mientras que el N-óxido de piridina 56 y las hidroxipiridinas han sido estudiadas extensivamente por espectrometría de masa 57,58, sus N-óxidos hasta ahora habían escapado del análisis. 23

41 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Figura 2.. Estructuras de los N-óxidos estudiados. El N-óxido de la 2-hidroxipiridina existe como una mezcla de los tautómeros a y b, siendo a el principal tautómero en solución y en sólidos cristalinos 59. Asimismo, se han informado las propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina comportándose como un análogo heterocíclico de ácidos hidroxámicos, por métodos potenciométricos y espectrofotométricos, para varios metales divalentes y trivalentes 6,6,62. El estudio del comportamiento por espectrometría de masa tándem (MS/MS) de los N-óxidos de hidroxipiridina protonados, empleando distintas fuentes API (ESI, APCI y APPI) acopladas a un espectrómetro de masa híbrido QqTOF se presenta en la sección 2.2. Para ello, empleando CID como método de activación, se caracterizaron los iones fragmento obtenidos al utilizar diferentes energías de colisión. El comportamiento de ambos isómeros como agentes complejantes, analizando los aductos que se generan entre estas moléculas con cationes metálicos por ESI, se estudia en la sección 2.4. Entre otros, se incluyeron los iones metálicos trivalentes hierro (III), galio (III) y aluminio (III), por su capacidad de formar complejos estables al asociarse con hidroxamatos 63, y el escandio (III) por fines comparativos, ya que son poco comunes los estudios de complejación con este ion 64. Además, se emplearon iones metálicos divalentes ambientales: magnesio (II), calcio (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II) y zinc (II), y debido a la relevancia biológica de los complejos del N-óxido de la 2-hidroxipiridina con vanadilo (IV) como compuestos insulinomiméticos 65, se utilizó también este catión diatómico. Con el fin de alcanzar un mejor entendimiento del mecanismo de fragmentación y de las diferencias observadas en los espectros de masa con metales se realizaron cálculos computacionales. La caracterización de los principales iones obtenidos y el análisis de la estabilidad relativa de los posibles productos de disociación y de los complejos formados en fase gaseosa, constituye una herramienta importante para entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los N- 24

42 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 óxidos de hidroxipiridina. Los cálculos realizados en relación a los mecanismos de disociación estudiados se exponen en la sección 2.3, mientras que en la sección 2.5, se exponen los relativos a los complejos metálicos, explorándose a modo de ejemplo aquellos formados con calcio con abundancias relativas importantes para ambos isómeros Comportamiento frente a la disociación Efecto de las fuentes de ionización A partir de las moléculas neutras y 2 fueron fácilmente producidos los correspondientes cationes protonados en fase gaseosa usando ESI, APCI o APPI. Las condiciones empleadas para los experimentos se describen en el capítulo 5. El propósito buscado fue mantener los parámetros lo más similares posible con el fin de determinar el efecto de las diferentes fuentes sobre la disociación. En primer lugar, se estudió la fragmentación empleando CID de los cationes protonados isoméricos producidos por ESI. En los espectros de masa tándem, sólo se observaron dos iones producto, uno de masa par [M+H-H 2 O] + y otro de masa impar [M+H-OH] +, que corresponden a la pérdida de una molécula neutra y de un radical, respectivamente. En la Figura 2.2 se presentan los espectros de masa de los iones producto a partir de los cationes protonados isoméricos obtenidos por CID a 5 ev. Como puede verse en estos espectros, la abundancia relativa de los iones es claramente diferente para cada isómero a esta energía de colisión. En la Figura 2.3 se observa la evolución de la abundancia de los iones precursores de las moléculas y 2 protonadas (m/z 2) y de los iones fragmento (m/z 94 y m/z 95) que representan dos caminos de disociación competitivos, en función de la energía de colisión. La señal a m/z 95 (pérdida de radical OH) domina el espectro de iones producto del precursor protonado de 2 a energías de colisión superiores a 3 ev mientras que la pérdida de agua es poco significativa en todo el rango de energías de colisión estudiado. Por otro lado, el catión precursor protonado de domina el espectro a toda energía de colisión, siendo la abundancia de los iones fragmento provenientes de la pérdida del radical y de agua comparables hasta ev, cuando el ion de m/z 95 se vuelve ligeramente más importante. 25

43 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina [%] [M+H] MS2(2.4) Intensidad relativa [M+H-OH] [M+H-H 2O] m/z [%] 2 [M+H-OH] MS2(2.4) Intensidad relativa [M+H] m/z Figura 2.2. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores de m/z 2 (N-óxidos de hidroxipiridina protonados producidos por ESI) con energía de colisión de 5 ev. 2 Abundancia de iones (u.a.) m/z 2 m/z 95 m/z Energía de colisión (ev) Abundancia de iones (u.a.) m/z 2 m/z 95 m/z Energía de colisión (ev) Figura 2.3. Diagramas de abundancia de iones precursores y producto (unidades arbitrarias) versus energía de colisión (ev) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina protonados producidos por ESI. (m/z 2 = [M+H] + ; m/z 95 = [M+H-OH] + ; m/z 94 = [M+H-H 2 O] + ). 26

44 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Es interesante notar que en los espectros de masa tándem de las 2- y 3- hidroxipiridinas protonadas ([M+H] +, m/z 96) obtenidos por otros autores empleando altas energías de colisión, 8.2 kev 58 y kev 66, respectivamente, fueron observados entre los iones fragmento, aquellos originados por la pérdida de agua (m/z 78). En cambio, los perfiles de fragmentos aquí observados resultaron casi idénticos para ambas moléculas, difiriendo la intensidad relativa de los mismos. Sin embargo, las intensidades relativas de los fragmentos no pueden ser comparadas debido a las diferentes condiciones experimentales con que fueron obtenidos los espectros entre el presente trabajo y el citado. Por otro lado, la pérdida del radical OH ya había sido observada 56 en el espectro de iones producto de la molécula protonada del N-óxido de la piridina obtenido por ESI a una energía de colisión de 2 ev así como para otros N- óxidos derivados de quinolinas 67. Cabe destacar que este comportamiento frente a la disociación constituye una excepción a la regla de paridad electrónica (even electron rule), que como se comentó en la sección.5.3, expresa que a partir de moléculas protonadas se espera obtener iones producto de un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en lugar de iones producto de un número impar de electrones por pérdida de radicales. Sin embargo, es conocido que esta predicción empírica puede no ser válida para compuestos cuyos iones fragmento conservan la capacidad de estabilizar electrones desapareados 68,69. En estos casos, la formación de dos especies de capa abierta por CID a partir de un catión precursor puede estar más favorecida que la pérdida de una molécula neutra de capa cerrada y la formación de un catión producto 7. Los espectros de iones producto obtenidos con APCI y APPI resultaron estrechamente similares a aquellos obtenidos con ESI, excepto por las intensidades absolutas que difieren de acuerdo a la sensibilidad de cada método de ionización. ESI y APCI mostraron intensidades absolutas comparables, siendo APCI ligeramente superior en sensibilidad, en cambio APPI exhibió cerca de la mitad de los valores absolutos de las otras fuentes. En la Figura 2.4 se muestran los diagramas de abundancia relativa de los iones precursores y producto obtenidos a partir de las moléculas y 2 representando los dos caminos de disociación competitivos en función de la energía de colisión de manera comparativa para los distintos métodos de ionización. 27

45 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina En un trabajo donde se compara la eficiencia de los mismos tres métodos de ionización con cinco fármacos 7 se había encontrado una mayor abundancia de las moléculas protonadas empleando ESI, mientras que APCI y APPI fallaban en producir la ionización de uno de los compuestos. Teniendo en cuenta que la ionización por ESI ocurre a partir de la solución 9, mientras que en APCI y APPI ocurre en fase gaseosa luego de la vaporización del solvente, (sección.2.6, pág. 7), no es de sorprender la obtención de respuestas selectivas de acuerdo a la naturaleza del compuesto. Asimismo, aunque podría esperarse que la energía interna suministrada a los iones fuera distinta según el método de ionización, la influencia de este efecto no resulta significativa para los compuestos estudiados, como se observa en las curvas de disociación de la Figura 2.4., m/z 2 ESI APCI APPI m/z 2, 2 ESI APCI APPI,8,8 Fracción de iones,6,4 Fracción de iones,6,4,2, m/z 95 m/z 94,2, m/z 95 m/z Energía de colisión (ev) Energía de colisión (ev) Figura 2.4. Diagramas de abundancia relativa (como fracción de iones) versus energía de colisión (ev) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina protonados producidos por ESI, APCI y APPI. (m/z 2 = [M+H] + ; m/z 95 = [M+H-OH] + ; m/z 94 = [M+H-H 2 O] + ). Sobre la base de estos resultados puede concluirse que se pueden diferenciar fácilmente ambos isómeros a energías de colisión superiores a 3 ev comparando la relación de intensidades del ión precursor de m/z 2 y el fragmento de m/z 95. Así, una relación [M+H] + /[M+H-OH] + mayor a es indicativa del isómero, mientras que un valor menor a es indicativo del isómero 2, independientemente de las fuentes de ionización empleadas. 28

46 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Por primera vez, fue investigado el comportamiento disociativo en modo positivo del par de N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina, pudiendo diferenciar los mismos por este método (MS/MS) usando diferentes técnicas de ionización API-MS. El empleo con éxito de la espectrometría de masa tándem para la diferenciación de otros compuestos isómeros ya había sido informada con anterioridad, como en el caso de los regioisómeros de ácidos benzoilbenzoicos 32 empleando APCI-MS n. Sin embargo, se había informado 55 acerca de la inefectividad de los métodos MS/MS para la distinción de los isómeros 8-hidroxiquinolina y el N-óxido de quinolina estudiados por ESI en modo positivo, debido a la similitud de sus espectros de masa tándem. Resulta interesante entonces que en los compuestos isómeros estudiados, moléculas muy emparentadas con las anteriores, se hayan observado diferencias Efecto de la temperatura En trabajos previos, se habían realizado estudios variando la temperatura de la fuente de APCI (2-4 C), para derivados de N-óxidos de quinolina y otros compuestos con la función N-óxido 55,72. En ellos se observó una fragmentación característica de los N-óxidos bajo estas condiciones, producto de la desoxigenación de los compuestos. Esta descomposición térmica fue usada 72 por ejemplo, para distinguir un N-óxido de su metabolito hidroxilado utilizando espectros de masa obtenidos con APCI a diferentes temperaturas. Teniendo en cuenta lo anterior, se estudió el efecto de la temperatura en los espectros de masa APCI de los compuestos y 2, así como en el comportamiento frente a la disociación de los iones precursores isoméricos. La elección de este método de ionización reside en la posibilidad de variar la temperatura del vaporizador desde 8 hasta 4ºC y en la mayor sensibilidad antes observada. Cabe destacar que con la fuente de ESI no se utiliza un vaporizador (sección.2.5, pág 5). En los espectros de masa APCI, se encontró la sensibilidad máxima en la abundancia de iones para ambos compuestos entre 2 y 225ºC. Además, se observó la aparición del ion de m/z 96, originado por la pérdida de un átomo de oxígeno, cuya intensidad se incrementó a temperaturas superiores a 3ºC, como se muestra en la Figura 2.5. En la Figura 2.5 se observa además que el aumento en la desoxigenación asociado con la elevación de la temperatura, difiere porcentualmente entre los dos compuestos. 29

47 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina 6 m/z 95 de m/z 96 de m/z 95 de 2 m/z 96 de 2 5 Intensidad relativa (%) Temperatura (ºC) Figura 2.5. Relación entre las intensidades relativas de los iones [M+H-OH] + (m/z 95) y [M+H-O] + (m/z 96) frente a [M+H] + (m/z 2) de y 2 obtenida a diferentes temperaturas del vaporizador en los espectros de masa de los N-óxidos de hidroxipiridina producidos por APCI. Los espectros MS/MS de los cationes protonados de y 2 fueron también registrados a distintas temperaturas y los mismos mostraron una dependencia de la temperatura no significativa. La ausencia de cambios observables, sugiere que la activación térmica no es un factor importante en los caminos de disociación estudiados. Los resultados anteriores se encuentran de acuerdo con los informados previamente 55,72, donde se sugiere que la fragmentación de los N-óxidos que conduce a la pérdida de oxígeno es causada por la activación térmica y no es inducida por la activación colisional, sobre la base de la completa falta de formación de iones fragmento desoxigenados observada en los espectros de APCI MS/MS a 2 C (o a temperaturas menores). Los experimentos realizados en relación al efecto de la temperatura sobre la fragmentación de los compuestos estudiados confirman los resultados obtenidos previamente por otros autores en cuanto al comportamiento observado para otros N- óxidos. Además, en este trabajo, se muestra que el uso de temperaturas mayores a 3 C del vaporizador en APCI puede ser empleado para la diferenciación de los N- óxidos isómeros estudiados observando las diferencias en el porcentaje de los productos de desoxigenación. 3

48 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo Efecto del intercambio H/D Se realizaron además estudios de marcado isotópico de los compuestos y 2 reemplazando los átomos de hidrógeno intercambiables por átomos de deuterio y empleando los mismos disueltos en solventes deuterados (Capítulo 5, sección 5..2, pág. 28). De esta manera, empleando ESI se estudió el comportamiento frente a la disociación de los compuestos deuterados denotados d y 2d (Figura 2.6) para obtener información adicional. Los experimentos de marcado con deuterio se utilizan en general para explorar mecanismos de fragmentación propuestos. Por ejemplo, en iones parcialmente deuterados obtenidos a partir de ácidos carboxílicos de la 9- fluorenona 32 disueltos en metanol deuterado, se evidenciaron transposiciones,2 de iones hidruro alrededor del anillo aromático en los espectros APCI-MS n. En los espectros de masa de los compuestos deuterados d y 2d, se observaron dos iones con uno o dos átomos de deuterio incorporados (m/z 3 y 4, respectivamente), los que fueron seleccionados para realizar los espectros de masa tándem a diferentes energías de colisión. El ión de m/z 3 corresponde a [Md+H] +, o eventualmente a [M+D] +, mientras que el ion de m/z 4 corresponde a [Md+D] +. En la Figura 2.7, se reproducen los diagramas que muestran los iones producto obtenidos a partir de cada ion precursor seleccionado para los compuestos deuterados d y 2d en función de la energía de colisión. Figura 2.6. Estructuras de los compuestos deuterados estudiados. Al comparar la Figura 2.7 con la Figura 2.3 (pág. 26) obtenida para los compuestos no deuterados, se puede observar que en general se conserva la forma de las curvas lo que permite una interpretación más directa. En el caso del compuesto d, el ion precursor dideuterado [d+d] + (m/z 4) pierde el radical OD y la molécula neutra D 2 O dando los iones producto de m/z 96 y m/z 94, respectivamente. De manera análoga, el ion precursor de m/z 3 ([d+h] + o [+D] + ) se fragmenta perdiendo los radicales OH y OD así como la molécula neutra HDO, originándose los iones 3

49 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina fragmento de m/z 96, 95 y 94, respectivamente. En este caso, los iones fragmento de m/z 96 y 95 resultan muy similares en intensidad lo que podría sugerir una distribución uniforme del átomo de deuterio incorporado entre los átomos de oxígeno que se encuentran próximos en la molécula, facilitando así el intercambio H/D entre esas posiciones. Esto resulta consistente con la coexistencia de dos estructuras en equilibrio (Figura 2.6). d 2d Abundancia de iones (u.a.) m/z 4 m/z 96 m/z Energía de colisión (ev) Abundancia de iones (u.a.) m/z 4 m/z Energía de colisión (ev) d 2d Abundancia de iones (u.a.) m/z 3 m/z 96 m/z 95 m/z Energía de colisión (ev) Abundancia de iones (u.a.) m/z 3 m/z 96 m/z Energía de colisión (ev) Figura 2.7. Diagramas de abundancia de iones (unidades arbitrarias) versus energía de colisión (ev) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina deuterados d y 2d producidos por ESI (m/z 3 y 4= iones precursor mono- y di- deuterados, respectivamente). Por otro lado, el ion precursor de m/z 4 correspondiente al compuesto 2d presenta como ion producto sólo aquel de m/z 96, formado a partir de la pérdida del radical OD, mientras que el ion precursor de m/z 3 presenta como iones producto a 32

50 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 aquellos originados por la pérdida de los radicales OH y OD, de m/z 96 y 95, respectivamente. A diferencia de la muestra d, en este caso no se observaron iones fragmento de intensidad apreciable originados por la pérdida de moléculas neutras. Además, se observaron diferencias en la intensidad de los iones fragmento m/z 96 y 95 en una relación ~2:. Se puede notar que como los átomos de oxígeno no se encuentran próximos en la molécula 2, el intercambio de H/D entre esas posiciones luego de la deuteración no es probable como en el compuesto. Luego, se sugiere que la incorporación diferencial de deuterio en ambas posiciones, recordando que el ion precursor m/z 3 puede provenir de [d+h] + o [+D] +, podría ser la causa de las diferencias observadas en las intensidades de los iones de m/z 96 y 95. Es interesante notar que en experimentos previos realizados 56 utilizando el N-óxido de piridina-d 5, disuelta en solventes no deuterados, fue observada la pérdida del radical OH como principal canal de fragmentación aunque también se observó la pérdida del radical OD, en una relación de iones producto de ~4:, en el espectro de masa tándem obtenido a partir del ion precursor protonado (m/z ). Por lo tanto, teniendo en cuenta estos resultados no puede excluirse la ocurrencia de reacciones de intercambio H/D con los átomos de hidrógeno aromáticos. Esta información adicional acerca del mecanismo de fragmentación podría obtenerse realizando experimentos de marcado con deuterio en los átomos de hidrógeno aromáticos, estudiando el comportamiento frente a la disociación de los iones protonados de los N-óxidos de la 2 y 3- hidroxipiridina-d 4 disueltos en solventes no deuterados, de manera análoga a lo ya realizado con el N-óxido de piridina-d 5. Por otro lado, experimentos MS/MS sobre los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina y 2 pero marcados con 8 O (C- 8 O o N- 8 O), podrían proveer información útil respecto a la pérdida preferencial del radical OH. Sin embargo, la realización de dichos experimentos implica la síntesis no trivial de los compuestos marcados y escapa de los objetivos planteados. La formación de los iones fragmento obtenidos a partir de los iones precursores deuterados en función de la energía de colisión resultó similar a la obtenida para los compuestos sin deuterar. La pérdida del radical OD y/o OH constituyó el principal camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a la que prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin 33

51 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina deuterar. De esta manera, los resultados obtenidos corroboraron aquellos antes obtenidos en la sección Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional Sitios de protonación Las geometrías de las estructuras a, b y 2 fueron optimizadas usando el nivel de teoría híbrido B3LYP 73,74 de la teoría del funcional de la densidad (DFT) usando el conjunto de funciones base 6-3++G(d,p). Este conjunto de funciones base que presenta tanto orbitales difusos como polarizados sobre cada átomo ha demostrado ser adecuada para la investigación de sistemas similares con cargas deslocalizadas 75. Las estructuras optimizadas fueron caracterizadas por análisis de frecuencias armónicas en los mínimos locales (todas las frecuencias reales) o puntos de ensilladura de primer orden (una frecuencia imaginaria). En los valores de energía que aparecen a lo largo del trabajo se encuentra incluída la corrección para la energía vibracional de punto cero (ZPE) usando el mismo nivel de teoría. Con el fin de identificar los sitios más probables de protonación de a, b y 2 se emplearon índices de reactividad local, en particular, la función electrofílica de Fukui (f - K ) 76 (Apéndice A., pág. 257). Recientemente, esta metodología ha sido empleada para identificar los sitios de protonación en una serie de compuestos naturales 77 y sintéticos 78. En este caso, para la estimación de la función condensada de Fukui se emplearon tres aproximaciones: la aproximación de diferencias finitas 79, usando las cargas provistas por el análisis de población de Mulliken (MPA) 8 y el análisis de población natural (NPA) 8, así como la aproximación directa de orbitales moleculares frontera, relacionada con la densidad electrónica y la localización del orbital molecular ocupado más alto (HOMO) en la molécula, despreciando el término de solapamiento 82. Los sitios probables de protonación obtenidos a partir de la estimación de la función condensada de Fukui por los métodos antes descritos se muestran en la Figura 2.8. En el capítulo 5 se encuentran los valores obtenidos a partir de los cálculos (Tabla 5.9, pág. 243) para una lectura detallada de los mismos. Como se observa en la Figura 2.8, los sitios de protonación más probables corresponden al átomo de oxígeno del grupo N-óxido en b y 2, y del carbonilo en a. Debido a que para estos átomos se obtiene el mayor valor de f - K se infiere que estas posiciones corresponden a los sitios 34

52 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 de protonación preferidos. Es interesante mencionar que aunque se notan ligeras diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA) así como la de orbitales moleculares frontera (HOMO), ambas aproximaciones mostraron la misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación.,6 a,6 b MPA NPA HOMO Función condensada de Fukui (f k -),5,4,3,2,,,5,4,3,2,, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O Sitio (k) N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O Sitio (k) Figura 2.8. Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (f - K ) para los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina a, b y 2 calculadas con las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA) y de orbitales moleculares frontera (HOMO) para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-3++G(d,p). Función condensada de Fukui (f k -),6 2,5,4,3,2,, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O Sitio (k) MPA NPA HOMO Además, y con el fin de corroborar las predicciones obtenidas por las funciones condensadas de Fukui, se calculó la energía de todos los cationes producidos por la protonación de a, b y 2 en cada uno de los sitios posibles y a partir de la diferencia entre la energía de cada catión y su correspondiente precursor neutro se obtuvieron las energías de protonación en las distintas posiciones de cada compuesto. En la Figura 2.9 se pueden ver los resultados obtenidos a partir del cálculo de energías de protonación (Tabla 5., pág. 243). Las posiciones más favorables de protonación, correspondientes a aquellas con menor energía, resultaron coincidentes con las 35

53 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina predichas por los índices locales de la función electrofílica condensada de Fukui (Figura 2.8) confirmando así los resultados. Figura 2.9. Energía de protonación (kcal mol - ) para la protonación en diferentes posiciones atómicas de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina a, b y 2 calculadas en diferentes posiciones al nivel de teoría B3LYP/6-3++G(d,p). La protonación de a (-27.6 kcal mol - ) y b (-29.8 kcal mol - ) considerando las posiciones más favorables (Figura 2.9) condujo al mismo catión producto. Las conformaciones estables desde a y b, fueron nombradas I+H y II+H, respectivamente. A partir de la protonación de 2 ( kcal mol - ) se encontraron dos conformaciones estables, III+Ha y III+Hb. Los valores calculados de energías de protonación se encuentran próximos a los valores calculados para la afinidad protónica del N-óxido de piridina, 29 o 225 kcal mol -, hallados por dos métodos de cálculo distintos 56. En la Figura 2., se muestran las estructuras obtenidas a partir de la optimización de geometría al nivel B3LYP/6-3++G(d,p). La protonación en el oxígeno ya protonado del grupo N-óxido (N-O) en a y en el oxígeno del grupo hidroxilo (C-O) en b originó iones inestables que durante la optimización de geometría, reordenaron a los iones más estables II+H y I+H, respectivamente. De manera similar, la protonación en los átomos N-, C-3 y C-5 de b no produjo iones estables, ya que durante la optimización de geometría reordenaron a través de la migración de un protón del grupo OH hacia el oxígeno del grupo N-óxido a las estructuras respectivas encontradas para a. Esto no resulta 36

54 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 sorprendente dado que como resultado de la protonación, los tautómeros del compuesto convergen a tautómeros del mismo ion. Figura 2.. Geometrías optimizadas de los cationes protonados de y 2, mostrando las distancias de enlace C2-C3, N-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O-N-C2 en grados, obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-3++G(d,p). Como se ve en la Figura 2., el grupo hidroxilo sustituyente se encuentra coplanar con el anillo aromático en las conformaciones más estables de las estructuras estudiadas. Esto muestra la efectividad de la interacción del par libre de electrones del átomo de oxígeno con los orbitales del anillo aromático. Por otro lado, el grupo oxígeno protonado de la función N-óxido se encuentra orientado casi perpendicular al anillo aromático, excepto para I+H, donde el grupo se encuentra coplanar. En ambas conformaciones del isómero protonado, los grupos hidroxilo están orientados cis respecto al otro, hecho que posiblemente facilita la ocurrencia de interacciones estabilizantes adicionales. Los índices de las funciones condensadas de Fukui permitieron determinar por primera vez el sitio de protonación más probable de los compuestos y 2 estudiados, obteniéndose coincidencia con los resultados obtenidos mediante el cálculo de energía de protonación. A partir de este análisis fue posible luego caracterizar las estructuras correspondientes a los mínimos de energía de los compuestos y 2 protonados. 37

55 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Energía de los iones La caracterización de las estructuras iónicas relevantes en la disociación de los cationes I+H, II+H, III+Ha y III+Hb se llevó a cabo por medio de cálculos computacionales de optimización de geometría de los iones producto primarios de las principales reacciones de disociación (pérdida del radical OH). De esta forma, a partir de los N-óxidos de hidroxipiridina isómeros protonados, se obtuvieron las conformaciones más estables de los respectivos productos. Debido al carácter radicalario de estas especies, se utilizaron métodos sin restricciones de spin (UB3LYP) adecuados para sistemas de capa abierta. Para evitar el efecto de la contaminación de spin 83 (Apéndice A.2, pág. 259) introducida típicamente al emplear los métodos anteriores, se realizaron cálculos puntuales de energía (single-point) utilizando métodos restringidos de capa abierta (ROMP2) 84 para el conjunto completo de estructuras previamente optimizadas. De todas formas, los resultados obtenidos para todos los valores de spin <S 2 > de los sistemas de capa abierta confirmaron una desviación menor al 2% del valor esperado (Tabla 5.3, pág. 247), mostrando que la función de onda obtenida por B3LYP no sufre contaminación de spin apreciable. La combinación del uso de los métodos UB3LYP (DFT) y ROMP2 permite así evitar el problema de la contaminación de spin observada en las funciones de onda obtenidas por UMP2, que en algunos casos ha resultado importante, como se ha encontrado en los radicales estudiados del 3-metilbutanal 85. Los perfiles de energía obtenidos se presentan en la Figura 2. junto con los parámetros geométricos más relevantes de las estructuras calculadas. La caracterización fue completada realizando e l análisis de frecuencias de las estructuras correspondientes a puntos estacionarios. Dada la similitud en los resultados obtenidos con las conformaciones III+Ha y III+Hb (diferencias de energía relativas entre estructuras respectivas menores a kcal mol - en todos los casos), cualquiera de ellas resulta igualmente representativa y fue subsecuentemente nombrada III+H. Por otro lado, la interconversión entre las estructuras I+H y II+H tiene asociada una barrera energética pequeña de unas 5 kcal mol -, por lo que ambos confórmeros podrían interconvertirse, si cuentan con suficiente energía interna, lo que resulta probable en las condiciones experimentales empleadas. 38

56 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Figura 2.. Perfiles de energía de los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas y sus productos de disociación primarios, mostrando las distancias de enlace C2-C3, N-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O-N-C2 en grados. Las geometrías optimizadas y las energías fueron obtenidas al nivel de teoría UB3LYP/6-3++G(d,p) y todos los valores están en kcal mol -. Los valores entre paréntesis corresponden a lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores. Para el cálculo de las energías relativas se tuvieron en cuenta los valores de las energías totales y de punto cero (ZPE) (Tabla 5.3, pág. 247). La comparación entre los dos conjuntos de datos de energías sugiere que las lecturas de energía ROMP2//UB3LYP/6-3++G(d,p) entre los distintos iones fragmento (Figura 2.) son en todos los casos mayores por unas pocas kcal mol - que aquellos directamente obtenidos con UB3LYP/6-3++G(d,p). En ambos casos, puede concluirse que el grupo hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido y no a partir del anillo aromático. En trabajos previos, se midió mediante experimentos calorimétricos 86 la entalpía de disociación del enlace N-O de los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina y 2 obteniéndose valores de 67 y 6 kcal mol -, respectivamente. Posteriormente, se realizaron también estudios computacionales 87 donde se obtuvieron valores 39

57 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina comparables pero encontrándose variaciones de hasta kcal mol -, según el nivel de teoría empleado. Si bien los valores mencionados de entalpías no son directamente comparables con las energías calculadas para la pérdida del radical OH a partir de los compuestos protonados, la tendencia obtenida experimentalmente resulta interesante ya que muestra diferencias de ~% entre ambos isómeros, favoreciendo la disociación del isómero 2 frente al, tal como se observa experimentalmente (Figura 2.3, pág. 26). Como se observa en la Figura 2., no resulta evidente cuál es la energía de disociación asociada a la estructura protonada que debe ser comparada en relación a su isómero. Por este motivo, los caminos de disociación se investigaron con mayor profundidad, presentándose la discusión a continuación Caminos de disociación Los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H fueron explorados mediante la localización de las estructuras de transición entre puntos estacionarios, que fueron caracterizadas por el cálculo de frecuencias vibracionales. Desafortunadamente, todos los intentos para localizar una estructura de transición para la pérdida del radical hidroxilo a partir de los reactivos protonados desde el estado fundamental electrónico (singulete) fallaron. Más aún, el barrido de la superficie de energía potencial (SEP) para I+H, II+H y III+H tampoco mostró estructura transitoria alguna que diera cuenta de la pérdida del radical. A veces puede ocurrir que en la formación de radicales esté involucrado un estado electrónico excitado como el estado triplete, como fue propuesto por ejemplo, para las disociaciones homolíticas en iones piridinio 88. En el caso particular de los N-óxidos heteroaromáticos existe evidencia de la implicación del estado triplete en las reacciones de desoxigenación fotoquímicas 89. En particular, en el estado fundamental de una serie de N-óxidos de quinolina se observó que la forma protonada era fotoquímicamente estable exhibiendo fosforescencia 9. Por lo anterior, se estudiaron los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H desde el estado excitado triplete. En la Figura 2.2 se presentan los perfiles de energía potencial obtenidos para los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de disociación principales. 4

58 4 Figura 2.2. Perfiles de energía potencial de los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de disociación principales obtenidos al nivel de teoría UB3LYP/6-3++G(d,p). Todos los valores están en kcal mol -. Las energías se obtuvieron a partir de cálculos UB3LYP/6-3++G(d,p) y los valores entre paréntesis a partir de lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores. Las estructuras señaladas por s y t corresponden a las estructuras iniciales (iones precursores) de los compuestos protonados en los estados singulete y triplete, respectivamente. Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2

59 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina La caracterización de la SEP para el estado excitado triplete permitió obtener una estructura de transición para la pérdida del radical hidroxilo desde los reactivos protonados I+H y III+H, pero no para II+H, cuya estructura de transición era responsable de la pérdida de agua (Figura 2.2), como se confirmó por cálculos de coordenada de reacción intrínseca (IRC) 9. Los cálculos IRC fueron llevados a cabo con el fin de verificar que las estructuras de los estados de transición localizados estuvieran conectadas con los correspondientes puntos estacionarios mínimos asociados con reactivos y productos. Otra estructura de transición para la pérdida de agua también fue encontrada desde el estado fundamental singulete de II+H, mientras se estaba buscando la correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo (Figura 2.2). Recientemente se han realizado estudios computacionales sobre el ion producto de esta fragmentación [II+H-H 2 O] +, 2-piridinil oxenio, en los estados electrónicos singulete y triplete 92 y utilizando cálculos a un nivel de teoría elevado (CASPT2/pVTZ); se estimó un salto de 6.4 kcal mol - entre el estado fundamental singulete y el primer estado excitado triplete de este ion. Las diferencias relativas entre los valores UB3LYP y ROMP2 ascienden como máximo a 8 kcal mol -, lo cual es bastante aceptable para el propósito cualitativo buscado. Resulta interesante notar que estas diferencias se hacen evidentes en las estructuras calculadas en el estado electrónico triplete. Asimismo, al comparar las energías de los saltos singulete-triplete para iones fenil oxenio y piridinil oxenio 92 calculadas por B3LYP y métodos de mayor nivel de teoría como CASPT2/pVTZ, se han encontrado diferencias de > kcal mol -. Sin embargo, como se observa en la Figura 2.2, ambos métodos de cálculo coinciden en predecir una mayor barrera para la pérdida del radical hidroxilo en I+H respecto a III+H cercana a kcal mol - a partir del estado excitado triplete. Esta diferencia en la barrera energética podría ser responsable de las diferencias en las intensidades relativas de los iones fragmento observadas previamente en los espectros de masa de cada compuesto para una dada energía de colisión (Figuras 2.2 y 2.3, pág. 26). En la Figura 2.3, se encuentran los parámetros geométricos de las estructuras optimizadas involucradas en los perfiles de energía potencial de la Figura 2.2. Al comparar la estructura de los reactivos protonados en los estados singulete (cf. Figura 2., pág. 37) y triplete, puede verse que la longitud del enlace N-O es mayor en este último, perdiéndose la coplanaridad del enlace con el anillo aromático, es decir, presentando una deformación en el ángulo diedro O-N-C2-C3. Con respecto a las 42

60 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 estructuras de los estados de transición, puede verse que se parecen a los cationes precursores tripletes pero con una longitud mayor del enlace N-O. Por otro lado, para los productos provenientes de la pérdida de agua, la corta distancia encontrada para el enlace C-O (~.2 Å) sugiere estructuras quinoidales para estos iones con deslocalización de carga sobre el carbono para al oxígeno (es decir, estructuras semejantes a cationes azaciclohexadienonilos), en acuerdo con las estructuras descritas para el ion 2-piridinil oxenio 92. Figura 2.3. Detalles geométrícos de las estructuras optimizadas más relevantes de la Figura 2.2, mostrando las distancias de enlace C2-C3, N-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro O-N-C2-C3 en grados obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-3++G(d,p). En la Figura 2.4 se muestran las SEPs de los cationes I+H y III+H para los estados fundamental singulete y excitado triplete, exploradas aumentando paso a paso la longitud del enlace que se rompe (N-O) y variando el ángulo diedro O-N-C2-C3, mientras se optimizaban todo el resto de las coordenadas a cada dada longitud de enlace y ángulo diedro. A lo largo de la elongación del enlace N-O, la SEP explorada para el estado fundamental singulete y el estado excitado triplete se cruzan en un 43

61 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina cierto punto que corresponde a una longitud del enlace N-O de aproximadamente 2. Å (Figura 2.4). Sin embargo, los valores de energía en estos puntos de cruce son muy similares para ambos isómeros, ya que se encuentran cerca de los respectivos productos y así, este mecanismo no provee justificación para las diferencias observadas. Por otro lado, la transición vertical singulete-triplete, a pesar de ser más energética, reproduce las diferencias encontradas previamente para las barreras energéticas de disociación a partir de las estructuras I+H y III+H. Figura 2.4. Exploración de las SEP para las estructuras: I+H (gráficos a y b) y III+H (gráficos c y d), comprendiendo los estados electrónicos excitado triplete (gráficos a y c) y fundamental singulete (gráficos b y d). En los gráficos se representa la energía (en kcal mol - ) versus la distancia N-O (en Å) y el ángulo diedro O-N-C2-C3 (en ). Los resultados obtenidos respaldan la implicación del estado excitado triplete de menor energía en la disociación del radical hidroxilo para los compuestos estudiados. Este estado excitado ya ha sido invocado para explicar la pérdida de radicales halógeno en halopiridinas protonadas 93 y la pérdida de radicales bencilo a partir de iones piridinio sustituídos 88. El mecanismo presentado resulta consistente con los datos experimentales aunque no es posible excluir la ocurrencia de otros caminos. Por 44

62 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 el momento, no se cuentan con datos de otros estudios mecanísticos en N-óxidos para contrastar los resultados Complejación con metales A causa de las conocidas propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina, análogo heterocíclico de los ácidos hidroxámicos, los complejos con metales divalentes y trivalentes de este compuesto han sido estudiados por diversos métodos en solución 6,6,62. Por otro lado, resulta interesante la posibilidad de estudiar complejos metálicos formados en solución a través del empleo de técnicas de análisis en fase gaseosa como la espectrometría de masa 94 debido a que la caracterización de los aductos formados con distintos iones metálicos por ESI en combinación con espectrometría de masa tándem ha permitido la distinción de isómeros, por ejemplo en trinorbornanodioles 38 y diglicósidos de flavonoides 39. Teniendo en cuenta todo lo anterior, se estudiaron por ESI los complejos formados por los compuestos y 2 con distintos cationes metálicos trivalentes y divalentes con el fin de evaluar su diferenciación por esta metodología. Para esto, se registraron los espectros de masa de mezclas preparadas a partir de soluciones metanólicas de cada compuesto con soluciones acuosas de las sales de los distintos metales estudiados. Las condiciones experimentales empleadas se describen en el capítulo 5 (sección 5..2, pág. 28) Metales trivalentes La característica clave de los espectros de masa obtenidos usando ESI con los iones metálicos trivalentes: aluminio, hierro y galio, fue la presencia de una especie predominante para cada isómero. Para el isómero 2, la especie predominante fue la molécula protonada, mientras que el aducto constituido por dos ligandos (L) desprotonados unidos al catión metálico (M) dominó los espectros del isómero que se pueden observar en la Figura 2.5. Previamente, este mismo aducto [M+2L-2H] +, había sido informado en los espectros de masa obtenidos por ESI de soluciones de aluminio (III) con otro ligando isomérico, 2,3-dihidroxipiridina

63 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina [%] a) [M+2L-2H] Intensidad relativa [2M+3L+ X+H 2O-H] [2M+4L+ H 2O-5H] [2M+5L-5H] m/z [%] b) [M+2L-2H] Intensidad relativa [L+H] [M+L+X+ H 2O-H] [2M+4L+X-4H] m/z [%] c) [M+2L-2H] Intensidad relativa [L+H] [M+L+X+ H 2O-H] m/z Figura 2.5. Espectros de masa ESI del N-óxido de 2-hidroxipiridina (L) en presencia de una solución de metal trivalente (M): a) aluminio; b) hierro; c) galio; contra-ion (X): cloruro. La estabilidad relativa de los iones precursores diagnóstico [M+2L-2H] + obtenidos para el isómero fue investigada además por CID. Para ello, se emplearon dos 96 enfoques, determinando el valor de los parámetros E /2, definido como la energía de colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor seleccionado cae al 5%, y CE 27 5, definido como la energía de colisión en la que la proporción subsistente del ion precursor seleccionado al total de iones (SY, survival yield) es de la mitad. 46

64 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 El parámetro E /2 fue extraído de las curvas de disociación graficando la abundancia relativa en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para una abundancia del 5% del ion precursor. Análogamente, el parámetro CE 5 fue extraído de las curvas de disociación graficando la proporción subsistente del ion precursor (SY) en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio, luego de linealizar las mismas mediante una transformación lineal que permite una lectura más precisa del valor de la energía de colisión para una proporción subsistente del 5% del ion precursor. Los detalles acerca de estos parámetros se encuentran en el Apéndice A.3 (pág. 26). En la Figura 2.6 se muestran las curvas de disociación de los iones precursores [M+2L-2H] + a partir de las cuales se estimaron los parámetros mencionados anteriormente. Los valores estimados de E /2 obtenidos para los iones precursores [M+2L-2H] + con M: Fe(III), Al(III) y Ga(III) resultaron 6, 23 y 25 ev, respectivamente, mientras que los valores de CE 5, 7.5 y 2 ev, respectivamente. Por lo tanto, ambos enfoques son concordantes arrojando la misma tendencia relativa: Ga(III) > Al(III) > Fe(III). Resulta interesante comparar la estabilidad frente a la disociación en fase gaseosa de los aductos iónicos anteriores con respecto a la constante de estabilidad en solución de los mismos complejos. El orden relativo de constantes de estabilidad para los complejos compuestos por dos ligandos desprotonados de y un metal trivalente sigue la tendencia: Fe(III)>Ga(III)>Al(III) 6, considerando ya sea la disociación de un ligando o de ambos del complejo. La discrepancia entre esta tendencia y las obtenidas por E /2 o CE 5 puede entenderse teniendo en cuenta que la estabilidad en fase gaseosa tiene en cuenta todos los caminos de disociación accesibles por la energía interna del ion, y no sólo la pérdida intacta de los ligandos como ocurre en solución. La diferenciación por ESI-MS entre los compuestos y 2 fue puesta de relieve empleando soluciones de los mismos adicionadas con soluciones de los metales trivalentes aluminio, hierro y galio. Así, en el caso del isómero, se observó en los espectros un ion aducto predominante [M+2L-2H] +, cuya estabilidad fue caracterizada para cada metal a partir de la energía de disociación en fase gaseosa, mientras que en el caso del isómero 2, no se observaron iones aducto con metales en los espectros de masa ESI de las soluciones sino simplemente la molécula protonada. 47

65 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Abundancia relativa ion precursor (%),,8,6,4,2 m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga, Energía de colisión (ev) a) Proporción subsistente del ion precursor (SY),,8,6,4,2, Energía de colisión (ev) m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga b) ln[(-sy)/sy] m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga Energía de colisión (ev) c) Figura 2.6. Curvas de abundancia relativa (a); curvas de proporción subsistente (SY) (b); y transformación lineal de las curvas de proporción subsistente (SY) (c) de los iones precursores [M+2L-2H] + en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio medidas para el compuesto. El tratamiento con escandio (III) se discute separadamente en la sección a continuación, junto con los metales divalentes, por las características que presentó en común con ellos Metales divalentes (y escandio) Los espectros de masa obtenidos con cationes metálicos divalentes exhibieron varias especies características para cada isómero. La confirmación de las asignaciones se basó en las relaciones masa/carga (m/z) obtenidas con alta resolución/precisión, en los espectros de masa de iones producto obtenidos por CID y 48

66 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 en el análisis de los patrones isotópicos característicos de ciertos metales. Se muestra como ejemplo en la Figura 2.7 el perfil isotópico del ion [M+2L-H] + (siendo M: Zn(II) y L: el compuesto ), correspondiente a una ampliación del espectro de la Figura 2.2- b). Este perfil característico se origina debido a los cinco isótopos naturales que presenta el zinc en relación /57.4/8.4/38.7/.2 para M/M+2/M+3/M+4/M+6. En el Anexo (págs ) se pueden observar los perfiles isotópicos de los elementos químicos usados en este trabajo. [%] Intensidad relativa m/z Figura 2.7. Ampliación del espectro de masa ESI obtenido a partir del N-óxido de hidroxipiridina (L) en presencia de una solución del metal divalente zinc (M), mostrando el patrón isotópico del ion aducto [M+2L-H] +. Los cationes de metales alcalino-térreos mostraron un comportamiento ligeramente diferente que los de metales de transición. Esto se ilustra en los espectros de masa mostrados en la Figura 2.8, donde se muestran el calcio y el cobre como ejemplos. Las principales características de los espectros de masa obtenidos con los distintos iones metálicos estudiados se encuentran resumidas en las Tablas 2. y 2.2 y los espectros de masa restantes se muestran en las Figuras Los principales aductos con cationes metálicos observados para el isómero con metales alcalino térreos (calcio y magnesio) fueron iones mono cargados con hasta tres ligandos incluyendo una molécula de agua. En cambio, los metales de transición con el isómero presentaron aductos con dos centros metálicos y tres ligandos desprotonados, además de una importante abundancia de iones mono cargados con hasta dos ligandos incluyendo una molécula de agua. 49

67 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina En el caso del isómero 2, los iones aducto doblemente cargados, [M+2L+2H 2 O] ++ y [M+3L+H 2 O] ++, fueron predominantes con los metales alcalino térreos, mientras que las especies mono cargadas con cloruro unido, [M+L+Cl+H 2 O] + y [M+2L+Cl] +, resultaron importantes para metales de transición como el cobalto y zinc (Figuras 2.2 y b). Un comportamiento similar en la complejación ha sido informado previamente para un ligando monodentado diferente, 3-azidopropionitrilo 97,98 con metales como calcio, magnesio, cobalto y níquel. Como casos excepcionales, iones mono cargados resultantes de la reducción de Cu (II) a Cu (I) fueron detectados para el isómero 2 en el caso del cobre, el cual es conocido por su facilidad para reducirse durante el proceso de electrospray 99. En el caso del níquel, fueron detectadas las especies doblemente cargadas antes mencionadas, aunque mucho menos intensas en comparación con la molécula protonada del isómero 2 (Figura a). El vanadilo (Figura 2.2a) exhibió varios aductos mono cargados resultantes de la reducción (pérdida de oxígeno) u oxidación en el caso del isómero, de manera consistente con la variedad de estados de oxidación alcanzables por el vanadio, mientras que para el isómero 2 se observó principalmente la molécula protonada. Los iones aducto exhibidos con escandio en los espectros de masa fueron reminiscentes de aquellos observados con los sistemas de metales divalentes con cloruros, donde el contra-ion permanece unido en el aducto, a pesar de la naturaleza trivalente de este catión metálico. Más aún, la incorporación adicional de varias moléculas de solvente (es decir, agua y metanol) en los iones aducto observados con este metal complicó el aspecto de los espectros de masa (Figura b). A pesar de la similitud en estequiometría entre los iones aducto con cationes metálicos observados para los isómeros y 2, al comparar las Tablas 2. y 2.2 se puede notar que los aductos de contienen ligandos desprotonados mientras que los de 2 mostraron a los ligandos en su forma neutra. Estas diferencias entre ambos compuestos podrían explicarse considerando la capacidad del isómero de formar quelatos estables actuando como un ligando bidentado al desprotonarse (tipo hidroxamato ), en contraste a su isómero 2. 5

68 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Tabla 2.. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI del isómero (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm). Ion/Metal M 24 Mg 4 Ca 5 VO [L+H] (4.2) [M+L-H] (2.) (2.2) c (.6) (.4) (.7) [M+L+H 2O-H] (3.) c (.) (2.3) (.7) (.) [M+L+MeOH-H] (.4) [M+L+2H 2O-H] (3.5) c (.) (.2) [M+2L-H] (.2) (2.) (.5) c (3.4) (2.6) (3.5) (2.4) [M+2L-2H] Co 58 Ni 63 Cu 64 Zn 45 Sc (2.5) b (3.) b (.2) [M+2L+H 2O-H] (2.3) (3.) (2.) c [M+3L-H] (.3) (3.7) [2M+3L-3H] (.8) (.) (.) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observaron: (2.5) [M+L+X+H 2 O+MeOH-H] + y (.3) [M+L+H 2 O+MeOH-H] +. c Se observan iones implicando la pérdida de un átomo de oxígeno. Tabla 2.2. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI del isómero 2 (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm). Ion/Metal M/ Contra-ion X 24 Mg Cl 4 Ca 5 VO Cl SO 4 Cl SO 4 SO 4 Cl [L+H] (.) (.) (3.2) (6.2) (2.2) (8.) (3.8) [M+L+H 2O-H] (.7) c (2.4) Co [M+L+X] (4.7) 58 Ni 63 Cu [M+L+X+H 2O] (3.3) [M+2L] (2.3) c [M+2L+2H 2O] (.6) (.9) [M+2L+X] (.8) [M+2L+H 2O+X] Zn (4.2) (.4) (2.5) 45 Sc CF 3SO (3.8) (.3) b (.7) b (5.5) [M+3L+H 2O] (.4) (.) (.6) (3.4) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observa: (3.9) [M+L+X+H 2 O+MeOH-H] +. c Se observan iones conteniendo especies de Cu(I). 5

69 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Intensidad relativa [%] a) [L+H] [M+L-H] [M+2L-H] [M+3L-H] m/z [%] a) [M+2L+2H 2O] Intensidad relativa [L+H] [M+3L+H 2O] m/z Intensidad relativa [%] b) [L+H] [M+L+H 2O-H] [M+2L-H] [2M+3L-3H] m/z Intensidad relativa [%] b) [L+H] [M+L+H 2O] [M+2L] [M+4L-H] m/z 2 Figura 2.8. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina y 2 (L) en presencia de una solución de metal divalente (M): a) calcio; b) cobre. 52

70 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 [%] a) [M+3L-H] Intensidad relativa [L+H] [M+2L+H 2O-H] [2M+4L-3H] m/z Intensidad relativa [%] a) 2 [L+H] [M+3L+H 2O] [M+2L+2H 2O] [M+2L+X+H 2O] m/z Intensidad relativa [%] b) [M+L+CH 3OH+H 2O-2H] [M+F+2CH 3OH-H] [M+L+X+CH 3OH+H 2O-H] [M+2X+2CH 3OH] m/z Intensidad relativa [%] b) 2 [L+H] [M+X+2CH 3OH+H 2O-H] [M+L+X+H 2O CH 3OH-H] [M+2X+2CH 3OH] [M+L+2X+H 2O] m/z [M+2L+2X] Figura 2.9. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina y 2 (L) en presencia de una solución de metal divalente (M): a) magnesio; b) escandio; contra-iones (X): a) cloruro; b) triflato. 53

71 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Intensidad relativa [%] a) [M+2CH 3OH-H] [M+L+H 2O-H-O] [M+2L-2H] [M+3L-3H-O] [2M+3L-3H] m/z [%] a) 2 [L+H] Intensidad relativa [M+X+H 2O+H] m/z Intensidad relativa [%] b) [M+L+H 2O-H] [M+2L-H] [2M+2L+X+ H 2O-2H] [2M+3L-3H] m/z [3M+2L+3X +H 2O-2H] [%] b) 2 [L+H] [M+L+X+H 2O] [M+2L+X] Intensidad relativa [2M+L+3X+2H 2O] [2M+2L+3X] m/z Figura 2.2. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina y 2 (L) en presencia de una solución de metal divalente (M): a) vanadilo; b) cobalto; contra-iones (X): a) sulfato; b) cloruro.

72 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 [%] a) [L+H] Intensidad relativa [M+L+H 2O-H] [M+2L-H] [2M+3L-3H] m/z [%] a) 2 [L+H] Intensidad relativa [M+3L+H 2O] [M+4L] 2+ [M+2L+H2O-H] [M+3L-H] [M+4L-H] m/z Intensidad relativa [%] b) [L+H] [M+L+H 2O-H] [M+2L-H] [2M+3L-3H] m/z Intensidad relativa [%] b) 2 [L+H] [M+L+X] [M+2L-H] [M+2L+X] [M+3L+X] m/z Figura 2.2. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina y 2 (L) en presencia de una solución de metal divalente (M): a) niquel; b) zinc; contra-iones (X): a) sulfato; b) cloruro. 55

73 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina De manera general, ambos isómeros pudieron diferenciarse en todos los casos por sus espectros de masa ESI sin importar la identidad del catión metálico utilizado para obtenerlos. A diferencia de otros trabajos que emplearon la complejación con metales en combinación con ESI 38,39, en este caso, no fue necesario recurrir al empleo adicional de la espectrometría de masa tándem para lograr la diferenciación de isómeros, ni al empleo de ligandos adicionales, simplificando de esta manera el análisis de los compuestos estudiados Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional Se buscó el respaldo de cálculos teóricos con el fin de comprender mejor el comportamiento diferente de los isómeros y 2 frente a la complejación con los distintos metales. En particular, se escogió el calcio (II) como arquetipo ya que este metal, entre los cationes metálicos estudiados, presenta un número de electrones intermedio, simplificando el sistema y así disminuyendo los tiempos de cálculo, destacándose además por los resultados antes provistos. Vale la pena recordar, como se observa en la Figura 2.8a, que los principales y únicos complejos observados en los espectros de masa de con calcio fueron cationes mono cargados con hasta 3 ligandos, incluyendo hasta una molécula de agua. En cambio, en el caso de 2 resultaron importantes los cationes dicargados con dos ligandos, con una baja abundancia relativa de cationes monocargados consistentes en complejos coordinados a un único ligando y más de una molécula de agua. Por razones comparativas, entre el conjunto de iones obtenido para ambos isómeros, se escogió la estequiometría de los complejos con dos ligandos debido a la abundancia relativa que presentaron estas especies en los espectros de masa de ambos compuestos y por presentar una complejidad intermedia entre los complejos más pequeños con ligando y los más grandes con 3 ligandos observados (Tablas 2. y 2.2). A pesar de la intervención de las moléculas de agua en muchos complejos, como se observa en las Tablas 2. y 2.2, las mismas fueron excluidas de este modelo. Esta simplificación apunta a capturar las características esenciales de los sistemas con la ventaja de una reducción en los grados de libertad y así en el tiempo de cálculo. El propósito de este estudio fue obtener un conjunto de estructuras y energías de los posibles complejos neutros, monocargados y dicargados de calcio con dos 56

74 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 ligandos para determinar la estabilidad de los diferentes iones aducto formados con cada isómero y explicar los resultados obtenidos experimentalmente. Como punto de partida para facilitar los cálculos subsiguientes, se comenzó con los complejos sin carga neta (neutros), ya que los complejos con carga pueden obtenerse por protonaciones sucesivas a partir de los primeros Estructuras de los complejos neutros La caracterización de las estructuras relevantes de los complejos de calcio con dos ligandos correspondientes a los isómeros o 2, fue llevada a cabo empleando el mismo nivel de teoría descrito en la sección 2.3., B3LYP, pero sin incorporar funciones difusas sobre los átomos de hidrógeno, aligerando así el tamaño de la base, 6-3+G(d,p). El análisis de frecuencias armónicas de las estructuras estacionarias obtenidas fue realizado para completar la caracterización de los mínimos locales. A partir de las optimizaciones de geometría realizadas para los complejos neutros se obtuvieron las estructuras que se muestran en la Figura Los prefijos I (N-O) y II (C-O) son usados para indicar cuáles son los átomos de oxígeno involucrados en los diferentes modos de coordinación obtenidos para el isómero 2, que se comporta como un ligando monodentado. Los ángulos y longitudes de enlace más relevantes para caracterizar las estructuras halladas se encuentran resumidos en el Capítulo 5 (Tabla 5.4, pág. 248). Dos complejos enantioméricos C fueron hallados para el isómero (se muestra solo uno en la Figura 2.22), conteniendo ambos ligandos coordinados al ion metálico a través de todos los átomos de oxígeno. De esta forma, la geometría que presenta el complejo resulta de tipo tetraédrica, con un ángulo de 93º entre los planos de los anillos aromáticos. Dicha coordinación inusual ha sido informada recientemente para complejos de calcio con cafeatos. Por otro lado, la exploración exhaustiva de los complejos del isómero 2 reveló la imposibilidad de este ligando de coordinarse de modo bidentado usando ambos átomos de oxígeno. En cambio, se encontraron tres complejos distintos, I,I -2C, I,II -2C y II,II -2C, que presentaban modos de coordinación alternativos con el catión calcio unido a los dos ligandos a través de un único átomo de oxígeno de cada uno (Figura 2.22). 57

75 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Figura Geometría optimizada de las estructuras de los complejos neutros con calcio y dos ligandos de y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas al complejo más estable del isómero 2 en kcal mol -. De esta manera, fueron obtenidas una y tres estructuras para los complejos neutros de calcio formados a partir de los compuestos y 2, respectivamente. Desafortunadamente, no se cuenta con datos de literatura referidos a la estructura de estos complejos para comparar con las estructuras aquí calculadas. A continuación se presenta la generación de las estructuras de los complejos mono- y di- cargados a partir de las estructuras previas calculadas Sitios de protonación de los complejos La identificación de los sitios de protonación más probables se llevó a cabo aplicando la misma metodología empleada en la sección 2.3. (pág. 34), con la excepción de que se omitió la estimación de la función condensada electrofílica de Fukui a partir de orbitales moleculares frontera para alivianar los cálculos. Por lo tanto, empleando la aproximación de diferencias finitas con las cargas obtenidas a partir de MPA y NPA, se estimó la función condensada de Fukui para las estructuras C; I,I -2C; I,II -2C y II,II -2C (Figura 2.23). En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores obtenidos a partir de los cálculos (Tabla 5., pág. 244). 58

76 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2,2 C,2 I,I'-2C MPA NPA Función condensada de Fukui (f K -),5,,5,,5,,5, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k),2 I,II'-2C,2 II,II'-2C MPA NPA Función condensada de Fukui (f K -),5,,5,,5,,5, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) Figura Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (f - K ) para los complejos neutros con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA) para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). A la vista de los resultados mostrados en la Figura 2.23, se puede ver cómo los átomos de oxígeno son los sitios de protonación más probables en todos los casos, difiriendo la identidad de los mismos según el complejo. Es interesante notar que aunque se observan ligeras diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias finitas obtenidas por MPA y NPA, ambas mostraron la misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación. Cabe destacar que los sitios más favorables, en el caso del complejo formado con el isómero, son los átomos de oxígeno del grupo N-óxido mientras que para el isómero 2, son los átomos de oxigeno no coordinados al calcio. 59

77 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Luego, se produjeron los cationes precursores por protonación de C, así como de I,I -2C; I,II -2C y II,II -2C, de acuerdo a las posiciones más probables previamente calculadas. En cada caso, se exploró más de una conformación de partida luego de la protonación. De acuerdo a los estudios conformacionales realizados para los N-óxidos de hidroxipiridina y 2 protonados y presentados en la sección 2.3. (pág. 34), en caso de protonarse el oxígeno del sustituyente aromático, las conformaciones estables corresponden a la ubicación del hidroxilo coplanar con el anillo aromático, mientras que el oxígeno protonado del grupo N-óxido puede orientarse casi perpendicular al anillo aromático, o ubicarse coplanar con el mismo. Por ende, en todas las geometrías de partida para cada uno de los complejos monocargados, se tuvieron en cuenta estos antecedentes. Las estructuras optimizadas de las conformaciones estables encontradas para los complejos monocargados se muestran en las Figura Los sufijos IH (N-O) y IIH (C-O) son usados para indicar la identidad del átomo de oxígeno protonado, mientras que las distintas conformaciones correspondientes a modos de coordinación y átomos protonados idénticos, es decir, aquellas cuyos nombres poseen iguales prefijos y sufijos, se distinguen con una letra minúscula. Las longitudes de enlace más relevantes de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de y 2 se muestran en el Capítulo 5 (Tablas 5.6 y 5.7, págs ). La protonación de C de acuerdo a las posiciones más probables condujo a tres conformaciones: C-IHa, C-IHb y C-IHc (Figura 2.24). Además, la protonación en el átomo de oxígeno del sustituyente del anillo aromático, luego de las optimizaciones de geometría, resultó en tres conformaciones adicionales, C-IIHa, C-IIHb y C-IIHc, que se calcularon a fin de comparar sus energías relativas con las anteriores. A partir de la protonación de los complejos de 2C con distintos modos de coordinación, de acuerdo a las posiciones más favorables, se obtuvieron seis conformaciones con distintas estabilidades relativasμ I,I -2C-IIHa, I,II -2C-IIHa, I,II -2C-IIHb, II,II -2C-IHa, II,II -2C-IHb y II,II -2C-IHc (Figura 2.24). El análisis de los resultados energéticos obtenidos para las conformaciones encontradas de los complejos monocargados de cada isómero (Figura 2.24), revela que las más estables corresponden a geometrías donde es posible la formación de un puente de hidrógeno intermolecular entre ambos ligandos. 6

78 6 Figura Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol -. Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2

79 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina En el caso de los complejos de calcio con el isómero, se hallaron dos conformaciones que presentaban este tipo de interacción (C-IHa y C-IHb), mientras que en las restantes, ambos ligandos se encontraban cerca de la coplanaridad, ya sea con número de coordinación (NC) 4 (C-IIHa y C-IIHb), o NC 3 (C-IHc y C-IIHc). Cuatro conformaciones con puentes de hidrógeno intermoleculares fueron halladas para los complejos de calcio con el isómero 2, una para cada uno de los modos de coordinación encontrados en los complejos neutros (I,I -2C-IIHa; I,II -2C-IIHa y II,II - 2C-IHa), además de II,II -2C-IHb, que resultó muy similar y ligeramente superior en energía que II,II -2C-IHa. En este caso, las estructuras sin puentes de hidrógeno (I,II - 2C-IIHb y II,II -2C-IHc) resultaron más extendidas como cabe esperar de la ausencia de interacciones adicionales entre ambos ligandos. En la siguiente etapa, las estructuras de los complejos dicargados fueron optimizadas luego de protonar los complejos monocargados de acuerdo a las posiciones más probables calculadas. Con el fin de reducir el número de cálculos, se seleccionaron dos estructuras distintivas y representativas entre aquellas de menor energía para los complejos monocargados de cada isómero, C-IHa y C-IHb para y I,II -2C-IIHa y II,II -2C-IHa para 2. Los índices de las funciones electrofílicas condensadas de Fukui fueron obtenidos de manera análoga a la descrita previamente. En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores obtenidos a partir de los cálculos (Tabla 5.2, pág. 245). En la Figura 2.25 se muestran los índices obtenidos a partir de estos cálculos que muestran nuevamente que los átomos de oxígeno son los sitios de protonación más probables en todos los casos, y en particular aquellos pertenecientes al ligando que previamente no se hallaba protonado debido a que para estos átomos se obtiene el mayor valor de f - K. Sin embargo, es interesante notar que algunos átomos de carbono, pertenecientes al ligando no protonado en la primera etapa, exhiben valores altos también, aunque menores que los correspondientes a los átomos de oxígeno. Este comportamiento podría atribuirse al bien conocido fuerte efecto orto- y para- director del grupo hidroxilo (o hidroxilo desprotonado) que incrementa el carácter nucleofílico en las posiciones orto y para del anillo aromático. Nuevamente, a pesar de notar ligeras diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias finitas obtenidas por MPA y NPA, se observa que ambas muestran la misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación. 62

80 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2,3 C-IHa,3 C-IHb MPA NPA Función condensada de Fukui (f K -),2,,,2,, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k),3 I,II'-2C-IIHa,3 II,II'-2C-IHa MPA NPA Función condensada de Fukui (f K -),2,,,2,, N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) N- C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II') Sitio (k) Figura Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (f - K ) para los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA) para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). De manera análoga a lo realizado con anterioridad, a partir de la protonación en las posiciones más probables de los correspondientes complejos monocargados fueron exploradas diferentes conformaciones de partida. En esta ocasión, se encontraron menos conformaciones para cada complejo dicargado que para sus precursores. En el caso de I,II -2C-IIHa, se protonó también el oxígeno del sustituyente del anillo aromático, resultando una estructura dicargada adicional (I,II -2C-II,II Ha) calculada a fin de comparar su energía relativa con las restantes. Las estructuras encontradas se muestran en la Figura

81 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Como puede verse en la Figura 2.26, en lo que respecta a las diferencias de energía entre las conformaciones encontradas para los complejos dicargados de cada isómero, se nota que las más estables corresponden a geometrías donde ya no se favorece la interacción mediada por la formación de puentes de hidrógeno entre ambos ligandos. Este comportamiento es contrario al observado previamente para los complejos monocargados. Las longitudes de enlace más relevantes de las estructuras de los complejos dicargados con calcio y dos ligandos de y 2 se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.8, pág. 25). En conexión con las conformaciones obtenidas, los complejos del isómero mostraron ambos ligandos coplanares, resultando más estables aquellas conformaciones de NC 4 y sin puentes de hidrógeno (C-I,II Ha y C-I,I Ha), que aquellas de NC 3 con un puente de hidrógeno intramolecular (C-I,II Hb). Por otra parte, los complejos del isómero 2 que presentan un valor próximo a 9 en el ángulo diedro entre los anillos aromáticos de ambos ligandos y que poseen conformaciones extendidas colineales (I,II -2C-I,IIHa, II,II -2C-I,I Ha y II,II -2C-I,I Hb) presentaron energías menores que aquellas más compactas, donde uno de los átomos de oxígeno protonados se halla coordinado al calcio (I,II -2C-II,II Ha y II,II -2C-I,II Ha). Como se comentó anteriormente, el sitio de protonación más probable de los complejos neutros y monocargados de calcio con los compuestos y 2 fue determinado a partir del análisis de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico, obteniendo luego las estructuras correspondientes a los mínimos de energía de los complejos de calcio con los compuestos y 2 mono- y di- cargados, respectivamente. En la literatura se pueden encontrar aplicaciones previas de las funciones condensadas de Fukui, como por ejemplo, para estudiar los sitios de oxidación y reducción en complejos metálicos macrociclícos de níquel(ii) 2. Sin embargo, no se encontraron antecedentes del empleo de esta metodología de cálculo para la obtención de complejos metálicos de distinta carga a causa del estado de protonación de sus ligandos, como en este caso. 64

82 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Figura Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos dicargados con calcio y dos ligandos de y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol -. 65

83 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Estabilidad de los complejos ionizados Contando con las estructuras de los complejos de calcio mono- y di- cargados conteniendo los compuestos estudiados como ligandos, resta el análisis de su estabilidad relativa para comprender las diferencias observadas en los espectros de masa de cada isómero (Figura 2.8a, pág. 52). En un primer lugar, se analizó la estabilidad relativa de las especies dicargadas frente a la desprotonación por una molécula neutra, generándose así dos moléculas monocargadas. Las posibles moléculas neutras relevantes son los complejos neutros, así como moléculas de solvente presentes en el medio, metanol y agua. Esto conduce a plantear las ecuaciones (2.), (2.2) y (2.3), donde de es la diferencia de energía entre el complejo neutro y el correspondiente complejo monocargado y de 2 es la diferencia de energía entre el complejo monocargado y el correspondiente complejo dicargado, mientras que de H2O y de CH3OH corresponden a la energía de desprotonación de los iones oxonio del agua y metanol, respectivamente. [CaL 2 ] ++ + [CaL 2 2H] 2 [CaL 2 H] + de = de 2 de (2.) [CaL 2 ] ++ + H 2 O [CaL 2 H] + + H 3 O + de = de 2 de H2O (2.2) [CaL 2 ] ++ + CH 3 OH [CaL 2 H] CH 3 OH 2 de = de 2 de CH3OH (2.3) Los valores de energías de desprotonación calculados para los distintos complejos mono- y di- cargados encontrados con cada isómero se muestran en las Tablas 2.3 y 2.4, respectivamente. Puede notarse que los valores hallados para las energías de desprotonación de los complejos monocargados (Tabla 2.3) se encuentran cercanos a los valores absolutos calculados previamente en la sección 2.3. (Figura 2.9, pág. 36) para las energías de protonación de los compuestos (~28-22 kcal mol - ) y 2 (~226 kcal mol - ). En cambio, las energías de desprotonación de los complejos dicargados resultaron mucho menores que las de los respectivos complejos monocargados. Reuniendo los valores de la Tablas 2.3 y 2.4 junto a la ecuación (2.), puede concluirse que en todos los casos, de > de 2, indicando por ende, la incompatibilidad de las especies dicargadas y neutras que, como es esperable, convergen a especies monocargadas. Por otra parte, en ausencia de complejos neutros, deben ser consideradas las moléculas de solvente circundantes. Los valores de literatura 3 para las afinidades 66

84 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 protónicas del agua y metanol son 65.2 kcal mol - y 8.3 kcal mol -, respectivamente. De manera análoga a la empleada para el cálculo de los valores de la Tabla 2.3, las energías de desprotonación de los iones oxonio del agua y el metanol fueron calculados, arrojando los valores de 63.6 kcal mol - y 79. kcal mol -, respectivamente. La concordancia entre los valores calculados (energías a K) y los valores de literatura (entalpías a 298 K) aporta sustento al modelo utilizado para los cálculos, en el cual el efecto de las correcciones térmicas y entálpicas parecería cancelarse al calcular la diferencia de energías. Sin embargo, la omisión de la entalpía traslacional del protón (5/2RT), que es la contribución térmica más importante (.5 kcal mol - ) 4, probablemente explicaría los valores sistemáticos menores de las energías calculadas en comparación con las afinidades protónicas. Tabla 2.3. Energías de desprotonación (kcal mol - ) para los complejos de calcio monocargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina. Complejo de Complejo de C-IHa 29.9 I,I -2C-IIHa 259. C-IHb 28.7 I,II -2C-IIHa C-IHc 24. I,II -2C-IIHb C-IIHa 24.4 II,II -2C-IHa C-IIHb 24.4 II,II -2C-IHb C-IIHc 2.2 II,II -2C-IHc 238. de : diferencia de energía entre el complejo neutro y el correspondiente complejo monocargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Tabla 2.4. Energías de desprotonación (kcal mol - ) para los complejos de calcio dicargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina. Complejo de 2 Complejo de 2 C-I,II Ha 46. I,II -2C-I,IIHa 82.3 C-I,II Hb 36.8 I,II -2C-II,II Ha 42.5 C-I,I Ha 46. II,II -2C-I,II Ha 39.5 II,II -2C-I,I Ha 79. II,II -2C-I,I Hb 79. de 2 : diferencia de energía entre el complejo mono- y el correspondiente complejo di- cargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). 67

85 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Comparando los valores obtenidos para las moléculas de solvente con aquellos calculados en la Tabla 2.4 para los complejos dicargados más estables de cada isómero, se observa que los complejos de 2 son estables frente a la desprotonación por el solvente (de 2 -de sv > ), mientras que los de no lo son (de 2 < 65 kcal mol - ), como se deduce a partir de las ecuaciones (2.2) y (2.3). Estos resultados sugerirían una posible explicación para las diferentes especies cargadas observadas en los espectros de masa de ambos isómeros, es decir, por qué las especies dicargadas son las más importantes entre los complejos de 2 con calcio, mientras que no se observan para (Figura 2.8a, pág. 52). Finalmente, se investigó la estabilidad de los complejos monocargados relativa a su formación a partir de los dos ligandos neutros más el catión Ca(II), según la siguiente expresión: EC = E C + E H E Ca(II) 2 E L (2.4) donde E C es la energía calculada del complejo, E H la energía del protón, E Ca(II) la del catión calcio aislado, y E L la de la conformación más estable del correspondiente ligando neutro. Cabe notar que para balancear la masa y carga es necesario incluir un protón entre los productos aunque como la energía electrónica del protón es cero no afecta el resultado. Comparando los valores de energías de complejación EC de la Tabla 2.5 para cada isómero puede observarse la mayor estabilidad de los complejos monocargados formados con calcio a partir de dos ligandos neutros de frente a los formados a partir de 2. Dicha estabilización puede comprenderse en términos de las estructuras y modos de coordinación hallados en los complejos monocargados formados con cada isómero (Figura 2.24). Vale la pena recordar que en el caso de los complejos del isómero, el calcio presentó NC entre 3 y 4, mientras que los complejos del isómero 2 presentaron al calcio con un NC máximo de 2. Es interesante notar también que, en el espectro de masa del isómero 2 con calcio, los aductos monocargados presentaron una abundancia relativa baja, mientras que fueron las especies más importantes observadas en el caso del isómero (Figura 2.8a, pág. 52). Así, las energías de complejación calculadas podrían ser un indicio para explicar la diferencia observada entre los espectros de masa de ambos isómeros. 68

86 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 Tabla 2.5. Energías de complejación (kcal mol - ) para los complejos de calcio monocargados con dos ligandos. Complejo EC Complejo EC C-IHa I,I -2C-IIHa 3.23 C-IHb I,II -2C-IIHa C-IHc -24. I,II -2C-IIHb 4.9 C-IIHa II,II -2C-IHa C-IIHb II,II -2C-IHb -4. C-IIHc -2.3 II,II -2C-IHc.2 EC: diferencia de energía entre el complejo monocargado y sus dos ligandos neutros más el ión calcio calculada de acuerdo a la ecuación (2.4) al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). El análisis de la estabilidad relativa de las estructuras en fase gaseosa de los posibles complejos de calcio formados con cada isómero constituyó una herramienta valiosa para comprender las diferencias observadas en los espectros de masa obtenidos a partir de las soluciones de este metal y cada compuesto. Si bien este es un caso particular donde fue posible explicar los resultados experimentales obtenidos mediante cálculos sobre un sistema modelo y no se encontraron antecedentes de un análisis similar en otros estudios, los resultados son alentadores y sugerirían que podría aplicarse la metodología de manera análoga a sistemas formados con otros iones metálicos Conclusiones El comportamiento disociativo en modo de iones positivo de dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina protonados utilizando CID mostró dos caminos de fragmentación: la pérdida del radical hidroxilo y la pérdida de agua. Contrariamente a lo que cabría esperar de la regla de paridad electrónica, el primer camino dominó los espectros de masa tándem a diferentes energías de colisión para cada isómero. Sin embargo, ambos isómeros pudieron ser diferenciados comparando la relación de intensidades del ion precursor y del ion fragmento correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo a energías de colisión mayores a 3 ev. 69

87 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina El comportamiento con las distintas fuentes de ionización utilizadas (ESI, APCI y APPI) resultó similar, confirmando los resultados obtenidos. A partir de experimentos variando la temperatura de la fuente de APCI se observó además que la activación térmica no es un factor importante en los caminos de disociación estudiados. Por otra parte, al repetir los experimentos de espectrometría de masa tándem con los compuestos marcados con deuterio, la pérdida del radical OD y/o OH constituyó el principal camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a la que prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin deuterar. La pérdida preferencial del radical hidroxilo y los principales caminos de disociación de los isómeros protonados de los N-óxidos de hidroxipiridina fueron explorados a partir de cálculos computacionales. Analizando la estabilidad relativa de los posibles isómeros y sus productos de disociación primarios, se determinó que el grupo hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido, que resultó el sitio de protonación más favorable de los N-óxidos de hidroxipiridina, y que ya se encuentra protonado en el tautómero a, -hidroxipiridina-2-ona. La exploración de la SEP que comprende el estado fundamental singulete y el primer estado excitado triplete para los compuestos protonados permitió observar una diferencia en la barrera energética para la pérdida del radical hidroxilo entre ambos isómeros cercana a kcal mol -. Los resultados de los cálculos sugieren que la fragmentación podría ocurrir desde el primer estado excitado triplete de los compuestos protonados. Si bien no se pueden excluir otros mecanismos, el estudiado permite interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa tándem de cada isómero. La complejación con iones metálicos permitió la diferenciación de ambos isómeros a partir de los iones aductos generados por electrospray. En el caso del N-óxido de la 2-hidroxipiridina, se observaron principalmente aductos monocargados conteniendo uno o dos ligandos desprotonados con metales divalentes y trivalentes, respectivamente. En cambio, para el N-óxido de la 3-hidroxipiridina 2 con metales divalentes se observaron aductos mono- o di- cargados con el ligando siempre en su forma neutra, y sólo la molécula protonada fue observada cuando se emplearon metales trivalentes. 7

88 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2 La exploración del caso particular de la complejación diferencial del calcio (II) con ambos isómeros mediante cálculos computacionales permitió lograr un mejor entendimiento de las diferencias observadas en los espectros de masa de cada isómero con metales. De esta manera, el análisis de la estabilidad relativa de los posibles complejos de calcio formados con cada isómero se relacionó con la observación de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada compuesto. Los resultados de los cálculos sugieren que la capacidad del isómero de formar quelatos estables actuando como ligando bidentado estabilizaría la formación de especies monocargadas debido a la presencia de interacciones de puente de hidrógeno intermoleculares. Sin embargo, estas interacciones (puentes de hidrógeno) se pierden en las especies dicargadas, resultando éstas inestables frente a la desprotonación por moléculas de solvente. Por el contrario, el isómero 2 se comporta como un ligando monodentado, y los cálculos de energías sugieren una formación desfavorable de los complejos monocargados a partir de los ligandos neutros y el catión calcio. En cambio, los complejos dicargados mostraron ser estables frente a la desprotonación por moléculas de solvente, dando un indicio de la importancia de estas especies en el caso del compuesto 2. Los resultados presentados en este capítulo dieron origen a 2 publicaciones: Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. An experimental and computational study on the dissociation behavior of hydroxypyridine N-oxides in atmospheric pressure ionization mass spectrometry (2) Journal of Mass Spectrometry 45, pp Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. Differentiation of isomeric hydroxypyridine N- oxides using metal complexation and electrospray ionization mass spectrometry. (2) Journal of the American Society for Mass Spectrometry 22, pp

89 Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina 72

90 Diferenciación de N-óxidos de pirazina 3 Capítulo 3.. Introducción Los N-óxidos de pirazina son heterociclos aromáticos con dos átomos de nitrógeno en las posiciones - y 4-, donde uno de ellos, o ambos, pueden estar oxidados. Son componentes frecuentes en productos naturales y drogas farmacéuticas (Figura 3.), por ejemplo, el ácido aspergílico 5 y el pigmento pulcherrimina 6 son antibióticos biosintetizados por diversos microorganismos incluyendo hongos y bacterias, y el acipimox es una droga sintética, análogo de la niacina, usado como hipolipidémico 7. Las pirazinas son ubicuas en la naturaleza 8 mostrando diversas actividades biológicas 9. Además, han sido detectadas tanto en alimentos frescos como calentados o tostados y debido a sus diversas propiedades, las pirazinas sintéticas son usadas como aditivos en la manufactura de alimentos (por ejemplo, metilpirazina 5 y acetilpirazina 6) mientras que otras son importantes drogas farmacéuticas, como el agente antituberculoso pirazinamida 3 (Figura 3.2). Figura 3.. Estructuras de algunos N-óxidos de pirazinas. El análisis y elucidación estructural de estos compuestos resulta importante en el caso de medicamentos para estudiar su metabolismo y modo de acción, y en el caso de aditivos, para detectar su presencia en alimentos y regular su consumo. Cabe mencionar que en muchos de estos productos, o en sus derivados metabólicos, un 73

91 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina nitrógeno heteroaromático se encuentra como N-óxido y que hay una carencia de métodos generales sencillos que permitan identificar unívocamente cuál es el átomo de nitrógeno oxidado. La confirmación de la estructura final de un compuesto orgánico desconocido es siempre realizada mediante un conjunto de métodos independientes tales como la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) uni- (D) y bi- dimensional (2D) o la cristalografía de rayos X, así como otros métodos espectroscópicos. El término elucidación estructural se refiere generalmente a la identificación estructural de novo, resultando en un conjunto de datos completo con conexiones intramoleculares y las asignaciones estereoquímicas correctas. Tal proceso de identificación sin suposiciones o conocimiento previo alguno es comúnmente el dominio de la espectroscopía RMN. Por ejemplo, el patrón de sustitución de pirazinas di- y tri-sustituídas puede elucidarse por una combinación de métodos de RMN 2. No obstante, cuando se llega a la asignación de la estructura final de N-óxidos de pirazinas sustituídas, una tarea importante es determinar cuál de los dos átomos de nitrógeno se encuentra oxidado, lo cual por lo general es bastante difícil de resolver por otros métodos espectroscópicos o químicos. Es interesante notar que los únicos análisis sistemáticos por MS de N-óxidos de pirazinas se refieren a técnicas de ionización fuerte como EI 3,4, mientras que la mayoría de las metodologías que se desarrollan en la actualidad emplean técnicas de ionización a presión atmosférica. Por consiguiente, se vuelve relevante el desarrollo de estudios con técnicas de ionización más suaves que generan iones precursores menos energéticos. Teniendo presente el objetivo de desarrollar metodologías alternativas para el análisis de compuestos isoméricos, se utilizaron los dos isómeros de N-óxidos de hidroxipiridinas comerciales estudiados en el capítulo 2 como modelo para abordar el estudio de un conjunto de - y 4- N-óxidos de pirazina sustituídas en la posición 2 (Figura 3.2) con sustituyentes diferentes (cloro, amino, metilo, acetilo, carboxilo, hidroxilo, metoxilo, acetamido, -hidroxietilo, metoxicarbonilo y carbamoílo). Estos compuestos fueron sintetizados a partir de pirazinas comerciales como se presenta en la sección 3.2. Estas moléculas difieren en el sustituyente del anillo aromático y en la identidad del átomo de nitrógeno oxidado. 74

92 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 a b R Cl NH 2 CH 3 COCH 3 CO 2H OH OCH 3 NHAc CHOHCH 3 CO 2CH 3 CONH 2 N Figura 3.2. Estructuras de los -N-óxidos a y 4-N-óxidos b de pirazinas 2-sustituídas. Las dos metodologías desarrolladas en el capítulo 2, se aplicaron al estudio de la diferenciación entre los N-óxidos isoméricos de pirazinas 2-sustituídas por MS en las secciones 3.2 y 3.3. Por un lado, se comparó el comportamiento frente a la disociación observada en los espectros de masa tándem de ambos isómeros (sección 3.3) y por el otro, se registraron espectros de masa de cada N-óxido en presencia de soluciones de los cationes metálicos, calcio (II), cobre (II) y aluminio (III), caracterizando y asignando los iones aducto observados por ESI (sección 3.4). Por otra parte, debido a que se pudo contar con los datos espectroscópicos de RMN de los 22 compuestos sintetizados, en la sección 3.5 se empleó la espectroscopía RMN para la diferenciación del conjunto de -N-óxidos de pirazinas 2- sustituídas y sus 4-N-óxidos isoméricos. Para esto, se realizó inicialmente la asignación de los átomos de hidrógeno y carbono así como la posición del grupo N- óxido sin ambigüedades usando técnicas de RMN 2D para cada compuesto del conjunto. Dada la cantidad de compuestos analizada, la varianza de los resultados obtenidos resultó difícil de interpretar de manera convencional. Se decidió entonces realizar un estudio quimiométrico de los resultados. El análisis exploratorio de datos junto a técnicas de reconocimiento de patrones 5 son ampliamente empleados para la interpretación de conjuntos de datos multivariados, puesto que reducen la complejidad de los datos y permiten elucidar rasgos característicos. La aplicación del análisis de componentes principales (PCA) 6 (Apéndice A.4, pág. 26) a la espectroscopía en general y a la espectroscopía de RMN en particular, ha aumentado recientemente con el objetivo de proveer representaciones gráficas valiosas para el análisis de datos multivariados 7,8,9,2,2. 75

93 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina La técnica quimiométrica de PCA, en este trabajo de tesis, se empleó para explorar posibles tendencias que permitan clasificar el comportamiento de los compuestos, así como para racionalizar las diferencias observadas (de acuerdo al sustituyente y posición del N-óxido), tanto en los espectros de masa obtenidos con cada ion metálico (sección 3.4), así como en el conjunto de datos de desplazamientos químicos de 3 C (sección 3.5) Síntesis de los compuestos Los compuestos sintetizados son -N-óxidos (denotados con a) y 4-N-óxidos (denotados con b) de las siguientes pirazinas: 2-cloropirazina (3), 2-aminopirazina (4), 2-metilpirazina (5), 2-acetilpirazina (6), 2-carboxipirazina (7), 2-hidroxipirazina (8), 2- metoxipirazina (9), 2-acetamidopirazina (), 2-(-hidroxietil)pirazina (), 2- (metoxicarbonil)pirazina (2) y 2-carbamoilpirazina (3). Las pirazinas 3, 4, 5, 6 y 7 fueron obtenidas comercialmente, en tanto que, y 2 fueron sintetizadas a partir de 4 2, 6 22 y 7 23, respectivamente. No fue necesario sintetizar los precursores 8, 9 y 3, ya que los productos respectivos se obtuvieron por otras vías. Excepto por los compuestos 6a, a y b, los compuestos restantes han sido previamente sintetizados aunque en algunos casos por metodologías distintas. En el Capítulo 5, (sección 5.6, págs ) se encuentran los detalles de las síntesis empleadas. Dos métodos de N-oxidación difiriendo en el agente oxidante, persulfato de potasio (Método A) 24,25 y ácido 3-cloroperoxibenzoico (Método B) 26 fueron usados. La regioespecificidad en la oxidación por persulfato de potasio en H 2 SO 4 son causadas por los efectos de los sustituyentes atractores de electrones en el C-2 que reducen la basicidad de los átomos de nitrógeno, en particular en la posición orto (N-) 25. En otras palabras, se favorece la protonación del átomo de nitrógeno más básico (N-4) en ácido sulfúrico resultando en la oxidación preferencial del átomo de nitrógeno restante para formar -N-óxidos. El mecanismo de la N-oxidación con ácido 3- cloroperoxibenzoico involucra un ataque nucleofílico del par de electrones libre del nitrógeno sobre el oxígeno más externo del perácido 26. En este caso, la orientación está gobernada por la basicidad relativa de los átomos de nitrógeno. El Método A proporcionó los compuestos 3a, 2a y 2b, a partir de 3 y 2, respectivamente. La falta de selectividad del grupo metoxicarbonilo en 2 fue atribuida 76

94 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 a la pequeña diferencia entre las basicidades de los átomos de nitrógeno que induce este sustituyente 25. Sin embargo, el método no fue adaptable para su empleo con los otros sustituyentes con grupos atractores de electrones como 6, y ya se habían informado previamente intentos fallidos en su utilización con los compuestos 7 y Por otro lado, por el Método B se obtuvieron los compuestos 3b, 4a, 5a, 5b, 6b, a, b, a y b, a partir de las respectivas pirazinas. Las diferencias en las condiciones de reacción empleadas (sección 5.6, págs ), es decir, el solvente y tiempo de reacción, se debieron a diferencias en la solubilidad y reactividad de los distintos compuestos. Como se deduce a partir de los productos obtenidos, los grupos atractores de electrones (3 y 6) favorecen la formación de 4-N-óxidos por la reducción de la basicidad que provocan en el átomo de nitrógeno vecino antes discutida. En cambio, el grupo amino (4) dador de electrones aumenta la basicidad del átomo de nitrógeno adyacente resultando en la formación exclusiva del -N-óxido 26. Los efectos electrónicos de los sustituyentes restantes (5, y ), dadores débiles de electrones, resultaron en una formación competitiva de ambos N-óxidos isómeros. En la Tabla 3. se resumen los procedimientos empleados. Tabla 3.. Derivados sintetizados de los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas a. N Sustituyente R Precursor Reacción -óxido Producto -óxido Precursor Reacción 4-óxido Producto 4-óxido 3 Cl 3 Método A 24 3a 3 Método B 26 3b 4 NH 2 4 Método B 26 4a 3b Amonólisis 27 4b 5 CH 3 5 Método B 26 5a 5 Método B 26 5b 6 COCH 3 a Oxidación 32 6a 6 Método B 26 6b 7 CO 2H 2a Hidrólisis 27 7a 2b Hidrólisis 28 7b 8 OH 3a Hidrólisis 28 8a 3b Hidrólisis 28 8b 9 OCH 3 3a Metanólisis 29 9a 3b Metanólisis 3 9b NHCOCH 3 Método B 26 a Método B 26 b CHOHCH 3 Método B 26 a Método B 26 b 2 CO 2CH 3 2 Método A 25 2a 2 Método A 25 2b 3 CONH 2 2a Amonólisis 3 3a 2b Amonólisis 3 3b a Los -N-óxidos están indicados con a y los 4-N-óxidos con b. 77

95 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Como se deduce a partir de lo anterior, las N-oxidaciones generalmente produjeron mezclas de diferentes N-óxidos, los cuales fueron separados y purificados por técnicas cromatográficas. En general, fue necesario recurrir a cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel con desarrollos sucesivos de la misma placa para conseguir una separación entre los isómeros que permita obtenerlos puros. Algunos de los productos puros de los N-óxidos fueron usados como precursores para la síntesis de los restantes que no pudieron ser obtenidos por los métodos de N- oxidación antes descritos. De esta manera, por simples sustituciones nucleofílicas usando los N-óxidos de la cloropirazina (3a o 3b) como precursores se obtuvieron los derivados con los grupos amino (4b) 27, hidroxilo (8a y 8b) 28 y metoxilo (9a y 9b) 29,3. Por otra parte, utilizando los N-óxidos de la metoxicarbonilpirazina (2a o 2b) como precursores se obtuvieron los productos de hidrólisis (7a 28 y 7b 27 ) y de amonólisis (3a y 3b) 3 de manera directa. Finalmente, para la obtención del compuesto 6a a partir del compuesto 6, fue necesaria una secuencia de reacciones rédox en combinación con N-oxidaciones implicando la utilización del compuesto a Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID A partir de las moléculas neutras 3a-3a; 3b-3b fueron producidas las correspondientes moléculas protonadas en fase gaseosa usando ESI. Las condiciones empleadas para los experimentos fueron idénticas a las empleadas previamente para el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina y 2 y están descritas en el capítulo 5 (sección 5.., pág. 25). El análisis de los espectros de masa tándem obtenidos a partir de los iones precursores [M+H] + de los compuestos 3a-3a y 3b-3b proporciona una primera aproximación a la posible discriminación entre los N-óxidos isómeros de cada par. La estabilidad relativa de estos iones precursores obtenidos para cada compuesto fue investigada por CID a través de la determinación del parámetro E 96 /2, definido como la energía de colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor seleccionado cae al 5%, como ya fue realizado en la sección 2.4. (pág. 46). Este parámetro fue extraído a partir de las curvas de disociación graficando la abundancia relativa del ion precursor en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para una fracción de 5% del ion precursor. Los valores de E /2 obtenidos para los iones 78

96 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 precursores [M+H] + de los compuestos 3a-3a y 3b-3b, junto a los principales canales de fragmentación observados se resumen en la Tabla 3.2. Tabla 3.2. Valores de E /2 obtenidos para los iones precursores [M+H] + compuestos 3a-3b junto a sus principales caminos de fragmentación observados. de los N Sustituyente R -N-óxido a 4-N-óxido b E /2 (ev) Fragm. Ppal. E /2 (ev) Fragm. Ppal. 3 Cl 4.5 -OH 4 -OH 4 NH OH /-H 2O 2 -OH /-H 2O 5 CH OH /-H 2O 23 -OH /-H 2O 6 COCH CH 2CO 7.5 -CH 2CO 7 CO 2H * -H 2O * -H 2O-CO 8 OH * -OH * -OH 9 OCH 3 5 -OH /-H 2O 5 -OH /-H 2O NHCOCH CH 2CO -CH 2CO CHOHCH 3 3 -OH /-H 2O 9 -H 2O/-2H 2O 2 CO 2CH CH 3OH+H 2O.5 -CH 3OH+H 2O 3 CONH 2.5 -NH 3+H 2O.5 -NH 3+H 2O * No se observó caída de la intensidad relativa del ion precursor seleccionado. Como se observa en la Tabla 3.2, los N-óxidos isómeros de 5 y pudieron diferenciarse, ya que presentaron una clara diferencia mayor a 2 ev entre sus valores de E /2, así como los N-óxidos isómeros de 7, dado que el isómero 4-N-óxido exhibió un canal de fragmentación característico. En el resto de los casos, cada par de N- óxidos isómeros compartió el mismo canal de fragmentación principal, así como valores muy similares de E /2, impidiendo así la distinción del sitio de N-oxidación por este método. Estos resultados pueden verificarse al comparar las curvas de disociación de los iones precursores [M+H] + para cada par de isómeros, que se muestran en la Figura 3.3 para los compuestos 3a-6a y 3b-6b y en la Figura 3.4 para los compuestos 9a-3a y 9b-3b. Los iones precursores de los compuestos sustituídos con un grupo amino (4a;4b), ácido carboxílico (7a;7b) o hidroxilo (8a;8b) resultaron los más estables en relación a la familia de compuestos estudiados, siendo predominante el ion precursor para todas 79

97 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina las energías de colisión en los dos últimos compuestos. Por este motivo, en estos casos, no pudo hallarse el valor de E /2, y en su lugar se muestran las curvas de abundancia relativa de los principales iones fragmento respectivos en la Figura 3.5. Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) 3 Abundancia relativa del ion precursor (%) Energía de colisión (ev) NO 4NO 4 Abundancia relativa del ion precursor (%) Energía de colisión (ev) NO 4NO 5 Abundancia relativa del ion precursor (%) Energía de colisión (ev) NO 4NO 6 Figura 3.3. Curvas de abundancia relativa de los iones precursores [M+H] + en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio de los -N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas con los grupos cloro 3, amino 4, metilo 5 y acetilo 6, 8

98 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) 9 Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) Abundancia relativa del ion precursor (%) NO 4NO Energía de colisión (ev) Figura 3.4. Curvas de abundancia relativa de los iones precursores [M+H] + en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio, de los -Nóxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2- sustituídas con los grupos metoxilo 9, N-acetilo. -hidroxietilo, metoxicarbonilo 2 y carbamoílo 3. 8

99 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina NO 4NO NO 4NO Abundancia relativa del ion producto (%) [M+H-H 2 O-CO] + 7 [M+H-H 2 O] + Abundancia relativa del ion producto (%) [M+H-OH] + 8 [M+H-OH] Energía de colisión (ev) Energía de colisión (ev) Figura 3.5. Curvas de abundancia relativa de los principales iones producto obtenidos a partir de los iones precursores [M+H] +, en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio, de los -N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2- sustituídas con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8. En términos generales, los espectros CID de los iones [M+H] + de los compuestos estudiados compartieron algunas características. A modo de ejemplo, en la Figura 3.6, pueden observarse los espectros MS/MS obtenidos por CID a 5 ev para los iones precursores [M+H] + de los compuestos 6a; 9a y 2a y en la Figura 3.7, los correspondientes a los compuestos 6b, 9b y 2b para su comparación. Vale la pena mencionar que un camino de fragmentación recurrentemente observado es la pérdida del radical hidroxilo y la pérdida de agua, como se observa para los compuestos 9a y 9b en las Figuras 3.6 y 3.7, respectivamente. Este comportamiento ya había sido previamente informado en los estudios CID de N-óxidos de hidroxipiridina en la sección 2.2. (pág. 25). No obstante, también se observaron otros caminos de fragmentación en los compuestos sustituídos con un grupo carbonilo. Con el grupo acetilo (compuestos 6a, 6b y a, b), predominó la pérdida de cetena (H 2 C=C=O) como canal de fragmentación primario, mientras que en derivados de ácidos carboxílicos (compuestos 2a, 2b y 3a, 3b), se observaron especies atribuibles a la hidrólisis de estos grupos (Figuras 3.6 y 3.7). De manera semejante, en experimentos de espectrometría de masa tándem por electrospray, a partir de la molécula protonada de N-óxidos derivados de quinolinas 67, la pérdida del radical hidroxilo, si bien resultó característica del grupo N-óxido, no fue invariablemente el proceso de fragmentación primario, sino que también fueron 82

100 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 observados otros caminos de fragmentación que prevalecieron sobre el anterior cuando el anillo heterocíclico presentaba sustituyentes con grupos carbonilo en su estructura. Por otra parte, la pérdida de moléculas neutras de cetena fue informada, como único proceso de fragmentación a partir de experimentos CID de iones N- alquilacil-4-(dimetilamino)piridinio 33. Por otro lado, se ha encontrado empleando ESI con analizadores como QIT o FT-ICR, que cationes fragmento acilio pueden asociarse con moléculas residuales de solvente (como agua o metanol), dando origen a artefactos inesperados (iones fragmento derivados de ácidos) 34. Por ejemplo, en estudios por CID de la molécula isoquinolina-3-carboxamida protonada, fueron observados iones producto que eliminan nominalmente fragmentos de u, que fueron atribuidos a la pérdida neutra de CH 2 NH (-29 u) y una adición de agua (+8 u) al resultante catión acilio para dar el ion producto correspondiente al ácido carboxílico protonado 35. La adición de agua a iones fragmento fue también observada en analizadores híbridos QTOF, aunque en este caso, el origen fue atribuído a la adsorción de humedad por las tuberías de acero conectadas a la celda de colisión 36. Al considerar los iones fragmento de menor intensidad para los compuestos cuyo camino de fragmentación principal no era la pérdida del radical hidroxilo o agua, se notó la presencia de especies útiles para diferenciar entre ambos isómeros. Por ejemplo, los N-óxidos isómeros de los compuestos con sustituyentes acetilo (6) y metoxicarbonilo (2), pueden diferenciarse a partir de iones fragmento que involucran la pérdida de agua y la pérdida de CO y metanol, respectivamente, [M+H-H 2 O] + y [M+H-CH 3 OH-CO] +, que sólo se observaron en los 4-N-óxidos (Figura 3.7). De manera similar, se encontraron los iones producto análogos, en los isómeros 4-N-óxidos de los compuestos sustituídos con un grupo N-acetilo () y carbamoílo (3) que comparten además el canal de fragmentación con los compuestos 6 y 2, respectivamente. Cabe mencionar que el ion fragmento correspondiente a la pérdida de CO a partir del ion acilio [M+H-H 2 O-CO] +, fue también el canal de fragmentación principal en el 4-N-óxido del compuesto sustituído con el grupo carboxilo (7), que sirvió además para la diferenciación de su isómero. En un trabajo previo 3 realizado empleando EI como técnica de ionización se había encontrado la pérdida característica del átomo de oxígeno en los - y 4- N- óxidos de pirazinas monosustituídas y sobre la base de comparaciones entre la intensidad relativa de este fragmento y el proveniente de la pérdida del radical hidroxilo, se observaban diferencias entre algunos N-óxidos isómeros. 83

101 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [%] [%] a 9a 2a [M+H-CH 2CO] [M+H-CH 2CO-OH] [M+H-H 2O] [M+H-OH] +.5 [M+H] [M+H] MS2(39.5) m/z +MS2(27.5) m/z [M+H-CH 3OH] [M+H-CH 3OH+H 2O] [M+H] MS2(55.5) m/z Figura 3.6. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H] + de los -Nóxidos de acetilpirazina 6a, metoxipirazina 9a y metoxicarbonilpirazina 2a producidos por ESI con energía de colisión de 5 ev. 84

102 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [%] [%] b 9b 2b [M+H-CH 2CO] [M+H-H 2O] [M+H-OH] [M+H-H 2O] [M+H-OH] +.5 [M+H] [M+H] m/z [M+H-CH 3OH-CO] [M+H-CH 3OH] [M+H-CH 3OH+H 2O] [M+H] MS2(39.5) m/z +MS2(27.5) +MS2(55.5) m/z Figura 3.7. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H] + de los 4-Nóxidos de acetilpirazina 6b, metoxipirazina 9b y metoxicarbonilpirazina 2b producidos por ESI con energía de colisión de 5 ev. 85

103 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina En este trabajo, a partir de la inspección de las intensidades relativas de los iones fragmento obtenidos por la pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula protonada, se encontraron pequeñas diferencias entre los N-óxidos isómeros de los compuestos sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8), mientras que los sustituídos con un grupo cloro (3) y metoxilo (9), resultaron indistinguibles por este método, pudiendo observarse este último caso en las Figuras 3.6 y 3.7. Otros pares de N-óxidos sustituídos con los grupos metilo (5) y -hidroxietilo () que mostraron estos mismos canales de disociación pudieron ser diferenciados por el valor del parámetro E /2 (Tabla 3.2, pág. 79). Teniendo en cuenta todo lo anterior, se lograron diferenciar entre sí nueve del total de once pares de N-óxidos isómeros, a partir del análisis de las fragmentaciones por ESI-CID, ya sea por la estabilidad de la molécula protonada frente a la disociación medida con el valor del parámetro E /2, útil para los compuestos con sustituyentes alquílicos (5 y ), por la presencia de iones fragmento característicos en los 4-Nóxidos de compuestos sustituídos con un grupo carbonilo (6, 7,, 2 y 3) o por ligeras diferencias entre las abundancias de los iones fragmento provenientes de la pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula protonada para los N-óxidos isómeros sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8). En este último caso, las diferencias observadas no fueron tan marcadas como se esperaba por los resultados obtenidos previamente en la sección 2.2 (pág. 25) relativos a la disociación de los N- óxidos isómeros de hidroxipiridina y 2, revelando así la influencia de los cambios estructurales entre ambos sistemas Análisis de la formación de complejos con metales Como alternativa a la metodología previa para diferenciar cada par de N-óxidos isómeros, se evaluaron estrategias de complejación con metales basadas en la formación de iones aducto con cationes metálicos por electrospray. En principio, considerando los resultados previos de la sección 2.4, sería esperable obtener diferentes espectros de masa para cada uno de los 2 isómeros de cada compuesto con diferentes sustituyentes, permitiendo así su distinción sobre la base de las distintas especies iónicas observadas. 86

104 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Los espectros de masa fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el momento de soluciones de cada N-óxido del conjunto de 22 pirazinas monosustituídas (Figura 3.2, pág. 75) con diferentes soluciones de cationes metálicos (calcio (II), cobre (II) y aluminio (III)). Estos metales fueron seleccionados como representantes del grupo de metales alcalino-térreos, divalentes de transición y trivalentes, de acuerdo a las diferencias características antes observadas en la sección 2.4, en relación con los iones aducto formados con los N-óxidos de hidroxipiridinas. Las moléculas protonadas de los N-óxidos de las pirazinas sustituídas 3a-3a y 3b-3b así como aductos mono- o dicargados, formados a partir del catión metálico divalente o trivalente y los ligandos en su forma neutra o desprotonada, fueron observados en fase gaseosa usando ESI. Las especies observadas en los espectros de masa fueron caracterizadas y asignadas, confirmando las asignaciones sobre la base de las relaciones m/z medidas con alta resolución y precisión, a los espectros de masa tándem obtenidos por CID y al análisis de los patrones isotópicos característicos en el caso del cobre y del contra-ion cloruro (Anexo, págs ). Dado el número de compuestos analizados y de iones aducto identificados con cada metal, la interpretación de los resultados resultó difícil. Por ello, se exploraron los resultados obtenidos en busca de tendencias para clasificar el comportamiento de los compuestos en función de sus estructuras moleculares con la asistencia del análisis de componentes principales (PCA). Los estudios 37,38,39 que emplean PCA para la distinción de isómeros por espectrometría de masa aún son relativamente pocos. En particular, en los casos citados, el análisis fue aplicado a las abundancias relativas de iones fragmento, empleándose técnicas de ionización fuerte como EI. En este caso, el análisis fue aplicado utilizando como datos de entrada de la matriz, los rangos de intensidades relativas que se muestran en las Tablas Estos rangos representados en las tablas con colores (rojo: 5-25%; naranja: 25-5%; verde: 5-75% y amarillo: 75-%) fueron a su vez, codificados con números enteros (rojo=, naranja=2, verde=3, amarillo=4). De esta manera, se tuvo en cuenta la variabilidad en la intensidad relativa de los iones, ya que varía dentro de un rango para distintas réplicas, y de este modo los valores obtenidos en los experimentos replicados quedaron comprendidos en los rangos propuestos. Los iones observados (variables) se colocaron como columnas de la matriz de PCA mientras que las filas (muestras) correspondieron a cada uno de los compuestos 87

105 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina estudiados 3a-3a y 3b-3b. Por consiguiente, fueron obtenidas tres matrices conteniendo 26, 7 y 9 variables, para el calcio, cobre y aluminio, respectivamente (Las tablas con los datos de estas matrices se encuentran en el capítulo 5, págs ). Los primeros dos componentes principales obtenidos a partir de la aplicación de PCA a cada matriz de datos describieron al menos el 8% de la varianza de los datos para el cobre y aluminio, mientras que para el calcio, estuvo descrita el 75% de la varianza por los primeros dos componentes y fue necesario considerar el tercero para superar el 8%. Por lo tanto, aunque los dos primeros componentes principales (PC y PC2), podrían no ser suficientes para describir la varianza completa de los datos, sobre todo en el caso del calcio, por propósitos comparativos entre metales, se realizará el análisis con los mismos. Con el fin de simplificar la interpretación visual de las representaciones gráficas obtenidas por PCA, se utilizó un código numérico para identificar los iones. El primer dígito indica la carga del ion (ya sea o 2) mientras que los subsiguientes se refieren a los coeficientes estequiométricos del compuesto ligando, ion metálico, moléculas de agua y contra-ion del metal, respectivamente en el ion aducto. Esto puede ser ilustrado en el caso de un ion aducto genérico [(M) b (Z) c (H 2 O) d (X) e ] a+, cuyo código sería abcde, donde M representa al compuesto (3a-3a y 3b-3b), Z al catión metálico (calcio, cobre o aluminio) y X al contra-ion del metal (cloruro o sulfato). Con el fin de reconocer la presencia de especies desprotonadas a través del código numérico, la carga del ion aducto (primer dígito) debe balancearse con las cargas del metal y su contra-ion. En el caso particular del cobre, donde se observaron dos estados de oxidación, para evitar la ambigüedad y diferenciar los iones aducto conteniendo Cu(I) de aquellos con Cu(II) y especies desprotonadas, se antepuso un * al código numérico de las especies de Cu(I) Calcio Las características principales de los espectros de masa obtenidos con calcio para los compuestos 3a-3a y 3b-3b, se listan en las Tablas donde se muestran los iones aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas (con error entre paréntesis). De manera general, los espectros de masa obtenidos con calcio exhibieron varios iones aducto para cada compuesto. Los iones aducto de mayor abundancia incluyeron tanto a cationes dicargados así como monocargados, 88

106 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 conteniendo ya sea un ligando desprotonado o el contra-ion cloruro unido. Asimismo, se encontraron diferencias en la identidad de alguno/s de los iones aducto para cada isómero del par de N-óxidos como se describe a continuación. Al inspeccionar las Tablas 3.4 y 3.6 puede notarse que en el caso de los 4-Nóxidos, en general, resultaron predominantes las especies correspondientes a la molécula protonada [M+H] + y/o al ion aducto dicargado formado por calcio junto a 2 moléculas de agua y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+2H 2 O] ++. En el caso de los -N-óxidos (Tablas 3.3 y 3.5), además de las especies anteriores que prevalecieron para los compuestos 3a, 5a y 9a, se agregaron otras. Así, el ion aducto monocargado formado por calcio y una molécula del compuesto desprotonada [M+Ca-H] + se destacó para 4a, 8a y a, el ion aducto dicargado [2M+Ca+H 2 O] ++ para 6a, 2a y 3a, y finalmente, el ion aducto monocargado que incluye al calcio junto al contra-ion cloruro y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+Cl] + predominó para 9a y a. La mayoría de los compuestos estudiados no mostraron evidencia de productos de descomposición en sus espectros de masa en presencia de los iones metálicos. Sin embargo, en ciertos casos se observaron los iones producto de los canales de fragmentación estudiados en la sección 3.3 (pág. 78). Por ejemplo, para los compuestos a y b, se evidenciaron iones aducto producto de la pérdida de cetena, que coincide con el canal de fragmentación de menor energía de la molécula protonada. Por otra parte, los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b, mostraron iones aducto con calcio (Tablas ) y cobre (Tablas ) involucrando al ligando descarboxilado. Curiosamente, ha sido informada la descarboxilación de pirazincarboxilatos 4 de cobre y calcio (II) bajo condiciones de pirólisis. En la Figura 3.8 a) se muestra el gráfico de puntuaciones (scores plot) de los compuestos estudiados y tratados con calcio (II) a partir de la aplicación de PCA a los datos obtenidos en las Tablas , con el fin de visualizar la agrupación (o separación) entre pares de compuestos isoméricos, así como entre compuestos con distintos sustituyentes. Además, en la Figura 3.8 b) aparece el gráfico de pesos (loadings plot) de los iones observados con calcio. Para la interpretación del gráfico de pesos debe tenerse en cuenta que aquellas variables que se sitúan en el mismo cuadrante presentan similar contenido de información. Es más, a partir del valor numérico absoluto de los pesos es posible estimar cuánto contribuye una variable individual a cada componente principal, y así identificar las variables más influyentes. 89

107 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.3. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-7a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm). 3a Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O [M+Ca] (3.7) [M+Ca+H 2O] (6.4) [M+Ca+2H 2O] * [M+Ca+3H 2O] (5.4) [M+Ca+4H 2O] ++ 4a C 4H 5N 3O [M+H] (4.) (3.8) [M+Na] (.2) [M+Ca-H] (5.4) [M+Ca+H 2O-H] (.) [M+Ca+2H 2O-H] (6.5) [M+Ca+Cl] (4.6) [M+Ca+Cl+H 2O] (.) [M+Ca+Cl+2H 2O] (2.6) [2M+Ca] (3.8) [2M+Ca+H 2O] (6.6) [2M+Ca+2H 2O] (7.5) [2M+Ca+3H 2O] (.9) [2M+Ca-H] (.6) [2M+Ca+H 2O-H] (2.3) [2M+Ca+2H 2O-H] + [2M+Ca+Cl] (7.) [2M+Ca+Cl+H 2O] (.) [3M+Ca] (.4) [3M+Ca+H 2O] (.9) [3M+Ca+Cl] + [4M+Ca] ++ 5a b C 5H 6N 2O.558 (4.3) (.8) (3.3) (4.2) (6.8) 6a C 6H 6N 2O (2.4) (2.) 7.26 (2.) 6.78 (.9) (2.5) 6.37 (3.) (4.5) (4.4) (.6) (8.) (4.5) (.3) (3.7) (3.2) (3.5) (.) (2.5) 7a c C 5H 4N 2O (.4) (7.) (8.3) (4.) 337. (5.9) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (.6) [M+H-OH] + c Se observan además (.2) [M+H-H 2O] +, (2.) [M+Ca-CO 2-H] +, (4.3) [M+Ca+H 2O-CO 2-H] +, 7.86 (5.2) [M+Ca+2H 2O-CO 2-H] + y (.) [2M+Ca-2CO 2+H 2O-H] +. * Se observa solapamiento de picos. 9

108 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.4. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3b-7b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm). 3b b 4b 5b 6b Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O C 4H 5N 3O C 5H 6N 2O C 6H 6N 2O [M+Ca] (3.) (5.2) [M+Ca+H 2O] (2.3) (.7) [M+Ca+2H 2O] (5.) (3.) [M+Ca+3H 2O] (4.3) (2.7) [M+Ca+4H 2O] (5.3) [M+H] (8.3) (6.) (7.3) (4.5) [M+Na] (5.4) (5.) [M+Ca-H] * (3.3) [M+Ca+H 2O-H] (5.8) (.5) [M+Ca+2H 2O-H] * [M+Ca+Cl] (4.8) * * * [M+Ca+Cl+H 2O] (.2) (8.2) (8.2) (5.3) [M+Ca+Cl+2H 2O] (2.7) (5.6) (5.) (.7) [2M+Ca] (5.5) (2.5) (.6) (.) [2M+Ca+H 2O] (.7) (.8) (3.7) (5.2) [2M+Ca+2H 2O] (.2) (4.7) (8.6) (3.) [2M+Ca+3H 2O] (2.8) (.8) (2.9) [2M+Ca-H] + 7b c C 5H 4N 2O (7.8) 7.59 (5.6) 4.3 (4.4) 63.2 (3.6) (3.) (7.4) (4.) [2M+Ca+H 2O-H] (.8) [2M+Ca+2H 2O-H] (4.3) [2M+Ca+Cl] (4.) (7.6) [2M+Ca+Cl+H 2O] (4.8) (2.) [3M+Ca] (5.) [3M+Ca+H 2O] (4.8) [3M+Ca+Cl] (2.2) [4M+Ca] (5.) (.5) * (4.4) (.4) (4.8) (.8) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b Se observa (7.) [M+H-OH] + c Se observan además (3.4) [M+H-OH] +, (.8) [M+Ca-CO 2-H] +, (5.5) [M+Ca+H 2O-CO 2-H] +, 7.87 (5.8) [M+Ca+2H 2O-CO 2-H] +, (3.4) [M+Ca+H 2O-OH] +, (.9) [M+Ca+2H 2O-OH] +, (.2) [M+Ca+3H 2O-H] +, (3.4) [2M+3Ca+2Cl+4H 2O-2H] ++, (.6) [2M+3Ca+2Cl+5H 2O-2H] ++, (.) [3M+3Ca+Cl+3H 2O-3H] ++, (.7) [3M+3Ca+Cl+4H 2O-3H] ++, (.8) [2M+2Ca+Cl+H 2O-2H] +, (5.) [3M+2Ca-3H] +. * Se observa solapamiento de picos. 9

109 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.5. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8a-3a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm). 92 8a 9a Ion/Compuesto C 4H 4N 2O 2 C 5H 6N 2O [M+Ca] (3.3) [M+Ca+H 2O] (6.) [M+Ca+2H 2O] (3.7) [M+Ca+3H 2O] (3.) [M+Ca+4H 2O] ++ [M+H] (3.4) [M+Na] (3.4) [M+Ca-H] (4.3) (5.9) (6.7) [M+Ca+H 2O-H] (.3) [M+Ca+2H 2O-H] (.2) [M+Ca+Cl] (4.4) (4.4) [M+Ca+Cl+H 2O] * (3.9) [M+Ca+Cl+2H 2O] (.7) [2M+Ca] (4.) [2M+Ca+H 2O] (5.7) (2.5) [2M+Ca+2H 2O] (.3) [2M+Ca+3H 2O] ++ [2M+Ca-H] (3.8) [2M+Ca+H 2O-H] (2.8) [2M+Ca+2H 2O-H] + [2M+Ca+Cl] (4.8) [2M+Ca+Cl+H 2O] (.7) [3M+Ca] (4.) [3M+Ca+H 2O] ++ [3M+Ca+Cl] + [4M+Ca] ++ a b C 6H 7N 3O (.7) (.4) (.4) (4.) (3.6) 2.96 (4.9) (.4) (2.3) a c C 6H 8N 2O (4.) 99.5 (2.7) 8.26 (.) (.3) 4.66 (.2) (5.8) (6.) 97,234 (.5) * (6.6) (8.) (.) (.9) (2.8) (.8) (.) (2.5) (.) 2a C 6H 6N 2O (.8) 6.53 (3.3) 5.8 (5.2) (2.9) (4.9) (.8) 2.42 (7.4) (6.6) (8.9) (9.2) (3.7) (6.9) (3.) (.2) (2.7) (.2) 3a C 5H 5N 3O (2.2) (2.7) 7.55 (.7) (2.) 4.45 (3.) (.2) (.2) (4.6) 24.7 (3.2) * (4.8) 59.9 (.2) (4.6) (6.6) (2.5) (.5) (4.7) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b Se observan además 2.52 (5.8) [M+H-COCH 2] +, (4.4) [M+Ca-H-COCH 2-H 2O] +, 68.9 (6.4) [M+Ca-H-COCH 2] +, (.5) [M+Ca+H 2O-H-COCH 2] + y (3.3) [2M+Ca-H-COCH 2] +. c También se observan (2.9) [M+H-H 2O-OH] +, (.9) [M+H-H 2O] +, (2.) [M+Ca-H- C 2H 4O] +, (2.6) [M+Ca+H 2O-H-C 2H 4O] +, (.2) [2M+Ca+H 2O-H-2(C 2H 4O)] +, (2.) [2M+Ca-H-C 2H 4O] +, (.6) [2M+Ca+H 2O-H-C 2H 4O] +. * Solapamiento de picos observado.

110 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.6. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8b-3b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm). 8b 9b b b Ion/Compuesto C 4H 4N 2O 2 C 5H 6N 2O 2 C 6H 7N 3O [M+Ca] (.2) [M+Ca+H 2O] (9.) [M+Ca+2H 2O] (4.7) [M+Ca+3H 2O] (4.) [M+Ca+4H 2O] (.5) [M+H] (6.3) (4.3) (.2) [M+Na] (3.7) (4.7) [M+Ca-H] (.5) [M+Ca+H 2O-H] (.5) [M+Ca+2H 2O-H] * [M+Ca+Cl] * [M+Ca+Cl+H 2O] (2.6) [M+Ca+Cl+2H 2O] (3.9) (3.) [2M+Ca] (3.5) [2M+Ca+H 2O] (.) (.4) [2M+Ca+2H 2O] (5.6) (3.5) [2M+Ca+3H 2O] (9.) (.4) [2M+Ca-H] (3.4) [2M+Ca+H 2O-H] (.6) [2M+Ca+2H 2O-H] (7.) (3.9) (3.) (.) (5.5) (4.3) (2.5) 2.55 (5.5) (5.3) b c C 6H 8N 2O (3.4) (.7) (3.2) (.4) (.) (.6) (.8) (.) (.3) (3.) (2.3) (3.) [2M+Ca+Cl] (.2) (4.9) (.6) [2M+Ca+Cl+H 2O] (2.6) (.4) (2.9) [3M+Ca] (6.7) (.7) [3M+Ca+H 2O] (2.9) (3.4) [3M+Ca+Cl] (.) [4M+Ca] (2.6) 2b C 6H 6N 2O (4.9) 6.47 (2.6) 5.3 (.7) (.3) 33.2 (.2) (3.8) (.6) * (9.) (4.7) (5.8) (4.) (3.3) (3.7) 383,64 (,4) 4.7 (.4) (.5) 3b d C 5H 5N 3O (6.) (7.) 7.55 (.8) (3.4) (4.4) (4.) (3.) 24.2 (7.) * (6.7) (3.) (3.9) 77.3 (2.8) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observan 2.52 (6.3) [M+H-COCH 2] +, (6.) [M+Ca-H-COCH 2-H 2O] +, (7.5) [M+Ca-H-COCH 2] +, (.) [M+Ca+H 2O-H-COCH 2] +. c Se observan además (.2) [M+H-H 2O] + y (.9) [M+Ca+H 2O-H-C 2H 4O] +, d Se observa (.7) [M+H-H 2O] +. * Solapamiento de picos observado. 93

111 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Por ejemplo, en la Figura 3.8 b) todas las variables presentan pesos del mismo signo en el primer componente principal (PC), coincidiendo los mayores valores para aquellas variables que presentan con mayor frecuencia altas intensidades, como sugiere la comparación entre la identidad de estas variables y las especies predominantes antes mencionadas como por ejemplo [M+H] + y [2M+Ca+2H 2 O] ++. Por otro lado, el segundo componente principal (PC2) parece contrastar la ocurrencia de especies desprotonadas entre las variables, como se nota al advertir que las variables que presentan pesos positivos contienen especies desprotonadas (a excepción de la molécula protonada), mientras que aquellas con pesos negativos, no. En las Figuras , se muestran los espectros de masa representativos obtenidos para los N-óxidos 3a-3a y 3b-3b con calcio, donde se observan los perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de cada par de N-óxidos isómeros. A continuación, se discuten las diferencias halladas interpretándolas, cuando resulta posible, a partir de la información provista por la aplicación de PCA que se muestra en la Figura 3.8. En primer lugar, todos los pares de N-óxidos presentaron diferencias entre sus espectros de masa que permiten la distinción de cada isómero, lo cual puede observarse también en la Figura 3.8 a). Los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b (Figura 3.9), 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura 3.), 2-(metoxicarbonil)pirazina 2a y 2b (Figura 3.3) y 2-carbamoilpirazina 3a y 3b (Figura 3.4), exhibieron principalmente iones aducto con calcio dicargados, como [2M+Ca+2H 2 O] ++, así como aductos monocargados con calcio y cloruro unidos, por ejemplo, [M+Ca+Cl+H 2 O] +, especies ubicadas en la mitad inferior de la Figura 3.8 b). Como puede notarse estos compuestos comparten el mismo cuadrante (inferior) en la Figura 3.8 a), poniéndose de relieve la influencia de los pesos negativos (loadings) de las variables anteriores en sus puntuaciones (scores). Si bien se observan perfiles similares conformados por muchas especies comunes a ambos isómeros para cada par de N-óxidos, la intensidad relativa de ciertas señales permite diferenciarlos. Por ejemplo, el aumento en la intensidad relativa del ion correspondiente a la molécula protonada, permite distinguir los 4-N-óxidos de los compuestos 3, 6 y 3 de sus isómeros, mientras que la mayor abundancia relativa de la especie [2M+Ca+2H 2 O] ++, permite la distinción del 4- N-óxido del compuesto 2, como se nota en la Figura 3.8 a). 94

112 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 6 a) B PC2 PC PC b),5,4,3,2,, -, -,2 -,3 -,4 -,5 Código Ion 2 [M+Ca] ++ 2 [M+Ca+H 2O] [M+Ca+2H 2O] [M+Ca+3H 2O] [M+Ca+4H 2O] ++ [M+H] + [M+Na] + [M+Ca-H] + [M+Ca+H 2O-H] + 2 [M+Ca+2H 2O-H] + [M+Ca+Cl] + [M+Ca+Cl+H 2O] + 2 [M+Ca+Cl+2H 2O] + 22 [2M+Ca] [2M+Ca+H 2O] [2M+Ca+2H 2O] [2M+Ca+3H 2O] ++ 2 [2M+Ca-H] + 2 [2M+Ca+H 2O-H] + 22 [2M+Ca+2H 2O-H] + 2 [2M+Ca+Cl] + 2 [2M+Ca+Cl+H 2O] + 23 [3M+Ca] [3M+Ca+H 2O] ++ 3 [3M+Ca+Cl] + 24 [4M+Ca] ++,,,2,3,4,5 PC Figura 3.8. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales PC- PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con calcio. En cuanto a los los espectros de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.9), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.) y 2-acetamidopirazina a y b (Figura 3.2), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de la identidad de las especies observadas. Así, en los espectros de los -N-óxidos se observaron iones aducto con calcio monocargados conteniendo principalmente las moléculas del compuesto desprotonado, como [M+Ca+H 2 O-H] +, a diferencia de los 4-95

113 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina N-óxidos, donde en general, los iones aducto presentaron a las moléculas del compuesto en su forma neutra, siendo los mismos monocargados o dicargados, según contengan o no el contra-ion cloruro. Esta observación se evidencia también en la Figura 3.8 a), donde se observan los -N-óxidos en el cuadrante superior izquierdo y sus 4-N-óxidos desplazados hacia el cuadrante inferior derecho en coincidencia con las zonas de influencia de las especies antes mencionadas tal como se muestra en la Figura 3.8 b). Los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa con calcio (Figura 3.) perfiles muy similares con muchos iones producto de reacciones de descarboxilación que aumentan la complejidad y dificultan su interpretación. Asimismo, en la Figura 3.8 a) se nota que ambos isómeros se encuentran próximos con valores similares en PC2, lo que sugiere la presencia de especies similares en ambos espectros. En cambio, los perfiles similares entre los N- óxidos isómeros de 2-hidroxipirazina 8a y 8b (Figura 3.), se pueden distinguir a partir de la mayor intensidad relativa del ion [M+H] + en el 4 N-óxido, así también como por la mayor intensidad relativa del ion [2M+Ca-H] + en el -N-óxido isómero. Como se puede notar en la Figura 3.8 b), la variable correspondiente a la molécula protonada se encuentra en la mitad derecha, en concordancia con la orientación como se separa el 4-N-óxido 8b respecto de su isómero 8a (Figura 3.8 a). Los N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.2) y los de la 2-(- hidroxietil)pirazina a y b (Figura 3.3) mostraron un comportamiento distintivo en relación al resto de los compuestos estudiados. Para el primer par (9a y 9b), ambos isómeros se distinguieron por la mayor preponderancia de iones aducto con calcio monocargados, conteniendo el contra-ion cloruro en el caso de 9a, como [2M+Ca+Cl] +. Además 9b presentó iones aducto con calcio dicargados, como [3M+Ca+H 2 O] ++. En el segundo par (a y b), se encontraron en los espectros diferencias en la cantidad de moléculas incluídas en los principales iones aducto con calcio, que fueron dicargados así como monocargados, y que incluyeron especies neutras o desprotonadas. En el caso de a, los iones aducto incluyeron hasta dos moléculas del compuesto, mientras que para b se observaron iones aducto con tres y hasta cuatro moléculas. Sin embargo, esta diferencia no es revelada por los componentes principales estudiados en la Figura 3.8 a), y a pesar de exhibir espectros de masa bien diferenciados, la compensación por efectos opuestos en las otras variables hace que sus puntuaciones sean similares y entonces se ubiquen próximos. 96

114 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+Ca] ++ [M+H] [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+Cl] [2M+Ca+Cl] m/z [%] [M+Ca+3H 2O] [2M+Ca+2H 2O] [M+H] [M+Ca+Cl+H 2O] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [2M+Ca+Cl+H 2O] m/z [%] [M+H] [M+Ca-H] [2M+Ca-H] b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z [%] [M+H] [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] [2M+Ca+Cl] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [3M+Ca+Cl] m/z 4b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento Figura 3.9. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo cloro 3 y amino 4. 97

115 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa [%] [M+H] [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+2H 2O-H] [2M+Ca+H 2O-H] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z Intensidad relativa [%] [M+H] +.56 [2M+Ca+2H 2O] [3M+Ca+H 2O] [M+Ca+Cl+2H 2O] + [2M+Ca+Cl+H 2O] b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento Intensidad relativa Intensidad relativa m/z [%] [2M+Ca+H 2O] [M+Ca+3H 2O] ++ [M+Ca+H 2O-H] [2M+Ca-H] [2M+Ca+Cl] m/z [%] [M+Ca+3H 2O] [M+H] + [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo [2M+Ca+Cl] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z 6b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento Figura 3.. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)

116 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] [M+Ca+H 2O-CO 2-H] [M+Ca+2H 2O-H] [2M+Ca-2CO 2+H 2O-H] [2M+Ca+H 2O-H] m/z [%] [M+H] [M+Ca+H 2O-CO 2-H] [M+Ca+2H 2O-H] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [3M+3Ca+Cl+4H 2O-3H] [2M+3Ca+2Cl+4H 2O-2H] ++ [2M+2Ca+Cl+H 2O-2H] [3M+2Ca-3H] m/z [%] [M+H] [M+Ca-H] [2M+Ca-H] b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z [M+H] + [%] [M+H] + 8b [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) 8 [M+Ca-H] + [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [M+Ca+Cl+H 4 2O] [2M+Ca+H 2O-H] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z Figura 3.. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8. 99

117 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+Ca+3H 2O] [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] [2M+Ca+Cl] m/z [%] [M+H] [2M+Ca+2H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo. [2M+Ca+Cl+H 2O] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z [%] 8 6 Intensidad relativa Intensidad relativa 4 2 [M+H-COCH 2] [M+H] [2M+Ca+H 2O-H] [2M+Ca-H] b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z [%] [M+H] [M+Ca+4H 2O] [2M+Ca+3H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [2M+Ca+H 2O-H] m/z b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento Figura 3.2. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)

118 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [2M+Ca+Cl] + [M+H] + [M+H-H 2O] [M+Na] [2M+Ca+H 2O] ++ [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) 8 iones fragmento [2M+Ca-H] [2M+Ca-H-C 2H 4O] m/z [%] [%] [2M+Ca+H 2O] [2M+Ca+3H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [2M+Ca+Cl] m/z [%] [M+Ca+3H 2O] [M+H] [M+Ca+H 2O-H] [M+H] [2M+Ca+2H 2O] [3M+Ca+H 2O] [M+Ca+Cl+2H 2O] [2M+Ca+Cl] m/z 2a 2b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento a b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento [4M+Ca] ++ [2M+Ca+Cl] [3M+Ca+Cl] m/z Figura 3.3. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos -hidroxietilo y metoxicarbonilo 2.

119 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa [%] [M+Ca+3H 2O] [M+Ca+H 2O] [M+Ca+Cl+H 2O] [2M+Ca+Cl] [2M+Ca-H] m/z 3a [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento Intensidad relativa [%] [M+H] [M+Ca+2H 2O] [Ca 2Cl 3] [M+Ca+Cl+2H 2O] b [M+H] + [M+Na] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-4) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+ca+cl+y(h 2O)] + (x=-3) (y=-2) iones fragmento m/z Figura 3.4. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 3. Los - y 4- N-óxidos de los compuestos estudiados pudieron distinguirse entre sí, a partir de la comparación de las especies observadas (y en algunos casos, sus intensidades relativas), en los espectros de masa obtenidos con calcio. La metodología empleada permitió exhibir diferencias entre los pares de isómeros empleando espectrometría de masa utilizando electrospray como método de ionización. Cabe mencionar que no se conocen en la actualidad metodologías que permitan la diferenciación de los - y 4- N-óxidos isómeros por espectrometría de masa. 2

120 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo Cobre En las Tablas se listan las características principales de los espectros de masa obtenidos para los compuestos 3a-3a y 3b-3b con cobre, mostrando los iones aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas (con su error entre paréntesis). A diferencia de los resultados obtenidos con calcio, los espectros de masa con cobre para algunos pares de N-óxidos isómeros resultaron más similares, observándose además un menor número de iones aducto. Asimismo, se observaron menos especies dicargadas (principalmente, conteniendo 2 cationes metálicos junto al contra-ion sulfato), y en general, con bajas intensidades relativas. Las especies mono cargadas registradas no sólo resultaron a partir de iones aducto conteniendo un ligando desprotonado, como en el caso del calcio, sino también por contener Cu(I) proveniente de la reducción de Cu(II), la cual ya había sido observada previamente en la sección (pág. 5). Estas especies conteniendo Cu(I) se señalan con un * precediendo al ion aducto en las Tablas En algunos compuestos, también fue identificado el catión radical (M + ). Se ha informado 7 que estas especies radicalarias pueden producirse a partir de reacciones de disociación de los iones aducto de Cu(II) dando lugar también a especies de Cu(I). A partir de la inspección de las Tablas 3.8 y 3., puede notarse que en la mayoría de los 4-N-óxidos, las moléculas protonadas [M+H] + resultaron ser las especies predominantes. Este comportamiento se repitió también para algunos -N-óxidos (Tablas 3.7 y 3.9), mientras que para otros (4a, 5a y 8a), el aducto monocargado de cobre conteniendo una molécula de agua y una molécula del compuesto, con alguno de los dos desprotonado, [M+Cu+H 2 O-H] +, constituyó la especie más abundante. En la Figura 3.6 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos (loadings plot) confeccionados a partir de la aplicación de PCA al conjunto de datos obtenido en las Tablas , con el fin de interpretar las diferencias halladas entre pares de compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes sustituyentes. Al comparar las Figuras 3.6 y 3.8 pueden observarse las diferencias antes notadas relativas al comportamiento observado con cobre y calcio, respectivamente. Así, la mayor concentración en el centro de muchos de los compuestos en la Figura 3.6 a) supondría un comportamiento más similar entre los mismos. 3

121 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.7. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-7a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm). 3a b Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O [M] (7.) [M+H] (.9) 4a C 4H 5N 3O 2.57 (.) [M+Cu-H] *[M+Cu] (.) [M+Cu+H 2O-H] (3.9) *[M+Cu+H 2O] (.2) [M+Cu+2H 2O-H] (7.3) (5.2) (.8) (.6) (3.3) 5a c C 5H 6N 2O.484 (8.4).566 (2.) (.8) (6.2) (.2) (3.) 6a d C 6H 6N 2O (.8) (.3) (3.) (.2) [M+H+Cu+SO 4] (.7) [2M+Cu-H] (.7) (5.7) *[2M+Cu] (.) (4.6) [2M+Cu] (2.5) [2M+2Cu+SO 4] (4.3) [2M+2Cu+H 2O+SO 4] [2M+2Cu+2H O+SO 4] (2.5) [3M+Cu+H 2O] ++ [3M+2Cu+SO 4] ++ [3M+2Cu+H 2O+SO 4] ++ 7a e C 5H 4N 2O (4.7) (9.4) (5.5) (5.5) (7.) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (6.5) [M+H-OH] +. c También se observa (2.2) [M+H-OH] +. d También se observan los iones (2.9) [M+H-CH 2CO] +, (.9) [M+Cu-O] +, (.3) [M+Cu+H 2O- OH] + y (.8) [M+Cu+H 2O-O] +. e Se observan (.2) [M+H-H 2O] + e iones involucrando la pérdida de CO 2 (44u): (.3) [M+Cu-CO 2] +, (2.4) [M+Cu+H 2O-CO 2-H] + y (.5) [2M+Cu-CO 2-H] +. 4

122 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.8. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3b-7b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm). 3b b Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O [M] (9.6) [M+H] + 3. (4.2) 4b c C 4H 5N 3O 2.52 (6.) [M+Cu-H] *[M+Cu] (7.8) [M+Cu+H 2O-H] (2.3) *[M+Cu+H 2O] (5.) [M+Cu+2H 2O-H] (8.4) [M+H+Cu+SO 4] + (8.6) (2.) (.6) (2.2) [2M+Cu-H] (3.4) *[2M+Cu] (2.8) 5b C 5H 6N 2O.48 (5.4).559 (5.7) (.9) (5.8) (3.2) (2.9) (5.) 6b d C 6H 6N 2O (.) (6.2) (5.8) (4.7) (4.4) [2M+Cu] (5.5) [2M+2Cu+SO 4] (7.5) [2M+2Cu+H 2O+SO 4] ++ [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] (2.8) [3M+Cu+H 2O] ++ [3M+2Cu+SO 4] ++ 7b e C 5H 4N 2O (.) (.9) ++ [3M+2Cu+H O+SO 4] (6.) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (7.2) [M+H-OH] + c También se observa (.4) [M+H-OH] +. d También se observan los iones (.9) [M+Cu+H 2O-OH] + y (.) [M+Cu+H 2O-O] +. e Se observan iones involucrando la pérdida de CO 2: (2.4) [M+Cu+H 2O-CO 2-H] +. 5

123 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.9. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8a-3a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm). 8a 9a b a c a d 2a e 3a f Ion/Compuesto C 4H 4N 2O 2 C 5H 6N 2O 2 C 6H 7N 3O 2 C 6H 8N 2O 2 C 6H 6N 2O 3 C 5H 5N 3O 2 [M] (.8) [M+H] (.3) [M+Cu-H] (5.4) 27.5 (.8) *[M+Cu] (5.4) [M+Cu+H 2O-H] (2.3) (3.4) *[M+Cu+H 2O] (3.7) [M+Cu+2H 2O-H] (.4) (3.) (9.7) (7.9) (.) (5.8) 2.98 (6.3) (4.7) (2.6) * (4.6) (2.) (2.4) (.3) (2.7) 2.96 (3.) (2.5) (5.4) (2.3) [M+H+Cu+SO 4] (8.8) [2M+Cu-H] (2.8) (9.5) (2.9) (.9) *[2M+Cu] (.9) (.2) [2M+Cu] (.5) (4.6) [2M+2Cu+SO 4] (4.) [2M+2Cu+H 2O+SO 4] (4.) [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] ++ [3M+Cu+H 2O] ++ [3M+2Cu+SO 4] ++ [3M+2Cu+H 2O+SO 4] (.8) (5.7) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (.5) [M+H-H 2O] +,.466 (7.7) [M+H-OH] +. c También se observan los iones (.5) [M+H-COCH 2] +, (6.5) [M+H-OH] + y (9.3) [2M+Cu-H-COCH 2] +. d También se observan los iones (6.2) [M+H-H 2O] +, (2.9) [M+Cu-H 2O] +, (5.7) [M+Cu-H- CH 3] +, * [M+Cu+H 2O-H-CH 3] + y (.) [2M+Cu-H-OH] +. e También se observa (3.9) [M+H-COOCH 3+H 2O] + y (3.2) [M+H 2O] +. f También se observan los iones (6.8) [M+H-NH 3] +, (.4) [M+Cu-H-CONH 2] +, (4.2) [M+Cu+H 2O-H-CONH 2] + y (4.5) [M+Cu-O] +. * Solapamiento de picos observado. 6

124 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8b-3b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm). 8b 9b b Ion/Compuesto C 4H 4N 2O 2 C 5H 6N 2O 2 [M] (.3) [M+H] (3.7) [M+Cu-H] (2.) (5.9) b c C 6H 7N 3O (4.3) *[M+Cu] (.) [M+Cu+H 2O-H] (4.7) (.2) (5.3) *[M+Cu+H 2O] (.) (2.7) (.2) [M+Cu+2H 2O-H] + b d C 6H 8N 2O (6.5) (5.) (.) 2b e C 6H 6N 2O (.4) (.8) (3.) (.3) 3b f C 5H 5N 3O (.5) (7.5) (.5) (4.3) (9.2) [M+H+Cu+SO 4] (.9) [2M+Cu-H] (3.9) *[2M+Cu] (6.9) [2M+Cu] (.3) [2M+2Cu+SO 4] (.4) [2M+2Cu+H 2O+SO 4] (8.4) 34. (.5) [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] ++ [3M+Cu+H 2O] (2.7) ++ [3M+2Cu+SO ] (3.) [3M+2Cu+H 2O+SO 4] (2.) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa el ion.479 (3.8) [M+H-OH] +, (4.8) [M-H] +. c También se observa el ion 2.52 (6.) [M+H-COCH 2] +. d También se observan los iones (4.2) [M+H-H 2O] +, (2.2) [M+Cu-H-CH 3] + y * [M+Cu+H 2O-H-CH 3] + y (6.9) [2M+Cu-H-CH 3] +. e También se observa (2.2) [M+H-COOCH 3] + y (.9) [M+H 2O-CH 3OH] +. f También se observan los iones (3.2) [M+Cu+Cl] + y (4.2) [M+Cu+Cl+H 2O] +. * Solapamiento de picos observado. 7

125 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina La interpretación realizada de los componentes principales parece mantenerse al pasar del calcio al cobre. El primer componente principal (PC) en la Figura 3.6 b) continúa destacando las variables que con frecuencia son más abundantes mientras que el segundo componente principal (PC2) contrasta la ocurrencia de especies desprotonadas, como se deduce al notar que las variables que presentan pesos positivos contienen especies desprotonadas a diferencia de las que presentan pesos negativos. En las Figuras , se muestran los espectros de masa representativos obtenidos con cobre para los N-óxidos 3a-3a y 3b-3b, donde pueden observarse los perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de cada N-óxido isómero. En línea general, los espectros de masa resultaron más similares entre el par de N-óxidos isómeros aunque en algunos casos, se encontraron diferencias importantes que se discuten a continuación. En el caso de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b (Figura 3.7), y de 2-(- hidroxietil)pirazina a y b (Figura 3.2), si bien a simple vista se observan perfiles similares en los espectros de masa, la inspección de las intensidades relativas de las especies, como por ejemplo [M+Cu+H 2 O-H] +, que es más abundante en los -Nóxidos, permite encontrar diferencias entre ambos isómeros, como lo evidencia también la separación que presentan en la Figura 3.6 a). En cuanto a los espectros de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.7) y 2-hidroxipirazina 8a y 8b (Figura 3.9), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de la identidad e intensidad relativa de las especies observadas. Por ejemplo, la mayor intensidad relativa del ion [2M+Cu-H] + en los -N-óxidos y del ion [M+H] + en los 4 N- óxidos, permitió distinguir ambos isómeros a partir de sus espectros de masa. Por otra parte, en los espectros de masa de los N-óxidos de 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.8) y 2-acetamidopirazina a y b (Figura 3.2) se observaron iones aducto con cobre monocargados, que en el caso de los -N-óxidos, contenían principalmente a las moléculas del compuesto desprotonado, mientras que los 4-Nóxidos, presentaban una proporción similar de iones aducto con Cu(I) conteniendo las moléculas del compuesto neutro, como por ejemplo, [M+Cu+H 2 O] +. Esta diferenciación a partir de las especies puede observarse también en la Figura 3.6 a), donde los -Nóxidos se ubican en la mitad superior del gráfico mientras que los 4-N-óxidos se encuentran cerca de la mitad del mismo, exhibiendo valores casi nulos en PC2. 8

126 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 6 a) B 4 2 Código Ion PC2 PC PC b) E,5,4,3,2,, -, * [M] + [M+H] + [M+Cu-H] + * *[M+Cu] + [M+Cu+H 2O-H] + * *[M+Cu+H 2O] + 2 [M+Cu+2H 2O-H] + [M+H+Cu+SO 4] + 2 [2M+Cu-H] + *2 *[2M+Cu] + 22 [2M+Cu] [2M+2Cu+SO 4] [2M+2Cu+H 2O+SO 4] [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] [3M+Cu+H 2O] [3M+2Cu+SO 4] [3M+2Cu+H 2O+SO 4] ++ -,2 -,3 -,4 -,5,,,2,3,4,5,6,7,8 PC Figura 3.6. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales PC-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con cobre. Por otro lado, en los espectros de los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura 3.8), 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.2) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 2a y 2b (Figura 3.2) se observaron iones aducto con cobre dicargados, como [2M+2Cu+SO 4 ] ++, además de iones aducto monocargados, que permiten distinguir entre los perfiles de ambos isómeros. Como puede notarse en la Figura 3.6 a), estos 9

127 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina compuestos se ubican en la mitad inferior del gráfico al igual que las especies de la Figura 3.6 b) que resultan útiles para su diferenciación. Por ejemplo, la presencia de iones aducto dicargados con 3 moléculas de los compuestos, [3M+Cu+H 2 O] ++ y [3M+2Cu+SO 4 ] ++, se observa en los espectros de los 4-N-óxidos 9b y 2b, respectivamente. Los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa con cobre (Figura 3.9) productos de reacciones de descarboxilación al igual que con calcio, aunque con cobre los espectros obtenidos resultaron más limpios mostrando un menor número de especies. Cabe mencionar que otros compuestos, como por ejemplo, a y b, presentaron también en sus espectros iones aducto producto de reacciones de fragmentación de los compuestos. Estos iones se listan al pie de las Tablas Finalmente, los N-óxidos de 2-carbamoilpirazina 3a y 3b (Figura 3.22) mostraron un comportamiento particular en relación al resto de los compuestos estudiados. Ambos isómeros se distinguieron, por la presencia de iones aducto de cobre dicargados en el caso de 3a, y por la de iones aducto de cobre monocargados conteniendo el contra-ion cloruro, en el caso de 3b. Sin embargo, en este último caso debe notarse que la presencia del contra-ion cloruro proviene de la muestra, por lo que constituye una contaminación que no permite comparar ambos isómeros en idénticas condiciones que el resto de los compuestos, poniendo de relieve la importancia de la presencia de contaminantes en la muestra para llevar a cabo esta clase de análisis.

128 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] [M+Cu+H 2O] [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] [2M+Cu] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento m/z [%] [M+H] + 3. [M+Cu+H 2O-H] [C 3H 5CuN 2O 2] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento [3M+2Cu+H 2O+SO 4] a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z [%] [M+H] [M+Cu+H 2O-H] [2M+Cu-H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 3b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z [%] [M+H-OH] [M+H] [M+Cu+H 2O] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 4a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z 4b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) Figura 3.7. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4.

129 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] [M+Cu+H 2O-H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento [2M+Cu-H] m/z [%] [M+H] [M+Cu+H 2O] [2M+Cu] [2M+2Cu+2H 2O+SO 4] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 5a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z [%] 8 [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 5b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) 6a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [2M+Cu] ++ [M+Cu+H 2O] [M+H-CH 2CO] + [M+H+Cu+SO 4] [2M+3Cu+2SO 4] m/z [%] [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ [M+Cu+H 2O] + iones fragmento [2M+2Cu+SO 4] [2M+Cu-H] b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z Figura 3.8. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.

130 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] 8 6 [M+Cu+H 2O-CO 2-H] [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 4 [M+Cu+H 2O-H] + [2M+Cu-H] m/z [%] [M+H] [M+Cu+H 2O-CO 2-H] [M+Cu+H 2O] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 7a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z [%] [M+Cu+H 2O-H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [2M+Cu-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] iones fragmento 7b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [M+H] m/z [%] 8 6 [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 8a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) 4 [M+Cu+H 2O] m/z 8b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) Figura 3.9. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8. 3

131 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H-H 2O] [M+H] [M+Cu+H 2O] [2M+Cu] [2M+2Cu+H 2O+SO 4] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento [M+2Cu+H 2O+SO 4] m/z [%] 8 6 [%] 8 6 [M+H-CH 2CO] [M+H] [M+Cu+H 2O-H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 9a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) 4 [2M+Cu-H] m/z [%] [M+H] [M+H-CH 2CO] [M+H] [M+Cu+H 2O-H] [2M+Cu] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 4 [M+Cu+H 2O] [3M+Cu+H2O] [4M+2Cu+SO 4] m/z [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) m/z 9b b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) Figura 3.2. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo. (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2)

132 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] 8 6 [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento [2M+Cu-H] [M+Cu+H 2O-H] m/z [%] 8 6 [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [M+Cu+H 2O-H-CH 3] + [2M+Cu-H] [M+Cu+H 2O] m/z b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [2M+Cu] ++ [%] [M] [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+cu+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ (x=-3) (y=-2) (z=-2) 8 [M+H] + iones fragmento [M+Cu+H 2O] [M+H-CO 2CH 3+H 2O] [2M+Cu] m/z [%] [2M+Cu] [M] + [2M+2Cu+SO 4] ++ [M+H] + [xm+cu+y(h O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 2a 2b (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [M+H] [M+H+Cu+SO 4] + [3M+2Cu+SO 4] m/z Figura 3.2. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos -hidroxietilo y metoxicarbonilo 2. 5

133 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa [%] 8 [M+H] [M] + [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + [xm+cu+y(h 2O)-H] + [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ iones fragmento 6 [2M+Cu] [M+Cu+H2O-H]+ [2M+Cu-H] [M+H+Cu+SO 4] m/z 3a (x=-2) (y=-) (x=-2) (y=-2) (x=-3) (y=-2) (z=-2) [%] [M+H] + [M+Cu+Cl] + [M] [M+H] + [xm+cu+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+cu+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [xm+zcu+(z-)(so 4)+y(H 2O)] 2+ (x=-3) (y=-2) (z=-2) 8 iones fragmento [M+Cu] [M+H+Cu+SO 4] m/z 3b Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 3. El empleo de soluciones de cobre junto a soluciones de los - y 4- N-óxidos de los compuestos estudiados permitió distinguir en muchos casos entre ambos isómeros, comparando las especies observadas y su intensidad relativa en los espectros de masa obtenidos. Sin embargo, en el conjunto de compuestos estudiado, la utilización de este metal no arrojó ventajas comparativas respecto al calcio, ya que si bien produjo espectros más sencillos, las especies observadas en menor número, no resultaron características de un dado isómero en la mayoría de los casos. 6

134 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo Aluminio Finalmente, se listan en las Tablas las características principales de los espectros de masa obtenidos con aluminio para los compuestos 3a-3a y 3b-3b, mostrando los aductos identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas (con error entre paréntesis). La característica clave de los espectros de masa obtenidos con aluminio, fue la presencia de tan sólo unas pocas especies predominantes para cada compuesto a diferencia de los metales antes vistos. Las especies más abundantes resultaron la molécula protonada [M+H] +, presente casi en la totalidad de los compuestos, y/o iones aducto con aluminio monocargados constituidos por dos moléculas del compuesto unidas al catión metálico, ya sea desprotonado [2M+Al-2H] +, o junto a contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl] +. El primer caso se observó sólo con ciertos -N-óxidos, mientras que el segundo se presentó en muchos de los 4-N-óxidos estudiados y en sólo unos pocos -N-óxidos (Tablas ). En contraste con los otros metales estudiados (calcio y cobre), en el caso del aluminio no se observaron iones aducto dicargados con intensidades relativas apreciables. Además, al igual que con el cobre, se observaron para ciertos compuestos, iones aducto conteniendo más de un catión metálico aunque, en general, estas especies presentaron una abundancia relativa muy baja. Sólo en el caso de los compuestos 7a y 7b se identificaron iones aducto de aluminio con moléculas de metanol como ligandos. En la Figura 3.23 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos (loadings plot) elaborados a partir de la aplicación de PCA a los datos obtenidos en las Tablas , con el fin de interpretar las diferencias halladas entre pares de compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes sustituyentes. Como surge de la comparación de la Figura 3.23 con la Figura 3.6, se puede notar aún una mayor concentración en el centro de muchos de los compuestos en la Figura 3.23 a) y menos especies relevantes en la Figura 3.23 b), como ya se había anticipado. 7

135 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-7a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm). 3a b 4a c 5a d 6a e 7a f Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O C 4H 5N 3O C 5H 6N 2O C 6H 6N 2O 2 C 5H 4N 2O 3 [M+H] (6.) (7.2) (8.4) (.9) (3.) [M+Al+H 2O-2H] (.9) [M+Al+2H 2O-2H] + [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] (.9) [M+Al+Cl+H 2O-H] (.9) (8.2) [M+Al+Cl+2H 2O-H] (3.3) [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] + [M+Al+2Cl] + [M+Al+2Cl+H 2O] + [2M+Al-2H] (5.) [2M+Al+H 2O-2H] (2.) [2M+Al+Cl-H] (4.6) [2M+Al+Cl+H 2O-H] + [2M+Al+2Cl] (4.) [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] + [3M+Al-2H] (4.8) [3M+2Al+Cl+H 2O-4H] (5.3) [3M+2Al+2Cl-3H] + [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] (.7) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (.3) [M+H-OH] +. c También se observa (3.9) [M+H-OH] +. d También se observa (2.7) [M+H-OH] +. e También se observa 97.4 (4.4) [M+H-CH 2CO] +. f También se observa (.5) [M+H-H 2O] +, (3.8) [2M+Al+Na+Cl-2H] +. 8

136 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.2. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3b-7b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm). 3b b Ion/Compuesto C 4H 3ClN 2O [M+H] (3.5) [M+Al+H 2O-2H] + [M+Al+2H 2O-2H] + 4b c C 4H 5N 3O 2.55 (8.) 5b d C 5H 6N 2O.56 (7.3) 6b e C 6H 6N 2O (5.) 7b f C 5H 4N 2O (4.) [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] (6.) [M+Al+Cl+H 2O-H] (3.9) [M+Al+Cl+2H 2O-H] + [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] (4.8) [M+Al+2Cl] + [M+Al+2Cl+H 2O] (.6) [2M+Al-2H] + [2M+Al+H 2O-2H] (.8) [2M+Al+Cl-H] (.) [2M+Al+Cl+H 2O-H] + [2M+Al+2Cl] (.4) (.5) [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] (.3) [3M+Al-2H] + [3M+2Al+Cl+H 2O-4H] (2.6) (.8) (3.5) [3M+2Al+2Cl-3H] + [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] (4.6) (2.9) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa (2.2) [M+H-OH] +. c También se observa (3.2) [M+H-OH] +. d También se observa (3.5) [M+H-OH] +. e También se observa (.2) [M+H-OH] +. f También se observa (.8) [M+H-H 2O] +. 9

137 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Tabla 3.3. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8a-3a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto 8a C 4H 4N 2O 2 9a C 5H 6N 2O 2 [M+H] (3.7) [M+Al+H 2O-2H] + [M+Al+2H 2O-2H] (2.6) [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] + a b C 6H 7N 3O (.9) a c C 6H 8N 2O (2.8) 2a d C 6H 6N 2O (.2) 3a e C 5H 5N 3O (.8) [M+Al+Cl+H 2O-H] (.9) [M+Al+Cl+2H 2O-H] + [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] (5.3) (2.4) [M+Al+2Cl] (3.8) [M+Al+2Cl+H 2O] (.3) [2M+Al-2H] (5.3) [2M+Al+H 2O-2H] (5.5) (2.8) (2.) [2M+Al+Cl-H] (3.6) [2M+Al+Cl+H 2O-H] + [2M+Al+2Cl] (5.5) [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] + [3M+Al-2H] (.5) [3M+2Al+Cl+H 2O-4H] (.4) [3M+2Al+2Cl-3H] (.5) [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] + a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa 2.53 (7.) [M+H-CH 2CO] +. c También se observan 97.4 (3.7) [M+H-C 2H 4O] +, (3.) [M+H-H 2O] + y (.) [M+H-OH] +. d También se observan los iones (3.3) [M+H-COOCH 3+H 2O] +, (.) [M+H-CH 3OH] +, 4.3 (4.7) [M+H-CH 3OH+H 2O] +, (.5) [M+Na] +. e También se observan los iones (2.9) [M+H-NHCO] +, (.4) [M+H-NH 3] +. 2

138 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.4. Resumen de los iones a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 8b-3b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm). 8b Ion/Compuesto C 4H 4N 2O 2 [M+H] (.2) [M+Al+H 2O-2H] + [M+Al+2H 2O-2H] + [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] + 9b b C 5H 6N 2O (4.2) b c C 6H 7N 3O (7.) b d C 6H 8N 2O (4.) 2b e C 6H 6N 2O (4.4) 3b C 5H 5N 3O (2.8) [M+Al+Cl+H 2O-H] (8.6) [M+Al+Cl+2H 2O-H] (.8) [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] (4.) [M+Al+2Cl] (8.6) (5.7) [M+Al+2Cl+H 2O] (4.5) [2M+Al-2H] + [2M+Al+H 2O-2H] + [2M+Al+Cl-H] (.3) [2M+Al+Cl+H 2O-H] (6.) [2M+Al+2Cl] (6.2) (3.2) (2.4) (2.3) [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] (.4) [3M+Al-2H] + [3M+2Al+Cl+H 2O-4H] + [3M+2Al+2Cl-3H] + [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] + a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-5%); verde (5-75%); amarillo (75-%). b También se observa el ion.478 (2.6) [M+H-OH] +. c También se observa 2.52 (2.6) [M+H-CH 2CO] +. d También se observan (3.) [M+H-H 2O] +. e Tambiién se observan los iones (.8) [M+H-CH 3OH] +, 4.3 (3.8) [M+H-CH 3OH+H 2O] +. 2

139 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Una vez más parecería seguir siendo válida la interpretación antes realizada acerca del significado de los componentes principales obtenidos. El primer componente principal (PC) resalta las variables frecuentemente más intensas mientras que el segundo componente principal (PC2) contrastaría la ocurrencia de especies desprotonadas entre las variables (Figura 3.23 b), aunque en este caso no es estrictamente cierto para las variables que presentan valores pequeños en los pesos de PC2. Los espectros de masa representativos obtenidos con aluminio para los N-óxidos 3a-3a y 3b-3b, donde pueden observarse los perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de cada N-óxido isómero se muestran en las Figuras En los espectros de masa de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b (Figura 3.24), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.25) y 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.27), se observaron como especies predominantes las moléculas protonadas así como los iones aducto con aluminio conteniendo 2 moléculas del compuesto neutro junto a 2 contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl] +, ubicándose todos los compuestos en la mitad inferior de la Figura 3.23 a). Si bien los perfiles para cada isómero resultaron muy similares, las diferencias exhibidas entre las intensidades relativas de las especies antes mencionadas permitieron su distinción. Para los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.24), 2-hidroxipirazina 8a y 8b (Figura 3.26) y 2-(-hidroxietil)pirazina a y b (Figura 3.28) se hizo evidente la presencia en los espectros del ion [2M+Al-2H] + en los -N-óxidos y no en los 4 N- óxidos, así también resultó perceptible la presencia del ion [2M+Al+2Cl] + en los 4-Nóxidos y no en los -N-óxidos. Este comportamiento se comprobó además en la Figura 3.23 a), donde los -N-óxidos se ubicaron en la mitad superior y los 4-N-óxidos en la inferior, en correspondencia con la posición de las especies respectivas predominantes de la Figura 3.23 b). Un comportamiento similar se observó para los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura 3.25) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 2a y 2b (Figura 3.28), donde fueron también observados los iones aducto con aluminio [2M+Al+2Cl] + en los espectros de los 4-N-óxidos y no así en los de los -N-óxidos. Sin embargo, el ion aducto con aluminio [2M+Al-2H] + no se encontró presente en los espectros de estos compuestos y en su lugar se observó el ion aducto [M+Al+Cl+H 2 O-H] + que aunque presentó una intensidad relativamente baja en los -N-óxidos, no se evidenció en los 4-N-óxidos. De 22

140 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 esta manera, la conjunción de especies mutuamente excluyentes facilitó la distinción entre los isómeros de cada uno de los compuestos anteriores de manera sencilla y notoria. 6 a) B 4 PC2 PC PC b) E,8,6,4,2, Código Ion [M+H] + [M+Al+H 2O-2H] + 2 [M+Al+2H 2O-2H] + [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] + [M+Al+Cl+H 2O-H] + 2 [M+Al+Cl+2H 2O-H] + [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] + 2 [M+Al+2Cl] + 2 [M+Al+2Cl+H 2O] + 2 [2M+Al-2H] + 2 [2M+Al+H 2O-2H] + 2 [2M+Al+Cl-H] + 2 [2M+Al+Cl+H 2O-H] + 22 [2M+Al+2Cl] [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] + 3 [3M+Al-2H] + 32 [3M+2Al+Cl+H 2O-4H] [3M+2Al+2Cl-3H] [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] + -,2 -,4 -,6 -,8,,,2,3,4,5,6,7,8,9, PC Figura Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales PC-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con aluminio. 23

141 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina A diferencia de los resultados antes obtenidos con calcio y cobre, los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa con aluminio (Figura 3.26) iones aducto, como el ion [2M+Al-2H] + presente en el -N-óxido, que permiten diferenciarlos sin evidencia de iones producto de reacciones de descarboxilación. Finalmente, los N-óxidos de 2-acetamidopirazina a y b (Figura 3.27) y 2- carbamoilpirazina 3a y 3b (Figura 3.29), presentaron diferencias más sutiles en los perfiles observados en sus espectros de masa respecto a los otros metales. En estos casos, fue necesaria la inspección de las intensidades relativas de las especies, por ejemplo el ion aducto [M+Al+2Cl] +, para encontrar diferencias entre ambos N-óxidos isómeros. Además, la baja abundancia relativa de los aductos con aluminio de los N- óxidos de la 2-acetamidopirazina a y b, resultó en la obtención de espectros muy similares a los obtenidos en la sección 3.3, donde resultó predominante la molécula protonada [M+H] + y el mismo ion producto de fragmentación. Cabe notar que las moléculas protonadas de estos compuestos habían presentado los menores valores de E /2 del conjunto de compuestos estudiado. La formación de complejos con aluminio para los - y 4- N-óxidos de los compuestos estudiados permitió distinguir claramente ambos isómeros en la mitad de los casos, al comparar la identidad de las diferentes especies observadas en los espectros de masa obtenidos con cada uno. Sin embargo, en la mitad restante del conjunto de compuestos estudiado, la utilización de este metal no resultó ventajosa, ya que se observaron pocas especies, presentes en ambos isómeros, que sólo diferieron en sus intensidades relativas. 24

142 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] m/z [%] [M+H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] m/z [%] [M+H] [2M+Al-2H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+Cl-H] [3M+Al-2H] m/z [%] [M+H] [2M+Al+2Cl] [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] m/z Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4. 3a 3b 4a 4b [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) iones fragmento 25

143 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] +.59 [M+Al+Cl+2H 2O-H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo a [3M+2Al+3Cl+H 2O-2H] m/z [%] [M+H] +.56 [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] m/z [%] [M+H] [M+Al+Cl+H 2O-H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento m/z [%] [M+H] [M+H] + [2M+Al+2Cl] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) iones fragmento [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] m/z Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos 5b 6a 6b

144 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+H] [M+Al+H 2O-2H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al-2H] [2M+Al+Na+Cl-2H] m/z [%] [M+H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+H 2O-2H] m/z [%] [M+Al+2H 2O-2H] [2M+Al-2H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [3M+Al-2H] m/z [%] [M+H] [M+Al+Cl+2H 2O-H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] a 7b 8a 8b m/z Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8. 27

145 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina [%] [2M+Al+2Cl] + [M+H] [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) iones fragmento 8 [M+H] Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa 4 [M+Al+2Cl+H 2O] m/z [%] [M+H] + [M+H] [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [2M+Al+2Cl] m/z [%] [M+H-CH 2CO] [M+H] m/z [%] [M+H-CH 2CO] + [M+H] [M+Al+2Cl] Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo. 28 9a 9b a [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento m/z b [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento

146 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [%] [M+H-H 2O] [M+H] [2M+Al+Cl-H] [2M+Al+2Cl] m/z [%] [M+H-CH 3OH] [M+H] [M+Na] [M+Al+Cl+H 2O-H] b [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento m/z [%] [M+H] [M+H] [M+Al+Cl+H 2O-H] [M+Al+2Cl] [2M+Al-2H] [2M+2Al+Cl+H 2O-4H] m/z 2a [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento 2b [2M+Al+2Cl] [2M+2Al+3Cl+2H 2O-2H] m/z a [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos -hidroxietilo y metoxicarbonilo 2. 29

147 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Intensidad relativa [%] [M+H] + [M+H] [xm+al+2cl+y(h 2O)] + (x=-2) (y=-) [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + (x=-3) (y=-2) (z=-) [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + (x=2-3) (y=-2) (z=-3) iones fragmento [M+Al+Cl+H 2O-H] [M+H-NHCO] [2M+Al+Cl-H] m/z 3a Intensidad relativa [%] [M+H] [M+H] + [xm+al+2cl+y(h 2O)] + [xm+al+zcl+y(h 2O)-(2-z)H] + [xm+2al+zcl+y(h 2O)-(5-z)H] + iones fragmento [M+Al+2Cl+H 2O] b (x=-2) (y=-) (x=-3) (y=-2) (z=-) (x=2-3) (y=-2) (z=-3) m/z Figura Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los -N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 3. Vale la pena recordar el comportamiento ante la complejación frente a estos metales, estudiado previamente en el capítulo 2 con ligandos análogos, concretamente con los N-óxidos isómeros de la 2- y 3- hidroxipiridina y 2. En ese estudio, pudieron establecerse diferencias entre los dos regioisómeros, considerando la capacidad del isómero sustituído en la posición 2- de actuar como ligando bidentado y formar quelatos estables al desprotonarse, formando así principalmente iones aducto monocargados. En contraste, el isómero sustituído en posición 3- no mostró evidencia de estructuras desprotonadas en sus iones aducto; en cambio, se observaron iones aducto dicargados, o monocargados con el contra-ion del metal unido, dependiendo del ion metálico, aparte de una mayor preponderancia de la molécula protonada. Cabe mencionar que en el capítulo 2 fue posible diferenciar ambos isómeros sobre la base de la identidad de las distintas especies exhibidas con cada uno de los metales. Más aún, la consideración de especies con intensidad relativa mayor a 25% 3

148 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 fue suficiente para distinguir ambos isómeros con todos los metales empleados. En cambio, para distinguir los isómeros de algunos N-óxidos de los compuestos 3a-3a de 3b-3b fue necesario considerar especies con intensidad relativa mayor a 5% y no resultó lo mismo el empleo de cualquier metal. Incluso, las diferencias encontradas entre isómeros residieron en muchos casos, no en la observación de distintas especies sino en diferencias en las intensidades relativas, sobre todo con cobre y aluminio. De todas formas, en la mayoría de los casos se encontraron diferencias entre los isómeros, obteniéndose los mejores resultados globales con calcio. El estudio sobre los N-óxidos isómeros de hidroxipirazina, que sería la extrapolación directa del trabajo de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina, arrojó conclusiones análogas para los 3 metales estudiados, observándose una predominancia de iones aducto con especies desprotonadas para el -N-óxido, y principalmente, la molécula protonada y iones aducto con especies neutras para el 4- N-óxido. La transición del estudio por MS de dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina a un conjunto de pares de - y 4-N-óxidos de pirazinas monosustituídas representó un desafío que aunque reveló diferencias entre isómeros no siempre resultaron fáciles de interpretar. La aplicación de PCA permitió analizar y racionalizar algunas de las diferencias encontradas para el conjunto de compuestos estudiado, que resultaron dependientes de la naturaleza del sustituyente, y en segundo plano de la posición del N-óxido. Esto resulta razonable ya que ciertos sustituyentes podrían interactuar con el metal y otros no. De esta manera, en los espectros de masa de los -N-óxidos que presentan sustituyentes con protones acídicos (válido para los grupos amino y metilo en posición orto a nitrógeno heteroaromático, carboxilo, hidroxilo y N-acetilo), se observaron iones aducto monocargados que presentaban un ligando desprotonado junto a los metales, y no así para la mayoría de los -N-óxidos que presentaban un sustituyente sin protones acídicos. Por otra parte, para la mayoría de los 4-N-óxidos, se observaron iones aducto dicargados o conteniendo el contra-ion del metal, así como una mayor preponderancia (respecto de sus -N-óxidos isómeros) del ion correspondiente a la molécula protonada. Estas diferencias observadas podrían explicarse considerando la capacidad de los -N-óxidos de pirazinas con protones acídicos en sus sustituyentes de formar quelatos estables al desprotonarse, en contraparte a sus isómeros 4-Nóxidos, de manera análoga a lo observado para los N-óxidos de 2- y 3-hidroxipiridina. 3

149 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina 3.5. Análisis por Espectroscopía RMN En paralelo al análisis efectuado por espectrometría de masa, se llevó a cabo la aplicación de espectroscopía de RMN para la determinación sin equívocos de la posición de la función N-óxido en el conjunto de N-óxidos de pirazina 2-sustituídos sintetizados (Figura 3.2, pág. 75). Ya ha sido demostrado el empleo de la resonancia magnética multinuclear 4 incluyendo espectroscopía RMN 4 N y 5 N para proveer asignaciones inequívocas de la función N-óxido 42. Sin embargo, el análisis de compuestos orgánicos nitrogenados por técnicas de RMN 4 N y 5 N está a menudo obstaculizado por la baja sensibilidad de estos núcleos y la superposición de señales de desplazamientos químicos similares, lo que complica la interpretación de los espectros de RMN 43. Por ejemplo, en los espectros de RMN 5 N de N-óxidos de metilpirazinas 44 se observaron diferencias menores a ppm entre los desplazamientos químicos de 5 N de ambos nitrógenos en los - y 4- N-óxidos. Además, a partir de estudios de desplazamientos químicos de 5 N en N-óxidos de piridinas sustituídas, se advirtió que este núcleo era muy sensible al efecto de los sustituyentes 45. Curiosamente, se ha encontrado que cuando un sustituyente se encuentra ubicado en el carbono orto al nitrógeno del anillo aromático, el efecto sobre los desplazamientos químicos de 5 N en pirazinas sustituídas y sus N-óxidos 46 se encuentra relacionado con el efecto que un sustituyente idéntico tiene sobre los desplazamientos químicos de 3 C en el carbono orto de bencenos sustituídos. Por otro lado, en N-óxidos de alquil- y fenilpirazinas 47, fue informado que los desplazamientos químicos de 3 C asignados a los carbonos en orto al grupo N-óxido estaban desplazados a campos altos (~ ppm) respecto a los compuestos no oxidados (alquil- y fenilpirazinas). Por lo tanto, si pudiera sacarse provecho de este efecto del grupo N-óxido sobre los desplazamientos químicos de 3 C para otros N- óxidos de pirazinas sustituídas, podría encontrarse una alternativa conveniente frente a los experimentos de RMN de nitrógeno para la determinación inequívoca de la posición del N-óxido. Otra alternativa que podría servir también para distinguir la posición del N-óxido es la medición de constantes de acoplamiento protón carbono a larga distancia ( n J(C,H); n > ). Por ejemplo, en el caso de N-óxidos de metilpirazinas 47, han sido informados 32

150 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 valores de 3 J(C,H) a través del grupo N-óxido cercanos a ~. Hz mientras que los valores a través del átomo de nitrógeno no oxidado se encuentran próximos a 2-3 Hz. Sin embargo, se han desatado muchas discusiones alrededor de la precisión, confiabilidad y simplicidad del análisis de datos y determinación de las constantes de acoplamiento n J(C,H) 48. Además, el requisito de alta resolución para la medición de sus pequeños valores (por lo general, - Hz) implica largos tiempos de adquisición en los experimentos de RMN. Por lo tanto, teniendo en cuenta las desventajas anteriores, una alternativa más simple y rápida es deseable. A continuación, se presentan los resultados obtenidos a partir del análisis por técnicas de RMN 2D para asignar los átomos de carbono y la posición del grupo N- óxido de manera inequívoca para cada compuesto del conjunto estudiado (Figura 3.2). Luego, se evaluó la posibilidad de diferenciar entre - y 4- N-óxidos partiendo únicamente de los desplazamientos químicos de RMN 3 C, y para ello se aplicó la técnica quimiométrica de PCA (Apéndice A.4, pág. 26) al conjunto de datos espectroscópicos para analizar el efecto de los sustituyentes. De este modo, los efectos de los sustituyentes y de la posición del N-óxido fueron comparados a partir de la distribución observada en el gráfico de puntuaciones, y de los valores de los pesos y fue extraída e identificada la relación existente entre las variables originales (desplazamientos químicos de 3 C) y los componentes principales Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D Los espectros RMN H, 3 C HSQC-DEPT y HMBC de las muestras 3a-3a y 3b- 3b fueron adquiridos a partir de soluciones en deuterocloroformo, a menos que los compuestos fueran insolubles en este solvente. En caso de ser poco solubles, se agregaron unas pocas gotas de metanol-d 4 (2%) y de lo contrario, se utilizó dimetilsulfóxido-d 6 para disolverlas. La primera asignación tentativa de las señales en los espectros de RMN H de los N-óxidos de pirazina 2-sustituídas fue realizada considerando el comportamiento del acoplamiento H, H característico ya conocido para el N-óxido de pirazina 49 y N- óxidos de pirazina 2-sustituídas 5 a partir de datos de literatura. La constante de acoplamiento orto 3 J(H-5,H-6) es superior a 4. Hz mientras la constante de acoplamiento para 5 J(H-3,H-6) es inferior a. Hz. La constante de acoplamiento a 33

151 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina través del átomo de nitrógeno 4 J(H-3,H-5) oscila entre -.5 Hz en los -N-óxidos mientras que varía en el rango de.-2. Hz en los 4-N-óxidos. Figura 3.3. Asignación de los protones aromáticos en los espectros de RMN H del par de N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b realizado en DMSO-d 6. 34

152 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Como ejemplo, en la Figura 3.3, se muestra la asignación de los protones aromáticos en los espectros de RMN H del par de N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b, teniendo en cuenta las consideraciones anteriores. Como puede verse en la Figura 3.3, la señal correspondiente al H-3, para 9a y en la mayoría de los -N-óxidos, resulta la señal más desprotegida que suele aparecer a diferencia de las otras dos señales como un singulete ancho, ya que los pequeños valores de las constantes de acoplamiento hace que no se vean resueltos en la señal. En el caso de los 4-N-óxidos, la posición relativa de la señal de H-3 es variable, pero es fácilmente distinguible por presentarse como un doble doblete con los menores valores de constantes de acoplamiento. Las señales correspondientes a los H-5 y H-6 aparecen también como doble dobletes en los 4-N-óxidos, pero se distinguen fácilmente teniendo en cuenta la magnitud de las constantes de acoplamiento tal y como se mencionó anteriormente. Sin embargo, esta metodología falla en distinguir entre el H-5 y el H-6, en el caso de los -N-óxidos, ya que se presentan en general como dobletes, y aunque a veces alguno de ellos se presente como doble doblete (Figura 3.3), no es posible realizar una asignación inequívoca dada la similitud entre los pequeños valores esperados de 5 J(H-3,H-6) y 4 J(H-3,H-5), que además pueden aparecer no resueltos en la señal. La precisión en la medición de constantes de acoplamiento spin-spin de los protones en la cercanía al nitrógeno se ve reducida por los efectos de ensanchamiento cuadrupolar de las señales debido a la interacción con el átomo de nitrógeno 5. Este efecto es especialmente importante en el caso de los -N-óxidos, provocando que las señales no aparezcan resueltas y no se pueda medir el 4 J(H-3,H-5), en contraste con los 4-Nóxidos, donde la presencia del átomo de oxígeno unido al nitrógeno elimina en medida considerable este ensanchamiento cuadrupolar. No obstante, pudieron lograrse asignaciones confiables del H-5 y el H-6 en los -Nóxidos, considerando las correlaciones observadas en los espectros de HMBC (Figura 3.3). En todos los N-óxidos, el H-5 correlaciona con el C-3 y el C-6 mientras que el H- 6 correlaciona con el C-5 y generalmente no correlaciona (o si lo hace, es muy débilmente) con el C-3. Las resonancias correspondientes de 3 C unidos a cada H fueron atribuidas considerando en un paso previo las correlaciones observadas en el espectro HSQC. Finalmente, las asignaciones fueron fácilmente confirmadas con el espectro de HMBC, considerando la señal del C-2, ya que el H-3 y el H-6 correlacionan con este carbono cuaternario, mientras que la correlación con H-5 suele ser muy débil, si es que se observa (Figura 3.3). 35

153 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Figura 3.3. Correlaciones H- 3 C observadas (en negro) en los espectros de RMN 2D HMBC de los -N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas (en gris se muestran las correlaciones débiles). Las asignaciones de los desplazamientos químicos de RMN H y 3 C de los compuestos 3a-3a y 3b-3b se muestran en las Tablas 3.5 y 3.6, respectivamente. En estas Tablas, se citan además los valores encontrados en la literatura y disponibles para ciertos compuestos, que permiten la comparación con los aquí obtenidos. En lo posible, se trató de que coincidan los solventes utilizados, pero en algunos casos esto no fue posible. Como puede observarse en las Tablas 3.5 y 3.6, y ya se había mencionado antes, debido a la baja solubilidad de algunos compuestos en CDCl 3, los espectros no se registraron en el mismo solvente para todos los compuestos. En general, los compuestos que no poseen capacidad de formar enlaces de hidrógeno exhiben sólo pequeñas diferencias en sus desplazamientos químicos de RMN 3 C en soluciones de DMSO-d 6 y CDCl 3. Investigaciones con respecto al efecto de estos solventes comunes sobre los desplazamientos químicos, fueron llevadas a cabo con el N-óxido de piridina 5 y pirazinas sustituídas 52, mostrando en todos los casos desviaciones no mayores a.5 ppm (~%) en los desplazamientos químicos de RMN 3 C entre los distintos solventes. En este trabajo, los compuestos 9a y 9b fueron disueltos en DMSO-d 6 y CDCl 3, observándose también desviaciones menores al %. Como puede observarse en la Tabla 3.5, en el caso de los desplazamientos químicos de RMN H, el efecto del solvente presenta una influencia mayor con desviaciones que alcanzan.3 ppm (~4%) en los desplazamientos químicos de RMN H. La transición de solventes ligeramente polares del tipo de CDCl 3 a más polares (DMSO-d 6 ), puede dar lugar a la formación de asociaciones e interacciones intermoleculares con los solventes, afectando en mayor medida a los protones que se encuentran en posiciones próximas a los grupos que interactúan 5. 36

154 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Los valores mostrados en las Tablas 3.5 y 3.6 coinciden dentro de las desviaciones esperables con los valores de literatura hallados. En cuanto a las asignaciones de los desplazamientos químicos de 3 C, no se encontraron asignaciones en la literatura excepto para cuatro de los compuestos estudiados. Sin embargo, se encontraron discrepancias en las asignaciones de los protones H-5 y H-6 en los compuestos 8a y 9a, además de desviaciones sistemáticas de ~.4 ppm en los desplazamientos químicos de H de 8a (probablemente debido a la calibración). Cabe destacar que la asignación de literatura del compuesto 8a se hizo por comparación con los desplazamientos del compuesto 9a, por lo que resulta interesante considerar primero este caso. En la Tabla 3.5, puede notarse que para aquellos -N-óxidos en los que se observa un doble doblete, éste resulta coincidente con la señal del H-6 donde se estaría manifestando 5 J(H-3,H-6). Este hecho resulta consistente además con que las señales de los H-3 y H-5 aparecen como señales anchas, debido al ensanchamiento cuadrupolar, que explicaría porque no se observan los acoplamientos con valores más pequeños que involucran estos protones en los -N-óxidos. Los argumentos anteriores, en adición a las correlaciones observadas en los espectros de HMBC justifican entonces las asignaciones realizadas para los protones H-5 y H-6, que como ya se había mencionado resultan difíciles de asignar y no es sorprendente que se encuentren intercambiados en trabajos publicados en los que no se disponía de técnicas de RMN 2D que asistieran en la asignación de las señales. Otro argumento a favor de la asignación realizada para el compuesto 8a reside en la comparación de los desplazamientos químicos de RMN 3 C con aquellos del compuesto precursor no oxidado 8. En un trabajo 59 se observó al comparar los valores de desplazamientos químicos de RMN 3 C del N-óxido de la 2-hidroxipiridina con los de la 2-hidroxipiridina, disueltos ambos en DMSO-d 6, una diferencia de 4.7 ppm en el C-2 mientras que en los C-3, C-5 y C-6, las diferencias observadas resultaron menores a ppm entre ambos compuestos. Curiosamente, al comparar los valores del compuesto 8a con los valores de literatura 53 de la 2-hidroxipirazina disuelta en DMSOd 6, se encuentra una diferencia de 4.2 ppm en el C-2 y diferencias menores a.3 ppm en los C-3, C-5 y C-6, de manera análoga a lo observado en el derivado de piridina. 37

155 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Comp. 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 7a 7b 8a 8b 9a 9b a b a b 2a 2b 3a 3b Tabla 3.5. Desplazamientos químicos de RMN H del conjunto de N-óxidos de pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-3a y 3b-3b, junto a los valores de literatura (entre corchetes). Sustit. desplazamiento químico H (ppm) multiplicidad J (Hz) H-3 H-5 H-6 XH CH 3 CH 8.65 [8.62] 8.37 [8.36] Cl s.a d (4.) 8.6 [8.2] 8.3 [7.96] dd (.5;.) dd (4.;.5) 8.2 [8.6] 7.7 [7.73] NH 2 d (.5) d (4.) 7.46 [7.47] 7.45 [7.36] dd (.5;.8) dd (4.;.5) 8.46 [8.49] 8.34 [8.36] CH 3 s.a d (4.) 8. [8.9] 7.96 [8.4] m m (4.) COCH 3 s.a d (4.) dd (.5;.5) dd (4.;.5) 9.9 [9.7] 8.8 [8.85] COOH d.a d.a (4.) 8.62 [8.64] 8.5 [8.5] dd (.5;.5) dd (4.;.5) 8. [8.5] 7.32 [8.36] OH s.a d (4.5) 7.5 [7.49] 7.5 [7.2] dd (2.;.8) dd (5.5; 2.) 8.29 [8.7] 8.7 [8.8] s.a d (4.) 8.49 [8.5] 8.7 [8.36] OCH 3 s.a. d (4.) 7.78 [7.65] 7.75 [7.6] dd (.3;.8) dd (4.;.3) 8.7 [8.6] 7.97 [7.97] dd (.5;.5) dd (4.;.5) 9.67 [9.44] 8.24 [8.2] NHCOCH 3 d (.) d (4.) 9.22 [8.9] 7.88 [7.98] s.a dd (4.;.5) CHOHCH 3 s.a d (4.) dd (.5;.5) dd (4.;.5) 8.89 [8.9] 8.49 [8.5] COOCH 3 s.a d (4.5) 8.76 [8.79] 8.22 [8.26] dd (.5;.5) dd (4.;.5) 9.4 [9.7] 8.67 [8.68] CONH 2 s.a d.a (4.) 8.54 [8.55] 8.48 [8.47] dd (2.;.) dd (4.; 2.) a Soluciones conteniendo 2% metanol-d [8.22] dd (4.;.8) 8.26 [8.22] d.a. (4.) 8. [8.4] d (4.) 7.85 [7.8] dd (4.;.8) 8.4 [8.27] d (4.) 8.36 [8.4] d.a (4.) 8.9 dd (4.;.8) 8.5 dd (4.;.5) 8.63 [8.6] d (4.) 8.63 [8.64] d.a (4.) 7.97 [7.7] d (4.5) 7.56 [7.5] d.a (5.5) 8.8 [8.6] dd (4.;.5) 8.33 [8.8] dd (4.;.5) 8. [7.87] d.a (4.) 8.4 [8.6] d.a (4.) 8.7 [8.38] dd (4.;.) 8.2 [8.24] dd (4.;.5) 8.3 dd (4.;.8) 8.4 dd (4.;.5) 8.5 [8.7] dd (4.5;.8) 8.57 [8.6] dd (4.;.5) 8.49 [8.48] dd (4.;.) 8.58 [8.59] dd (4.;.) Solvente CDCl 3 [CDCl 3] 24 CDCl 3 [CDCl 3] s.a DMSO-d 6 [DMSO-d 6] s.a DMSO-d 6 [DMSO-d 6] CDCl 3 s [CDCl 3] CDCl 3 s.a [CDCl 3] CDCl s CDCl s 3 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] s 4.7 s 4. s 3.9 s 2.35 s 2.23 s.a 4.5 d.67 (5.) d (6.5) 3.99 s.a.55 d (6.5) 4.2 s 4.6 s 9.24 s.a 8.37 s.a 8.29 s.a 8. s.a 5.6 dq (6.5; 5.) 4.9 q (6.5) DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 29 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 232 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 233 CDCl 3 [CDCl 3] 5 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 29 CDCl 3 ]5 [CDCl 3 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 29 a CDCl 3 [DMSO-d 6] 5 a CDCl 3 [DMSO-d 6] 5 CDCl 3 CDCl 3 a CDCl 3 [CDCl 3] 25 CDCl 3 [CDCl 3] 25 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 29 DMSO-d 6 [DMSO-d 6] 29 38

156 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Tabla 3.6. Desplazamientos químicos de RMN 3 C del conjunto de N-óxidos de pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-3a y 3b-3b junto a los valores de literatura (entre corchetes). Compuesto 3a 3b Sustituyente Cl a Soluciones conteniendo 2% metanol-d 4. desplazamiento químico 3 C (ppm) C-2 C-3 C-5 C-6 CH 3 CO 39.5 [39.7] 5.7 [5.9] 47.6 [48.5] 33.5 [34.3] 44.8 [46.3] 33. [34.6] 34.7 [35.9] 45.9 [47.3] 4a NH 2 4b a 5b CH [44.4] 58. [57.6] 47.9 [47.9] 32.9 [32.9] 45.2 [45.4] 3.3 [3.3] 33.6 [33.6] 46.7 [46.7] 4.5 [4.4] 2.7 [2.7] 6a COCH 3 6b a COOH 7b a OH 8b a 9b OCH a NHCOCH 3 b a CHOHCH 3 b a COOCH 3 2b a CONH 2 3b Solvente CDCl 3 [Acetona-d 6] 4 CDCl 3 [Acetona-d 6] 4 DMSO-d 6 DMSO-d 6 CDCl 3 [CDCl 3] 47 CDCl 3 [CDCl 3] 47 CDCl 3 CDCl 3 DMSO-d 6 DMSO-d 6 DMSO-d 6 DMSO-d 6 CDCl 3 DMSO-d 6 CDCl 3 DMSO-d 6 CDCl 3 a CDCl 3 a CDCl 3 CDCl 3 a CDCl 3 CDCl 3 DMSO-d 6 DMSO-d 6 39

157 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Análisis quimiométrico de los datos de RMN 3 C El paso siguiente ya contando con los desplazamientos químicos de RMN 3 C de los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas 3a-3a y 3b-3b fue buscar si existe una relación entre estos datos para la asignación de la posición del grupo N-óxido independientemente de la naturaleza y posición del sustituyente. Esta relación sería de especial utilidad para N-óxidos de pirazinas polisustituídas, donde un menor número de protones aromáticos impediría la aplicación de la estrategia usada en la sección anterior para la asignación inequívoca. Un primer acercamiento a dicha relación consistió en observar la distribución que toman los datos de desplazamientos químicos de RMN 3 C, para ver si existe alguna tendencia que permita distinguir la posición del N-óxido a partir de los mismos. Una posible representación gráfica de los datos de la Tabla 3.6 correspondientes a los carbonos del anillo aromático se muestra en la Figura Desplazamiento químico RMN 3 C (ppm) a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 7a 7b 8a 8b 9a 9b abab2a2b3a3b Compuesto C-2 C-3 C-5 C-6 Figura Representación de los desplazamientos químicos RMN 3 C de los carbonos del anillo aromático de los compuestos 3a-3a y 3b-3b a partir de los datos de la Tabla 3.6. Como se observa en la Figura 3.32, los desplazamientos químicos de RMN 3 C correspondientes a los carbonos del anillo aromático C-2 y C-6 presentan una tendencia marcada y opuesta a los carbonos C-3 y C-5 al comparar cada -N-óxido de los compuestos 3a-3a con su correspondiente 4-N-óxido isómero 3b-3b. Además, 4

158 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 los desplazamientos químicos de RMN 3 C de los carbonos C-3 y C-5 siguen en general un comportamiento muy similar, lo que sugiere que estas variables se encuentran correlacionadas y que por lo tanto, sería posible reducir el número de variables para explicar la varianza de los datos. Con este objetivo se aplicó PCA (Apéndice A.4. pág. 26) al conjunto de datos conformado por los desplazamientos químicos de RMN 3 C de los carbonos C-2, C-3, C-5 y C-6 de los compuestos 3a-3a y 3b-3b mostrados en la Tabla 3.6. Los primeros dos componentes principales obtenidos describieron 99.94% de la varianza de los datos. En la Figura 3.33 se muestra el gráfico de puntuaciones de PC-PC2. Las definiciones de cada PC se muestran en las ecuaciones 3. y 3.2 junto con los valores de los pesos (loadings), es decir, los coeficientes que acompañan las variables. PC =.53 C C C C-6 (3.) PC2 = -.64 C C C C-6 (3.2) -N-O 4-N-O 2 PC2 (.27%) PC (99.68%) -2 Figura Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) en el plano de los componentes principales PC-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos de la Tabla 3.6. Como se observa en la ecuación 3., el primer componente principal (PC) representa esencialmente la suma de los desplazamientos químicos de RMN 3 C con todos los carbonos casi equitativamente ponderados. Por otro lado, el segundo componente principal (PC2) representa un contraste entre los desplazamientos 4

159 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina químicos de RMN 3 C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de nitrógeno (C-3 y C-5 versus C-2 y C-6), como se deriva a partir de la ecuación 3.2. A partir de la inspección de la Figura 3.33, puede notarse que PC parece separar los compuestos de acuerdo al sustituyente. Además, la posición del N-óxido no parece ejercer un efecto significativo sobre las puntuaciones de PC ya que ambos isómeros del par de N-óxidos de cada uno de los compuestos muestran en la mayoría de los casos valores similares, apareciendo más o menos alineados verticalmente (diferencias <.5 ppm aprox.). Por otra parte, PC2 parece separar los compuestos en dos grandes grupos, uno con puntuaciones positivas que incluye la mayoría de los -N-óxidos, y otro con puntuaciones negativas incluyendo a todos los 4-N-óxidos y a unos pocos -N-óxidos. De este modo, la mayor parte de los N-óxidos de las pirazinas 2-sustituídas fueron separados y diferenciados de acuerdo a la posición del átomo de nitrógeno oxidado. La separación (diferencia entre las puntuaciones de PC2) entre cada par de N-óxidos isoméros varía desde 6 ppm para 8a/ 8b hasta 29 ppm para a/ b. En relación a la ecuación 3.2 que define a PC2, es interesante notar que los coeficientes positivos (pesos de C-3 y C-5) resultan muy similares mientras que los negativos (pesos de C-2 y C-6) están más polarizados probablemente debido al efecto variable del sustituyente en el C-2 (cf. Figura 3.32). Curiosamente, ya se había encontrado una tendencia similar al comparar los valores de desplazamientos químicos de RMN 3 C de piridinas sustituídas con los de sus N-óxidos 54,55, observando un efecto protector de cerca de la misma magnitud en los C-2, C-4 y C-6 por la presencia del N-óxido y un efecto opuesto y mucho menor en los C-3 y C-5, no muy influenciado por la naturaleza o posición del sustituyente. También fue observado un efecto similar en los espectros de RMN 3 C de N-óxidos de alquil- y fenilpirazinas 47, el cual fue racionalizado sugiriendo un aumento de la densidad electrónica (protección) en los C-2 y C-6 de -N-óxidos de pirazinas por retrodonación electrónica desde el grupo N-óxido. Las observaciones anteriores sugieren que podría ser propuesto un índice de N- oxidación para identificar la posición del grupo N-óxido de un modo más general, confiable y simple, de manera análoga a las puntuaciones de PC2 obtenidas por PCA que resultaron ser satisfactorias en la identificación de la posición del átomo de nitrógeno oxidado en la mayoría de los N-óxidos de pirazina 2-sustituídos. 42

160 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Para el cálculo del índice podría introducirse una simplificación considerando sólo dos coeficientes, uno para la suma de los desplazamientos químicos de RMN 3 C de cada par de átomos de carbono unido a un átomo de nitrógeno, un coeficiente positivo (C 35 ) para C-3 + C-5 y uno negativo (C 26 ) para C-β + C-6: INO = C 26 (C-2 + C-6) + C 35 (C-3 + C-5) (3.3) Un valor positivo del índice INO indicaría la presencia de un -N-óxido mientras un valor negativo, un 4-N-óxido a semejanza de las puntuaciones de PC2, siempre que el C-2 sea identificado como el átomo de carbono unido al sustituyente. Valores cercanos a cero podrían conducir a incertidumbre o errores y por lo tanto deberían evitarse. En la Figura 3.33 puede observarse que para los -N-óxidos con sustiyentes dadores fuertes de electrones (4a, 8a y 9a), las puntuaciones de PC2 se encuentran cerca de cero, así como ocurre para los 4-N-óxidos con sustituyentes atractores de electrones (3b, 6b, 7b, 2b y 3b). De hecho, algunas puntuaciones (scores) en el análisis por PCA, especialmente notadas para los compuestos 4a y 9a resultaron negativas a pesar de ser -N-óxidos. Este hecho podría estar relacionado con la dispersión de los datos no distribuidos uniformemente debido a la diferente naturaleza de los sustituyentes. Para evitar valores del índice cercanos a cero, los coeficientes C 35 y C 26 pueden optimizarse maximizando el valor del índice INO para los N-óxidos isómeros de cada par, separándose así los valores de cero lo más posible. Así, se podría reformular el índice como una diferencia entre los promedios de los desplazamientos químicos de RMN 3 C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de nitrógeno, incluyendo el efecto del sustituyente a través de un factor x que multiplique al promedio que contiene el átomo de carbono sustituído (C-2). INO x = x (C-2 + C-6)/2 + (C-3 + C-5)/2 (3.4) La ecuación (3.4) se obtuvo fijando el valor de uno de los coeficientes en la ec. (3.3), C 35 =.5 (promedio de los pesos de C-3 y C-5 en PC2, cf. ec. (3.2)) y calculando el valor del factor x (x = 2 C 26 ), imponiendo la condición que los índices INO para los N-óxidos de cada par se encuentren centrados respecto de cero: INO NO + INO 4NO = x = [(C-γ + C-5) NO + (C-γ + C-5) 4NO ] (3.5) [(C-β + C-6) NO + (C-β + C-6) 4NO ] 43

161 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina En la Tabla 3.7 se presentan los valores optimizados de los factores x obtenidos a partir de la ec. (3.5) para cada par de N-óxidos del conjunto de compuestos sintetizado 3a-3a y 3b-3b. A partir de los valores obtenidos, puede notarse que los sustituyentes dadores fuertes de electrones (NH 2, OH y OCH 3 ) presentan valores alrededor de.9 mientras que los sustituyentes atractores de electrones (Cl, COCH 3, COOH, COOCH 3 y CONH 2 ) adoptan valores cercanos a. Para analizar si en verdad existe una relación con el efecto electrónico del sustituyente, las constantes de Hammett 56 de los sustituyentes fueron también consideradas como se muestra en la Tabla 3.7. Tabla 3.7. Factores optimizados x a y constantes de Hammett p b de los sustituyentes del conjunto de N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas sintetizado 3a-3a y 3b-3b. Sustituyente Factor x a p b Cl NH CH COCH COOH.9.45 OH OCH NHCOCH CHOHCH COOCH CONH a Valores óptimos del factor x calculados usando la ec. (3.5) y los datos de RMN 3 C de la Tabla 3.5. b δos datos para p fueron tomados de la Ref. 56. En la Figura 3.34 se muestra la correlación obtenida entre los factores optimizados x y las constantes de Hammett de los sustituyentes que, como se observa, puede aproximarse por una relación lineal. Además, las desviaciones que se observan no resultan inesperadas si se toma en consideración que las constantes, que sólo toman en cuenta el efecto electrónico del sustituyente, fueron definidas 57 para los primeros 44

162 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 ocho grupos funcionales de la Tabla 3.7 sobre la base de constantes de ionización en agua de ácidos benzoicos sustituídos en para. Como puede observarse en la Figura 3.34, los valores óptimos de x se encuentran distribuidos más o menos uniformemente formando tres grupos de acuerdo al efecto del sustituyente, atractores, dadores fuertes y dadores débiles. Como consecuencia, podrían emplearse índices generales de acuerdo a la naturaleza del sustituyente, evitando así el uso de factores específicos para cada sustituyente. Por ejemplo, considerando tres valores distintos para los factores conforme a los grupos observados, podrían proponerse tres índices de N-oxidación, es decir, INO.9 para sustituyentes dadores fuertes de electrones, INO.95 para sustituyentes dadores débiles de electrones y INO. para sustituyentes atractores de electrones. Entonces, usando la ec. (3.4) puede calcularse el índice, teniendo en cuenta las características del sustituyente al seleccionar el x adecuado. En la Tabla 3.8, se muestran los resultados de esta aproximación que fueron más satisfactorios que aquellos previamente obtenidos a partir de las puntuaciones de PC2 para el conjunto completo de compuestos., X,9 -,5,,5 p Figura Gráfico de los factores optimizados (x) versus las constantes de Hammett ( p ) de los sustituyentes a partir de los datos de la Tabla 3.7. Pero en la Tabla 3.8, puede observarse que si no se realizan suposiciones acerca de la naturaleza del sustituyente, esto es, si se considera un valor medio del factor (x =.95), que se encuentra cercano al valor de efecto nulo del sustituyente (Figura 45

163 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina 3.34), en general, el signo del índice INO.95 resulta consistente con la posición del N- óxido (positivo para -N-óxidos y negativo para 4-N-óxidos). No obstante, para algunos compuestos, los resultados obtenidos a partir del cálculo del índice INO.95 no fueron concluyentes, ya que su valor resultó próximo a cero. Tabla 3.8. Índices de N-oxidación para el conjunto de N-óxidos de pirazinas 2- sustituídas sintetizado 3a-3a y 3b-3b. Índice de N-oxidación a (ppm) Puntuaciones Compuesto Sustituyente INO.9 INO.95 INO. de PC2 (ppm) b 3a Cl 3b a NH 2 4b a CH 3 5b a COCH 3 6b a COOH 7b a OH 8b a OCH 3 9b a NHCOCH 3 b a CHOHCH 3 b a COOCH 3 2b a CONH 2 3b a Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando los valores de x= (.9;.95;.) y los datos de RMN 3 C de la Tabla 3.5. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita. b Valores de las puntuaciones de PC2 obtenidos a partir de la ec. (3.2) y los datos de RMN 3 C de la Tabla

164 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 Por esta razón, la definición de un valor umbral para el INO x mínimo, aunque arbitrario, mientras sea consistente con la incerteza asociada al cálculo del índice, ayudaría a decidir en los casos en que los valores del índice se encuentran cercanos a cero. Teniendo en cuenta que el índice INO x se calcula como una diferencia casi equitativamente ponderada entre dos desplazamientos químicos de RMN 3 C (cf. ec. 3.4), la incerteza esperada para el índice sería cerca del doble de la incerteza de los desplazamientos químicos RMN de 3 C, que además está mayormente influenciada no por la precisión de la medición, sino por desviaciones causadas por diferentes condiciones experimentales (solvente, temperatura). Las observaciones realizadas en la sección anterior relativas al efecto del solvente, despreciando el efecto de la temperatura, indican que podrían esperarse desviaciones en los valores de los desplazamientos químicos de hasta ppm. Luego, aún en el peor caso, la incerteza esperada del índice INO x sería próxima a 2 ppm (~% de los desplazamientos químicos promedio de RMN 3 C). En consecuencia, podría usarse un valor umbral superior a 5-6 ppm para evitar valores que induzcan a error. Resulta interesante examinar en mayor profundidad si los índices aplicados al conjunto estudiado de N-óxidos de pirazina monosustituídos, son aún útiles para identificar la posición del grupo N-óxido en pirazinas disustituídas. Vale la pena mencionar que en el caso de N-óxidos de pirazinas disustituídas sólo son posibles tres patrones de sustitución, 2,3-, 2,5- y 2,6- (Figura 3.35). En estos casos, el signo del índice reflejaría la posición de la función N-óxido relativa al sustituyente localizado en el C-2, el cual puede ser elegido arbitrariamente. Figura Posibles patrones de sustitución en N-óxidos de pirazinas disustituídas. Cuando los sustituyentes se encuentran en meta (2,6-), como ambos átomos de carbono sustituídos pertenecen al mismo término promedio (cf. ec. 3.4), no se 47

165 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina presenta ambigüedad acerca de la localización del factor que da cuenta del efecto del sustituyente, dejando claro que el índice INO x se calcularía de manera similar a la antes empleada. Sin embargo, en los otros patrones de sustitución (2,3- y 2,5-), como los sustituyentes están localizados en átomos de carbono unidos a átomos de nitrógeno opuestos, el efecto del sustituyente debería estar igualmente incluído por un factor que multiplique cada promedio como en la ec Entonces, INO x,y = x (C-2 + C-6)/2 + y (C-3 + C-5)/2 (3.6) Mientras el efecto ejercido por ambos sustituyentes sea similar, parecería razonable usar el mismo valor del factor en ambos promedios, x = y en la ec En la Tabla 3.9 se muestran algunos ejemplos tomados de la literatura 47 junto a los índices usados para las estructuras que se muestran en la Figura Las constantes de Hammett para los sustituyentes fenilo y metilo son -. y -.7, respectivamente 56 y por ende, pueden ser considerados como grupos dadores débiles de electrones. Por consiguiente, puede usarse para ambos el mismo valor del factor que da cuenta del efecto del sustituyente (x, y =.95). Como se muestra en la Tabla 3.9, el índice INO.95,.95 calculado a partir de la ec. 3.6 parece más adecuado para identificar la posición del grupo N-óxido para los compuestos orto y para sustituídos (5a, 5b, 6a, 6b, 8a y 8b) mientras que el índice INO.95 calculado a partir de la ec. 3.4 parece más apropiado para los meta sustituídos (7a, 7b, 2a y 2b) como era de esperar. Por primera vez, a partir de los datos de desplazamientos químicos de RMN 3 C se pudo identificar inequívocamente la posición del grupo N-óxido de una serie de N- óxidos de pirazina 2-sustituídos. A partir de técnicas quimiométricas de análisis multivariado (PCA) se desentrañaron relaciones útiles que llevaron a la definición de un índice de N-oxidación. La principal ventaja de la metodología propuesta es su simplicidad, ya que el cálculo del índice consiste en contrastar los promedios de los desplazamientos químicos de RMN 3 C de cada par de átomos de carbono unidos al átomo de nitrógeno. El efecto del sustituyente pudo ser incluído mediante un factor cercano a la unidad que puede ser estimado a través de las constantes de Hammett de los sustituyentes. La metodología resultó satisfactoria en reconocer la posición del N-óxido a partir del signo del índice de N-oxidación INO (positivo para -N-óxidos y negativo para 4-N- 48

166 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 óxidos) en todos los casos estudiados que incluyen N-óxidos de pirazinas mono- y disustituídas. En principio, la metodología podría extenderse a N-óxidos de pirazinas más sustituídas. Sin embargo, para corroborarlo se necesitarían los datos de desplazamientos químicos de RMN 3 C de los carbonos aromáticos asignados, que no se encuentran disponibles en la literatura actual. Figura Estructuras de los -N-óxidos a y 4-N-óxidos b de las pirazinas disustituídas 4-2. Tabla 3.9. Índices de N-oxidación para una serie de N-óxidos de pirazinas disustituídas a. Compuesto Desplazamiento químico RMN 3 C Índice de N-oxidación Sustituyentes (ppm) (ppm) b R2 R3 R5 R6 C-2 C-3 C-5 C-6 INO.95 INO.95,.95 c 4b Ph H H Ph a CH 3 CH 3 H H b CH 3 CH 3 H H a CH 3 H CH 3 H b CH 3 H CH 3 H a CH 3 H H CH b CH 3 H H CH a CH 3 Ph H H b CH 3 Ph H H a CH 3 H Ph H a CH 3 H H Ph b CH 3 H H Ph a Los valores de los desplazamientos químicos de RMN 3 C fueron tomados de la Ref. 47. b Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando el valor de x=.95 y los datos de RMN 3 C de literatura. c Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.6) usando los valores de x, y =.95 y los datos de RMN 3 C de literatura. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita. 49

167 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina 3.6. Conclusiones El análisis de las fragmentaciones por ESI-CID de - y 4- N-óxidos isómeros de pirazina 2-sustituídos mostró caminos de fragmentación dependientes de la naturaleza del sustituyente. En la mitad de los casos se observó preferentemente la pérdida del radical hidroxilo, como ya se había observado para los N-óxidos de hidroxipiridina y 2. En cambio, los compuestos que presentaban un grupo carbonilo exhibieron caminos de fragmentación alternativos, que prevalecieron en los espectros de masa tándem a diferentes energías de colisión. La mayoría de los isómeros no pudieron ser distinguidos sobre la base de la comparación de la relación de intensidades del ion precursor y del ion fragmento principal, sino que las diferencias se encontraron en iones fragmento de menor intensidad. El análisis de la complejación con iones metálicos (calcio, cobre y aluminio) permitió encontrar diferencias entre cada par de isómeros a partir de los iones aducto generados por electrospray. No se encontró un comportamiento general atribuible a la posición del grupo N-óxido sino más bien a particularidades de cada sustituyente. La aplicación de la técnica de análisis multivariado (PCA), mediante representaciones gráficas, permitió interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa de cada compuesto con metales, agrupando los compuestos sobre la base de las distintas especies observadas. De esta manera, se encontraron relaciones entre la presencia de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada compuesto y la presencia de ciertos grupos funcionales y la posición del grupo N- óxido. Mediante técnicas de espectroscopia RMN 2D fue posible asignar unívocamente la posición del N-óxido así como la totalidad de protones y carbonos del conjunto de N- óxidos isómeros de pirazina 2-sustituídos. Si bien las correlaciones protón-carbono observadas mediante las técnicas de RMN 2D resultaron útiles para los compuestos estudiados, su aplicabilidad se restringe a N-óxidos de pirazinas poco sustituídas. En cambio, el análisis por técnicas quimiométricas de los datos de espectroscopia RMN 3 C proporcionaron una relación útil y general para identificar la posición del N- óxido en pirazinas sustituídas. Esta relación pudo racionalizarse en términos del ya conocido efecto del grupo N-óxido de aumentar la densidad electrónica en los átomos de carbono vecinos. Así, fue posible proponer un índice cuyo signo refleja la posición del N-óxido y cuyo cálculo consiste simplemente en contrastar desplazamientos 5

168 Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3 químicos de RMN 3 C. El efecto variable del sustituyente fue ponderado a través de un factor relacionado con las constantes de Hammett. El análisis por espectroscopia RMN 3 C de los compuestos estudiados arrojó resultados más generales y simples, respecto al análisis por MS, para la diferenciación entre N-óxidos isómeros de pirazinas sustituídas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el análisis por esta técnica presenta una menor sensibilidad y los experimentos requieren mayor tiempo para su realización y mayor cantidad de muestra comparado a MS. Tampoco podrían aplicarse al análisis de mezclas que contengan estos compuestos sin separación previa de la muestra. Por lo tanto, pese a la mayor influencia de los sustituyentes en el análisis por MS de los N-óxidos de pirazinas, el mismo resultaría competitivo e irremplazable en caso de que se disponga de poca cantidad de muestra o se precise el análisis de un gran número de muestras donde la rapidez del análisis se torna un factor importante. Los resultados presentados en este capítulo dieron origen al momento a una publicación: Butler, M., Cabrera G. M. Determination of the position of the N-O function in substituted pyrazine N-oxides by chemometric analysis of carbon-3 nuclear magnetic resonance data. (23) Journal of Molecular Structure 43, pp

169 Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina 52

170 Diferenciación de dihidroxiarenos 4 Capítulo 4.. Introducción Los dihidroxiarenos son motivos estructurales comunes en agroquímicos, drogas farmacéuticas y sus metabolitos, siendo de interés además por sus efectos antioxidantes en sistemas biológicos 58,59. A modo de ejemplo, la estructura del catecol se presenta en varios esteroides y en hormonas como la adrenalina, L-dopa y dopamina. Además, sus derivados se encuentran ampliamente distribuidos entre productos naturales como las cumarinas y flavonoides (Figura 4.). También, pueden originarse durante la descomposición de sustancias húmicas, taninos y ligninas 6, así como por degradación de herbicidas e insecticidas 6. Algunos dihidroxiarenos, como el catecol y resorcinol, son también considerados contaminantes ambientales 62. Figura 4.. Estructuras de algunos productos naturales conteniendo por lo menos dos grupos fenólicos. En este sentido, la necesidad de identificar diferentes isómeros posicionales radica en la diferencia de los distintos isómeros tanto en su potencial de riesgo como en su actividad biológica. El desarrollo de métodos para el análisis simultáneo y diferenciación de isómeros de dihidroxiarenos más allá de su relevancia, en general resulta problemático, especialmente por MS. Este inconveniente ha sido abordado de 53

171 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos diferentes maneras, algunas más exitosas que otras, dependiendo de la naturaleza estructural de los isómeros. Las reacciones de disociación en fase gaseosa (CID) a veces muestran diferencias en los caminos de fragmentación. Por ejemplo, los espectros de ESI-MS/MS de los iones [M-H] - del catecol y resorcinol mostraron que estos compuestos podían distinguirse a partir de los iones producto encontrados, como el ion [M-2H] -, presente en catecol 63, resultando además diagnóstico de la presencia de un núcleo de dihidroxibenceno en polifenoles más complejos. Cabe mencionar que en el trabajo anteriormente citado se comenta que los espectros en modo positivo de polifenoles fueron menos informativos que aquellos obtenidos en modo negativo. Otra estrategia empleada para la diferenciación de regioisómeros relacionados con productos de degradación de la lignina 36, fue el empleo de reacciones ión-molécula en fase gaseosa. Para esto fue requerida la introducción, en una de las celdas de un FT- ICR de celda dual, de un reactivo (trimetilborato), que mostró distinta reactividad frente a los compuestos isómeros estudiados permitiendo su diferenciación. Asimismo, diferencias en las reacciones de intecambio hidrógeno/deuterio (H/D) fueron usadas para diferenciar estereoisómeros de flavonoides, tal como fue probado con catequinas 37. Por otro lado, el acoplamiento de la espectrometría de movilidad iónica (IMS-MS) ha permitido la diferenciación entre isómeros de posición en compuestos aromáticos hidroxilados 64, productos de biotransformaciones metabólicas. La formación de iones aducto con metales fue utilizada para diferenciar compuestos isoméricos en bencenos disustituídos en la década del noventa, empleando iones monocargados de metales de transición como el Fe(I) 65, Cr(I) 66 y V(I)/VO(I) 67. Con la llegada de la ionización por electrospray, la complejación con iones metálicos en solución, seguido del transporte eficiente de los complejos cargados a la fase gaseosa, representó un método prometedor para la ionización de una gran variedad de analitos, incluyendo aquellos que no eran directamente ionizados por ESI 8. Así, utilizando iones divalentes de metales de transición para la formación de complejos, en combinación con CID sobre los iones aducto formados, fue posible la diferenciación de diastereoisómeros de dioles bicíclicos con Co(II) 38 y de -aminoácidos cíclicos con Ni(II) y Cu(II) 68. Por otra parte, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (LC- MS) se ha convertido en una importante herramienta analítica desde que se 54

172 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 encuentran disponibles las técnicas de ionización a presión atmosférica (API) 69, ya que permite el análisis de analitos en matrices complejas sin separación previa. Esta técnica permite además el agregado postcolumna de agentes de derivatización para mejorar la sensibilidad de la detección. Si bien hay pocos ejemplos aún de la introducción de iones metálicos como agentes de complejación postcolumna, su aplicación no sólo permitió ampliar el número de analitos detectables 7, sino también diferenciar isómeros. Por ejemplo, la utilización de Ag(I) posibilitó la diferenciación del sitio de glicosilación en diglicósidos isoméricos de flavonoides 39 por espectrometría de masa tándem, mientras que el Mn(II) fue usado para caracterizar los hidratos de carbono en monoglicósidos de flavonoides, así como el sitio de glicosilación por espectrometría de masa tándem 7. Figura 4.2. Estructuras de los dihidroxiarenos estudiados. El éxito obtenido en la diferenciación de los isómeros comerciales de N-óxidos de hidroxipiridina y 2 con metales condujo a la evaluación de los alcances de esta metodología de análisis para la diferenciación de regioisómeros en otra familia de compuestos, pero sin la funcionalidad N-óxido en su estructura. En particular, se trabajó con los compuestos comerciales (Figura 4.2) consistentes en pares de isómeros orto y meta de dihidroxibenceno (catecol 2 y resorcinol 22), dihidroxinaftaleno (2,3-naftalendiol 23 y,3-naftalendiol 24) y dihidroxicumarina (7,8- dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7-dihidroxi-4-metilcumarina 26). En la sección 4.2, se 55

173 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos mostrarán los resultados sobre la diferenciación de los isómeros de dihidroxiarenos a partir de los iones aducto con metales generados por ESI, mostrando luego en mayor detalle el empleo del calcio. En la sección 4.5, se culmina con la evaluación del uso de metales como agentes complejantes postcolumna en LC/ESI-MS como método de detección para la distinción de estos isómeros. Para lograr una comprensión más cabal de la complejación diferencial y de las especies observadas en los espectros de masa con metales se realizaron cálculos computacionales proponiendo estructuras para las diferentes especies. La caracterización de los principales iones obtenidos y el análisis de la estabilidad relativa de los complejos formados en fase gaseosa y sus posibles productos de disociación primarios, constituye una herramienta valiosa para entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los dihidroxiarenos. Sin embargo, para la correcta asignación entre las estructuras calculadas y aquellas observadas en los espectros de masa a veces es necesario tener información estructural directa. En este escenario, el empleo de la espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) (Apéndice A.5, pág. 262) se ha convertido en una de las pocas técnicas que permiten una conexión directa entre los experimentos de MS y los cálculos computacionales. En la última década, la espectroscopía IRMPD ha provisto de contribuciones valiosas, complementando la elucidación estructural y electrónica de complejos organometálicos o iones aducto de metales con moléculas orgánicas 72,73,74. Los resultados del estudio estructural empleando espectroscopía IRMPD para entender las propiedades complejantes del catecol como representante de los dihidroxiarenos estudiados y el calcio entre los metales, se expondrá en la sección 4.3. Sobre la base de las estructuras obtenidas y mediante la realización de cálculos computacionales se estudiaron los mecanismos de disociación de los iones aducto dicargados con calcio del catecol 2 y resorcinol 22, de manera similar a lo realizado en la sección (pág. 4). Estos resultados se comentarán en la sección Complejación con metales por ESI-MS Estudio preliminar La mayoría de los trabajos publicados sobre complejación con metales por ESI-MS de compuestos con funcionalidades fenólicas se refieren casi exclusivamente a 56

174 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 productos naturales de la familia de los polifenoles. Por ejemplo, los complejos de seis flavonoides con cobre(ii) y hierro(iii) fueron estudiados por ESI-MS 75 observando quelatos con distintas estequiometrías así como la ocurrencia de reacciones rédox. Estas reacciones ocurrieron tanto en los metales por reducción en sus estados de oxidación, como en los flavonoides por pérdida de 2 átomos de hidrógeno, especialmente en aquellos con un grupo catecol. En cambio, al estudiar soluciones de resveratrol (Figura 4.) con Cu(II) se observaron únicamente iones aducto con Cu(I) por ESI-MS 76. Además, se han realizado estudios 77 por ESI-MS con otro flavonoide, morina (Figura 4.), que con Al(III) y Ga(III), produjo complejos en fase gaseosa de variada estequiometría. En cuanto a la diferenciación de isómeros, la complejación con Co(II) junto a un ligando auxiliar 78 fue utilizada para diferenciar isómeros de glicósidos de flavonoides por ESI-MS/MS. En este caso, los iones aducto formados resultaron mucho más intensos que los iones observados en modos de ionizacion positivo o negativo sin metales. Se inició el estudio de los complejos metálicos en fase gaseosa con isómeros de dihidroxiarenos, subestructuras presentes en los polifenoles, para analizar las diferencias observadas. Los compuestos ensayados fueron catecol 2, resorcinol 22, 2,3-naftalendiol 23,,3-naftalendiol 24, 7,8-dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7- dihidroxi-4-metilcumarina 26 (Figura 4.2). Cabe destacar que en los espectros de masa obtenidos empleando ESI en modo positivo, realizados por infusión directa de los compuestos 2 y 22, no fue observado el ion correspondiente a la molécula protonada ni otros iones característicos de los compuestos. Los espectros de masa fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el momento de soluciones metanólicas de cada compuesto con soluciones acuosas de algunos de los cationes metálicos: aluminio(iii), calcio(ii), hierro(iii), cobalto(ii), cobre(ii) y galio(iii). Las condiciones experimentales empleadas fueron idénticas a las empleadas anteriormente para el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina y 2, descritas en el capítulo 5 (sección 5..2, pág. 28). En las Tablas , se resumen las especies caracterizadas para cada isómero, exhibidas en los espectros de masa, obtenidos con los diferentes iones metálicos. Como se puede observar en las Tablas , en general, los isómeros con sustitución orto (2, 23 y 25) exhibieron mayor preponderancia de iones aducto con los metales conteniendo ligandos desprotonados, mientras que los isómeros con sustitución meta (22, 24 y 26) se mostraron mayormente en su forma neutra en los 57

175 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos iones aducto con metales. Esta tendencia fue seguida por la mayoría de los compuestos estudiados con aluminio (Tabla 4.) y galio (Tabla 4.6), mientras que con cobalto (Tabla 4.4) y cobre (Tabla 4.5) se identificaron un mayor número de especies en común entre ambos isómeros. Las especies observadas para los compuestos estudiados con los metales mencionados anteriormente resultaron análogas a las observadas y previamente descritas para los N-óxidos en los capítulos precedentes. Sin embargo, con el calcio (Tabla 4.2) y el hierro (Tabla 4.3), se observaron peculiaridades que se mencionan a continuación. En el caso del hierro, se observó la formación de dímeros por acoplamiento oxidativo para los compuestos 2, 22, 23 y 24, así como complejos con el metal conteniendo estos dímeros. Un comportamiento similar fue informado para el resveratrol 79, donde en experimentos de ESI-MS a partir de mezclas con hierro se identificaron dehidrodímeros, cuya formación, mediante cálculos computacionales, fue sugerida a partir de reacciones de acoplamiento mediadas por radicales fenóxido. Estas reacciones de acoplamiento oxidativo de fenoles con FeCl 3 pueden ocurrir en solución e incluso en el estado sólido 8 como fuera informado para el compuesto 23. Las especies observadas con calcio resultaron idénticas a las descritas en los capítulos anteriores aunque no se detectaron especies conteniendo el contraión cloruro. Sin embargo, lo que resultó más interesante fue que los compuestos 2, 22, 23 y 24 siguieran una tendencia opuesta a la mostrada con los otros metales. Es decir, para el catecol 2 y el 2,3-naftalendiol 23, capaces de formar quelatos estables, se observaron predominantemente iones aducto dicargados con calcio, mientras que el resorcinol 22 y el,3-naftalendiol 24, exhibieron principalmente iones aducto monocargados con calcio por la presencia de un ligando desprotonado. Este comportamiento resultó llamativo a la luz de los resultados obtenidos hasta el momento con los isómeros de N-óxidos de hidroxipiridinas y pirazinas, donde contrariamente, sólo las estructuras capaces de formar quelatos estables exhibieron iones aducto monocargados con un ligando desprotonado. Como consecuencia, se decidió investigar en mayor profundidad la complejación diferencial con calcio de los isómeros de dihidroxibenceno (2 y 22) y dihidroxinaftaleno (23 y 24). 58

176 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Tabla 4.. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con aluminio; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M [M] (5.5) [M+H] (7.6) (4.8) [M+Al+2H 2O-2H] (4.4) (9.5) [M+Al+H 2O+CH 3OH-2H] (6.) (8.5) [M+Al+Cl+H 2O-H] (2.) (.4) [M+Al+Cl+CH 3OH-H] (.2) (7.) (6.9) [M+Al+Cl+2H 2O-H] (5.7) (.) [M+Al+Cl+H 2O+CH 3OH-H] (3.2) [M+Al+2Cl+H 2O] (8.2) (7.7) 6.64 (4.2) (4.9) [2M+Al-2H] (6.2) (6.2) [2M+Al+H 2O-2H] (3.6) (4.2) [2M+Al+Cl+H 2O-H] (.) [2M+Al+2Cl] (.) (.2) (2.4) (.2) [3M+Al-2H] (2.8) [3M+Al+Cl-H] (2.4) [4M+2Al-5H] (5.8) [4M+2Al+H 2O-5H] (.6) a Los valores en negrita indican el ion más abundante (2.2) (5.6) (.) 48.3 (3.9) 59

177 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Tabla 4.2. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con calcio; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M [M] (.) [M+H] (.9) (5.4) (7.7) (2.7) [M+Ca] (5.) [M+Ca+H 2O] (3.8) [M+Ca+2H 2O] (.4) [M+Ca+3H 2O] (.2) [M+Ca+4H 2O] (.4) [M+Ca-H] (6.5) (.9) (7.8) [M+Ca+H 2O-H] (8.7) (6.) (.6) (6.2) (3.) [M+Ca+2H 2O-H] (4.5) (3.4) (3.5) (6.) (.7) [2M+Ca] (.6) (.5) (.3) [2M+Ca+H 2O] (5.8) (.7) (6.) [2M+Ca+2H 2O] (.) (2.9) (2.7) (.5) [2M+Ca+3H 2O] (.8) [2M+Ca-H] (8.7) (.8) (.) [2M+Ca+H 2O-H] (5.7) (2.8) (6.3) (.5) [2M+Ca+2H 2O-H] (.2) (2.6) [3M+Ca] (.4) (2.7) [3M+Ca+H 2O] (4.4) (.3) [3M+Ca-H] (.8) [3M+Ca+H 2O-H] (.8) [4M+Ca] (.3) a Los valores en negrita indican el ion más abundante (2.7) 6.4 (.6) 25.8 (6.4) 34.3 (3.8) (4.9) (4.4) (2.6) (4.) (6.5) (2.3) (3.) (6.5) (7.5) 6

178 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Tabla 4.3. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con hierro; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M [M] (2.8) (2.2) (3.9) (7.9) [M+H] (2.5) (.) (8.8) (.3) (6.) [M+Fe+Cl-2H] (3.4) [M+Fe+Cl+H 2O-2H] (.9) [M+Fe+Cl+H 2O-H] (.2) [M+Fe+2Cl+H2O] (4.7) [2M+H-4H] (6.) (6.8) (.3) [2M-2H] (8.8) (.) [2M+H-2H] (4.3) (2.7) [M+Fe+2Cl+H 2O] (.3) [M+Fe+H 2O-2H] (6.2) [2M+Fe+Cl-4H] (4.) [2M+Fe+Cl-3H] (6.4) [2M+Fe+Cl-2H] (.4) (2.9) [2M+Fe+Cl-H] (8.3) [2M+Fe+2Cl] (4.9) a Los valores en negrita indican el ion más abundante (4.) 6

179 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Tabla 4.4. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con cobalto; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M 2 b 22 c d [M] (4.3) (7.) (2.) (2.) (.4) (5.5) [M+H] (2.2) (5.8) (.) (.5) (4.8) (.) [M+Co+H 2O-H] (.6) (3.8) (5.) [M+Co+Cl] (5.) (7.8) (3.3) (9.3) [M+Co+H 2O+Cl] (3.6) (2.7) (.9) (3.) [2M+Co] (.8) [2M+Co+H 2O] (2.3) [2M+Co+2H 2O] (.9) [2M+Co-H] (4.) (.) (.) (6.) (.) [2M+Co+H 2O-H] (.3) [2M+Co+Cl] (4.9) (.6) [2M+Co+H 2O+Cl] (.8) (.8) [3M+Co+H 2O] [3M+Co-H] (.) [3M+Co+Cl] (2.2) a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observa también el ion (6.9) de fórmula C 6 H 7 O 2 Co. c Se observa también el ion (4.5) de fórmula C 6 H 7 O 2 Co. d Se observa también el ion (7.8) de fórmula C H 8 O 3 Co.. (2.) 62

180 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Tabla 4.5. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con cobre; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M 2 b [M] (3.4) [M+H] [M+Cu-H] (4.3) (.3) [M+Cu] [M+Cu+H 2O-H] (6.8) (4.6) (4.3) (3.) (.6) (2.4) (6.5) (7.8) (6.7) (6.4) (9.5) (4.2) (.) (.) (2.8) [M+Cu+H 2O] (2.6) (6.) (2.3) (6.9) [2M+Cu-H] (4.5) (.2) (6.3) [2M+Cu] (6.2) (.) (4.8) (3.8) (4.7) [M+2Cu+SO 4+H 2O-H] (.2) [M+3Cu+2SO 4-H] (3.3) a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan también los iones (7.) y (5.8) de fórmulas C 6 H 4 O 2 Cu y C 6 H 6 O 3 Cu, respectivamente. Tabla 4.6. Iones más significativos a observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 2-26 (L) con galio; m/z obs. (error en ppm). Ion/Compuesto M [M+H] +.44 (.7) [M+Ga-2H] (3.5) [M+Ga+Cl-H] (.4) [M+Ga+Cl+H 2O-H] (.3) [M+Ga+2Cl+H 2O] (3.6) (.3) (4.8) (.9) (8.8) (8.8) [2M+Ga-2H] (3.3) (6.7) (5.4) (4.2) [2M+Ga+H 2O-2H] (2.4) (6.3) (5.4) [2M+Ga+Cl-H] (.) [2M+Ga+2Cl] (3.7) * (.) a Los valores en negrita indican el ion más abundante. * Se observa solapamiento de picos (8.9) (.6) (3.3) 63

181 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Estudio de la complejación con calcio de 2-24 La investigación de la complejación diferencial con calcio de los isómeros de dihidroxiarenos se emprendió por dos caminos. Por un lado, se estudió el efecto de modificaciones en las condiciones de la solución previo a su introducción en el equipo y, por otro lado, se analizó el efecto de cambios en la fuente de ionización y en el transporte de los iones en fase gaseosa. De esta manera, se analizó la influencia de factores relativos a la fase líquida y a los analitos en solución, y relativos a los iones en fase gaseosa. En primer lugar, se investigó el efecto del agregado de cantidades crecientes de hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) a las soluciones de los compuestos 2-24 con calcio, manteniendo el resto de las condiciones experimentales invariables. Los detalles experimentales se encuentran en el capítulo 5 (sección 5..2, pág. 28). Este agregado tuvo como objetivo la titulación parcial de los grupos fenólicos de los compuestos al ir incrementando el número de equivalentes de la base, para ver luego el efecto sobre las especies observadas en los espectros de masa. Los cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de los compuestos 2, 23 y 24 con calcio frente al agregado de cantidades crecientes de TMAOH se pueden observar en la Figura 4.3. En el caso del resorcinol 22, a diferencia de los otros compuestos estudiados, se observaron solamente pequeñas variaciones en las intensidades relativas de las especies por lo que no se graficaron. Como se nota en la Figura 4.3, luego del agregado de aprox. equivalente de TMAOH las especies predominantes en los espectros ESI-MS son invariablemente las correspondientes a los iones aducto monocargados con calcio conteniendo un ligando desprotonado. Como se puede observar en la Tabla 4.2, estas especies coinciden con las observadas para el resorcinol 22 en ausencia de TMAOH lo que explicaría la ausencia de cambios frente al agregado de TMAOH. El aumento en la abundancia relativa de las especies con el ligando desprotonado ocurrió en detrimento de los iones aducto dicargados en el caso de los compuestos 2 y 23, y de la molécula protonada, para el compuesto

182 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo Abundancia Relativa (%) ,,2,4,6,8,,2,4,6,8 2, equiv. TMAOH [M+Ca-H] + [M+Ca+H 2 O-H] + [M+Ca+2H 2 O-H] + [2M+Ca+H 2 O] ++ [2M+Ca+2H 2 O] ++ [2M+Ca+H 2 O-H] + Abundancia Relativa (%) ,,2,4,6,8,,2,4,6,8 2, equiv. TMAOH 23 [M+H] + [M+Ca-H] + [M+Ca+H 2 O-H] + [M+Ca+2H 2 O-H] + [2M+Ca+H 2 O] ++ [2M+Ca+2H 2 O] ++ [2M+Ca+H 2 O-H] + [3M+Ca] ++ Abundancia Relativa (%) ,,2,4,6,8,,2,4,6,8 2, equiv. TMAOH 24 [M+H] + [M+Ca-H] + [M+Ca+H 2 O-H] + [M+Ca+2H 2 O-H] + Figura 4.3. Cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de soluciones de los compuestos (M) 2, 23 y 24 con calcio en el curso de la adición de TMAOH. 65

183 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos El incremento en las abundancias relativas de las especies desprotonadas (Figura 4.3) resultó consistente con el aumento en la concentración de base (TMAOH). Sin embargo, estos resultados no permiten explicar la diferencia entre isómeros antes observada (Tabla 4.2). Las variables que afectan la eficiencia con la cual los iones son transferidos a la fase gaseosa son parámetros instrumentales, mantenidos constantes durante los experimentos, y la fuerza iónica de la solución 8. Además, para complejos de metales con ligandos, se agrega el ph, debido a que los complejos, en general, pueden cambiar su estado de protonación y su carga en solución frente a cambios de ph. Cabe mencionar que el agregado de TMAOH no sólo modifica el ph de la solución, sino también la fuerza iónica de la misma, por lo que no es posible discernir cuál es el efecto de cada una de estas variables en el comportamiento observado. Por ultimo, se realizaron experimentos con soluciones de catecol 2 y resorcinol 22 con calcio optimizando los parámetros instrumentales de modo de minimizar la energía suministrada a los iones en fase gaseosa durante su transporte hacia el detector. El propósito buscado fue limitar la cantidad del gas de colisión presente, así como la energía impartida por el cuadrupolo, para minimizar las colisiones de los iones, y así disminuir su energía interna reduciendo la disociación de los mismos. La hipótesis era que ciertas especies observadas en los espectros podían ser iones fragmento formados a partir de otros iones. Las condiciones empleadas se detallan en el Capítulo 5 (sección 5.., pág. 25). Los espectros de masa ESI obtenidos en estas condiciones se muestran en la Figura 4.4. En el Capítulo 5 (Tablas 5.2 y 5.5, págs. 29 y 2) se encuentran más detalles acerca de la identidad de los iones con sus relaciones m/z y error medidos. Como se puede notar en los espectros de la Figura 4.4 a) y b), para ambos compuestos se observan iones aducto dicargados y monocargados, aunque los primeros son más abundantes para el compuesto 2, mientras que para el compuesto 22 se encuentran en relaciones semejantes, predominando la molécula protonada. Resulta interesante comparar las especies observadas en este caso con las registradas en condiciones estándar (Figura 4.4 c) y d)). A partir de dicha comparación puede verse que las condiciones aquí empleadas resultan en la observación de un mayor número de especies dicargadas para ambos compuestos, las cuales no habían sido detectadas para el compuesto 22. Estos indicios sugieren que los iones aducto dicargados de calcio con 22 se fragmentaban en las condiciones estándar, dando origen a las especies observadas. 66

184 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 [%] [2M+Ca+2H 2O] a) [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-3) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) Intensidad relativa Intensidad relativa Intensidad relativa [%] [M+Ca+3H 2O] [2M+Ca+2H 2O] [3M+Ca] [M+Ca+H 2O-H] [M+Ca+2H 2O-H] [2M+Ca-H] m/z [%] [M+Ca+H 2O] [M+H] [2M+Ca+4H 2O] ++ [2M+Ca] [M+Ca+2H 2O-H] [M+H] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-3) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) m/z b) c) [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-3) (y=-4) [xm+ca+y(h 2O)-H] + (x=-2) (y=-2) [2M+Ca+H 2O-H] m/z [%] [Ca 2Cl 3] [M+H] + [M+Ca+y(H 2O)-H] + (y=-2) d) Intensidad relativa [M+H] [M+Ca+H 2O-H] m/z Figura 4.4. Espectros de masa ESI-MS obtenidos a partir de soluciones con calcio de los compuestos isómeros (M) 2 (a) y 22 (b) optimizando los parámetros instrumentales comparados con los respectivos obtenidos en condiciones estándar (c) y (d). 67

185 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Teniendo presente lo anterior, se procedió a investigar la disociación de una de estas especies dicargadas, presente en los espectros de masa ESI-MS de ambos compuestos, [2M+Ca+H 2 O] ++ (m/z 39), con el propósito de adquirir una perspectiva sobre las vías de disociación de estos iones. Para ello, se seleccionó la masa de dicho ion aducto y se registraron sus espectros de masa tándem barriendo la energía de colisión del sistema de referencia laboratorio (Elab) desde 5 a ev usando argón como gas de colisión. Los espectros de masa CID obtenidos a 8 ev se muestran en la Figura 4.5. En el Capítulo 5 (Tablas 5.3 y 5.4, págs. 29 y 2) se presentan los detalles acerca de la identidad de los iones con sus relaciones m/z y error medidos. Como puede verse en la Figura 4.5, para el compuesto 2 se observaron especies con moléculas adicionales de agua incorporadas, además de los iones aducto dicargados que corresponden a pérdidas de moléculas neutras a partir del ion precursor seleccionado. De manera similar para el compuesto 22, se observaron iones fragmento monocargados que podrían provenir de un proceso de separación de carga, la molécula protonada [M+H] + y el ion aducto con calcio conteniendo agua y un ligando desprotonado [M+Ca+H 2 O-H] +. La incorporación de moléculas de agua por parte de los iones producto (o el ion precursor), podría explicar los iones aducto monocargados restantes observados en los espectros de masa tándem. Vale la pena mencionar que la presencia de estos iones aducto conteniendo moléculas de agua adicionales en los espectros MS/MS podría deberse a la interacción de los complejos con cantidades traza de agua presentes en la celda de colisión provenientes de la fuente de ionización 34 o más probablemente de la celda de colisión a través de la línea de argón 36. Más allá de estos artefactos, los espectros de masa tándem revelaron dos tipos de procesos de disociación, conducentes a nuevos iones aducto dicargados formados por pérdidas neutras, o a especies monocargadas generadas a través de procesos de separación de carga. Mientras ambos procesos fueron observados para el compuesto 2, sólo el proceso de separación de carga se evidenció para el compuesto 22. Es interesante notar que para complejos de calcio dicargados generados por ESI con otros ligandos como el metanol y la piridina 82, ya se habían observado caminos de disociación similares por CID, es decir, la disociación por pérdida de ligandos neutros y la separación de carga por transferencia de protones entre los ligandos. 68

186 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Intensidad relativa [%] [M+H] + [xm+ca+y(h 2O)] 2+ (x=-2) (y=-4) [M+Ca+y(H 2O)-H] + (y=-3) [M+Ca+H 2O] ++ [2M+Ca] ++ [M+Ca+2H 2O-H] m/z a) [%] 2 [M+H] + [M+Ca+2H 2O] b) Intensidad relativa m/z [%] [M+H] [M+H] + [M+Ca+y(H 2O)-H] + (y=-3) c) Intensidad relativa [M+Ca+3H 2O-H] m/z Figura 4.5. Espectros de masa CID del ion aducto con calcio [2M+Ca+H 2 O] ++ (m/z 39) registrados con una energía de colisión de 8 ev para los compuestos isómeros (M) 2 (a) y 22 (c), mostrando una ampliación (b) del espectro de masa ESI-MS/MS del compuesto 2. La alta resolución en la medición de la relación m/z permitió la distinción e identificación sin ambigüedades de iones de intensidad similar en la vecindad de m/z. y de m/z 85.. El primer caso se muestra en la ampliación de la Figura 4.5 b), donde la molécula protonada es exhibida junto a un ion aducto dicargado. El segundo 69

187 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos caso se vuelve evidente al observar el ion aducto dicargado [3M+Ca] ++ monocargado [M+Ca+2H 2 O-H] + en las Figuras 4.4 a) y 4.5 a), respectivamente. y el En definitiva, a partir de la optimización de los parámetros instrumentales de transporte de los iones, se pudieron observar por primera vez iones aducto con calcio dicargados para el resorcinol. La selección de esos iones para realizar experimentos CID originó especies monocargadas, por un proceso de separación de carga, que resultaron consistentes con los iones observados en los espectros de masa registrados en las condiciones experimentales estándar (menos suaves). Por otra parte, si bien el catecol mostró iones producto producidos por separación de carga en menor abundancia, bajo las mismas condiciones también se observaron pérdidas de ligandos neutros entre los caminos de disociación. Por lo tanto, esto sugiere que las diferencias observadas entre isómeros frente a la complejación con calcio podrían deberse a diferentes barreras energéticas en los caminos de disociación de los iones aducto dicargados formados con calcio. Luego, para lograr un entendimiento de las energías involucradas en los procesos mencionados y las diferencias observadas entre ambos compuestos isómeros, se estudiaron los caminos de disociación en mayor profundidad por cálculos computacionales (sección 4.4), emprendiendo antes, en la sección 4.3, el estudio estructural de los clusters dicargados de catecol con calcio Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa El catecol 2 y sus derivados se presentan como metabolitos intermediarios durante la degradación de compuestos aromáticos sintéticos y naturales 83, siendo ubicuos en la química biológica actuando como dadores de electrones o agentes complejantes 84, o como quelantes fuertes de metales de transición 85. Por este motivo, en la literatura se pueden encontrar estudios de las interacciones de metales con catecol, en solución para el aluminio(iii) 86,87, en el estado sólido para Ag(I) 88, en solución y en fase sólida para Ni(II) 89, por cálculos de química cuántica y estudios en solución para Pb(II) 9 y por espectrometría de masa y estudios en solución para Fe(III) 9, por mencionar algunos de los ejemplos descritos en la literatura. Sin embargo, el sistema catecol-calcio no ha sido estudiado aún en fase gaseosa aunque hay estudios recientes en solución que se han concentrado en el efecto del 7

188 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 calcio(ii) sobre las propiedades ácido base y rédox del catecol 92,93. Por otro lado, se ha observado a partir de la comparación de cálculos computacionales con datos experimentales obtenidos en un espectrómetro de masa a alta presión 94, que la protonación en fenoles, como el catecol y resorcinol, generalmente ocurre en posición para al grupo hidroxilo. También se estudiaron complejos obtenidos por ESI de dipéptidos de fenilalanina con Ca(II) 95 y se han propuesto motivos de unión que involucran interacciones -catión metálico. La motivación del presente estudio reside en entender las propiedades complejantes del catecol hacia este metal, en particular, su modo de coordinación (mono o bidentado), la presencia de tautómeros y el número de coordinación del metal. La aplicación de la metodología de cálculo computacional previamente empleada en la sección 2.5 (pág. 56) para los complejos de calcio de N-óxidos de hidroxipiridina, arrojó numerosas estructuras posibles en el caso de los complejos de catecol con calcio. Para el análisis de estos sistemas, el empleo de la espectroscopía IRMPD (Apéndice A.5, pág. 262) resulta imprescindible ya que puede brindar información estructural directa, permitiendo la asignación correcta y correlación de estructuras calculadas en fase gaseosa con las observadas en los espectros de masa. En las regiones espectrales de 8-2 cm -, conocida también como zona de la huella digital, y 3-38 cm -, donde se encuentran los modos de estiramiento O-H, se presentan bandas de absorción IR asociadas con modos vibracionales del catecol. Por consiguiente, es esperable observar en los complejos de catecol con calcio, ligeros corrimientos en las señales que sean característicos del modo de coordinación al catión metálico. En consecuencia, resulta necesario estudiar la molécula neutra de catecol libre en primer lugar Estudio preliminar de catecol libre El espectro IR experimental del catecol en fase gaseosa (Figura 4.6) fue tomado de la base de datos de NIST 96. En la Tabla 4.7 se enumeran las frecuencias de las bandas medidas (señaladas A-J), así como sus asignaciones. Algunas fueron tomadas de asignaciones previas del catecol 97, mientras otras fueron adaptadas de la literatura más reciente consultada usando la notación de Wilson 98 (Anexo 2, pág. 266) para derivados de bencenos monsustituídos. Aunque la espectroscopía IRMPD 7

189 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos acoplada a MS no puede brindar datos experimentales correspondientes a especies neutras como el catecol libre, los estudios computacionales pueden proveer resultados útiles a fines comparativos. De manera similar a lo realizado en la sección 2.3., a partir del estudio conformacional del catecol fueron calculadas varias estructuras al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Este conjunto de funciones base, que presenta orbitales tanto polarizados como difusos, ha probado ser adecuada para investigar esta clase de sistemas 99. Los espectros IR calculados de los dos confórmeros de menor energía del catecol 2a y 2b se muestran en la Figura 4.6. Las estructuras calculadas mostraron los grupos hidroxilo coplanares con el anillo aromático pero con diferencias en su orientación espacial, estando caracterizado el confórmero de menor energía 2a por una orientación de uno de los hidrógenos de un grupo hidroxilo hacia el otro aunque sin presentar una interacción por puente de hidrógeno de acuerdo a los estudios realizados que aparecen en la literatura 2,2. Absorbancia / u.a.,4,3,2, NIST I J H G F E D C Absorbancia / u.a.,4,3,2, NIST B A,, Intensidad / km.mol a Intensidad / km.mol a. kcal mol - Intensidad / km.mol b Intensidad / km.mol b 4. kcal mol número de onda / cm número de onda / cm - Figura 4.6. Comparación del espectro IR en fase gaseosa del catecol 96 con los espectros IR lineales calculados para sus dos confórmeros más estables, obtenidos al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p), junto a las estructuras y diferencias de energía entre las mismas. 72

190 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Cabe mencionar que las frecuencias vibracionales calculadas fueron escaladas por un factor de.98 y.95, en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H respectivamente, para su comparación con los espectros IR experimentales. Estos valores de escalado son similares a otros previamente determinados para mejorar la concordancia entre las frecuencias de absorción calculadas y observadas experimentalmente 22 y también entre los espectros de absorción IR calculados y los obtenidos experimentalmente por espectroscopia IRMPD 23,24. Tabla 4.7. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol 96 comparadas con los valores de los confórmeros calculados al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Modo vibracional a 2b b calc / cm - 2a b catecol c, calc / cm - exp / cm - ( exp- calc2a) / cm - σ OH 3644 (3) 3659 (82) 3658 A - σ OH 3645 (7) 362 (4) 362 B σ CC ( 9a) 623 (8) 68 (24) - 68 C σ CC ( 9b) 63 (37) 63 (28) -5 σ CC( 8b) 57 (3) 59 (27) 58 D - σ CC ( 8a) 463 (25) 473 (32) σ CC ( 5) 345 (5) 363 (26) 354 E -9 β COH 335() 33 (49) 36 F -4 σ CO (C -O ) 276(69) 27 (83) G σ CO(C 2-O 2) 249 (26) 238 (6) 2 β COH 66 (296) 79 (43) 9 H β CH( 8b) β OH β CH( 9a) β OH 43 (84) 58 I 5 82 (7) 84 (76) 94 J a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson ( ni ) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C 2v, asignadas consistentemente en la Ref 98 y adaptadas para catecol. b Frecuencias harmónicas escaladas por.98 en el rango de la huella digital y por.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol - están entre paréntesis. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6, asignadas sobre la base de las Ref. 97 y 98. Las bandas de estiramiento de O-H del catecol (bandas A y B) observadas en la Figura 4.6, resultaron señales diagnósticas de la presencia del confórmero 2a. Es importante notar que la separación entre las bandas (56 cm - ) fue reproducida 73

191 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos satisfactoriamente por la simulación computacional realizada. Otras dos bandas observadas para el catecol a 58 (I) y 36 cm - (F) resultaron características del confórmero 2a, con dos bandas predichas a 43 y 33 cm -, asignables a los modos de flexión de O-H, C-H y C-O-H (β OH β CH y β COH, respectivamente). Estos modos podrían ser rasgos útiles más adelante para diferenciar entre ambas conformaciones del catecol en los complejos con calcio. El confórmero 2b, que tiene una energía 4. kcal mol - por encima del confórmero 2a, mostró un espectro muy similar (Figura 4.6) pero con un hombro menos prominente a 33 cm - y bandas agudas a 66 y 276 cm -, que no coincidieron con el perfil del espectro experimental, aunque no se puede descartar una contribución minoritaria de este confórmero. Las frecuencias vibracionales de catecol determinadas al nivel B3LYP/6-3+G(d,p) para el confórmero más estable 2a (Tabla 4.7), concordaron con los valores experimentales, siendo la diferencia media entre las frecuencias escaladas y las experimentales próxima a 9 cm -. Cabe mencionar que los anchos de banda en el espectro experimental (tomado en un GC/MS/IRD 96 ) fueron típicamente de 2 cm - y algunas señales no se resolvieron bien. En la zona de la huella digital, todas las frecuencias calculadas concordaron dentro de los 2 cm - con los valores experimentales disponibles Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados Los complejos dicargados de calcio compuestos por dos ligandos de catecol más una o dos moléculas de agua fueron examinados por espectroscopía IRMPD en la celda de un espectrómetro de masa FT-ICR de 7 Tesla con 2 láseres pulsados infrarrojos. Estos iones aducto dicargados formados a partir de catecol y calcio(ii) fueron producidos en la fase gaseosa empleando ESI, que de igual modo a como se ve en la Figura 4.4 a (pág. 67), fueron los iones más abundantes en los espectros de masa registrados. Los espectros IRMPD de estos iones en fase gaseosa fueron medidos en la zona de cm - (región de estiramiento de O-H) realizando un barrido con un sistema láser infrarrojo oscilador / amplificador paramétrico óptico (OPO/OPA), y en el rango espectral de 9-7 cm - (huella digital) usando el haz intenso del láser de electrones libres (FEL) de Centre δaser Infrarouge d Orsay (CLIO) (Capítulo 5, pág. 26). 74

192 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Los iones, seleccionados por su relación m/z, fueron irradiados en la trampa del ICR, ya sea por el IR-FEL o el OPO/OPA, por.25 s o -2 s, respectivamente. Cuando el láser se sintoniza a una transición vibracional, son absorbidos múltiples fotones por los iones en un proceso progresivo hasta que alcanzan el umbral de disociación (Apéndice A.5, pág. 262). Registrando las intensidades del ion precursor seleccionado y de los iones fragmento, en función del número de onda del láser, se calculó la proporción subsistente (SY) (Apéndice A.3, pág. 26). El espectro IRMPD fue obtenido al graficar el rendimiento de IRMPD, calculado como el logaritmo natural de la inversa de SY, en función del número de onda del láser. Los únicos canales de fragmentación observados como consecuencia de la absorción IR de los iones correspondieron a la pérdida secuencial de moléculas de agua presentes en los iones aducto. Los espectros IRMPD medidos en fase gaseosa de los iones aducto dicargados [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H, se muestran en las Figuras 4.7 y 4.8 respectivamente. Al comparar los espectros de las Figuras 4.7 y 4.8 de ambos iones puede notarse un perfil casi idéntico con bandas ligeramente corridas al rojo al pasar de [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ a [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+. Sin embargo, resulta interesante notar la ausencia de la banda A en la Figura 4.8 b). Sobre la base de investigaciones recientes de espectrocopía IR en fase gaseosa de cationes metálicos solvatados con agua puede realizarse una primera interpretación de las características observadas. La coordinación de agua a un catión metálico induce un corrimiento al rojo de los estiramientos simétrico ( sim ) y antisimétrico ( asim ) del O-H con respecto a sus posiciones en la molécula de agua libre (3657 y 3756 cm -, respectivamente) 25,26. Este desplazamiento al rojo evidenciado para numerosos sistemas metálicos microhidratados 27,28 puede ser interpretado como el resultado de una transferencia electrónica parcial desde la molécula de agua al catión metálico 29. Al adicionarse más moléculas de agua al metal y alcanzarse el máximo número de coordinación, puede anticiparse la competencia entre la coordinación directa al catión metálico y la formación de enlaces de hidrógeno agua-agua. Para el catión metálico 2+ Ca(H 2 O) n, no hay evidencia de la formación de enlaces de hidrógeno para n 6, habiéndose observado la aparición de una banda ancha a frecuencias menores a 35 cm - en el espectro IR para n = 7 como resultado de la formación de estructuras con 75

193 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos enlaces de hidrógeno entre moléculas de agua de la primer y segunda esferas de coordinación 2. Desde n = a 6, fue observada una disminución progresiva del corrimiento al rojo de las bandas sim y asim para Ca(H 2 O) 2+ n, lo cual resulta consistente con una reducción en la transferencia de carga desde cada molécula de agua al ion metálico, al aumentar la solvatación del mismo. Rendimiento IRMPD / u.a a) J I H G F E D C Rendimiento IRMPD / u.a. 2 a) B A Rendimiento IRMPD / u.a b) J H G F E D C Rendimiento IRMPD / u.a. 2 b) B número de onda / cm númeo de onda / cm - Figura 4.7. Espectro IRMPD en fase gaseosa en la región de la huella digital de los iones a) [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ y b) [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+. Las líneas en rojo punteadas corresponden a bandas de absorción de catecol libre mostrado en la Figura 4.6. Figura 4.8. Espectros IRMPD en fase gaseosa en la región de estiramiento O-H de los iones a) [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ y b) [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+. Las líneas en rojo punteadas corresponden a los estiramientos de catecol libre y en azul a los modos simétrico y antisimétrico de agua libre. Vale la pena notar que los mismos argumentos discutidos más arriba se aplicarían de manera similar para los modos de estiramiento de los hidroxilos σ OH de los ligandos de catecol coordinados al catión metálico. De manera análoga, las bandas observadas en la región de la huella digital para los dos complejos que se muestran en la Figura 76

194 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 4.7, reducen su desplazamiento al rojo (respecto del catecol libre) con el aumento en el número de coordinación del metal. Al interactuar ligandos adicionales con el metal, la distribución se torna más simétrica, disminuyendo así el efecto individual de las interacciones sobre cada ligando. Teniendo en cuenta lo anterior, y anticipando corrimientos al rojo de los modos vibracionales en la región de estiramiento del O-H respecto de agua libre, es interesante notar que la banda A de la Figura 4.8 a), puede tentativamente ser asignada como el modo de vibración asim de las moléculas de agua coordinadas al ion metálico. Esta banda que no se observó para el ion [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ en la Figura 4.8 b), tampoco fue observada en los espectros IRMPD 2 2+ de Ca(H 2 O) 4 y Ca(H 2 O) 2+ 5, volviéndose visible recién para Ca(H 2 O) 2+ 6.Por otra parte, la banda B puede asignarse al modo de vibración sim de la molécula de agua coordinada al metal, así como a los modos de estiramiento σ OH de los hidroxilos de los ligandos de catecol. En la Figura 4.8 a, se observa además que la banda B es mucho más intensa que la A. Una relación semejante entre las intensidades relativas de las bandas asim y sim, en función del número de coordinación del metal fue observada también para otros metales de transición divalentes hidratados 27. Estos patrones de intensidad podrían interpretarse en términos de procesos de redistribución vibracional intramolecular (IVR), como fue propuesto en conexión con iones amonio hidratados 2. En un sistema catión metálico-agua, a partir de la excitación de sim, el átomo de oxígeno se mueve a lo largo del enlace metal OH 2 y la activación de este enlace permitiría así la fragmentación subsecuente. Por otro lado, como el átomo de oxígeno se mueve perpendicular a este enlace a partir de la excitación de asim, la fragmentación inducida por IR debería ocurrir a través del acoplamiento con otros modos vibracionales. Esta consideración mecanística sugiere que la eficiencia del acoplamiento a los otros modos vibracionales podría ser origen de desviaciones entre las intensidades de absorción esperadas en el IR y los rendimientos de IRMPD registrados. Para identificar y hacer una asignación tentativa de las diferentes bandas exhibidas en la Figura 4.7 a) y b), se utilizaron las designaciones C-J empleadas previamente para el catecol libre (Tabla 4.7). Las frecuencias de las bandas junto a sus asignaciones se listan en la Tabla 4.8. Las bandas que, en principio, podrían resultar más relevantes para la caracterización estructural son aquellas asignables a los modos de estiramiento (G) y flexión (E, F y H) del C-O (σ CO y β COH, respectivamente) 77

195 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos en contraposición con los modos de estiramiento C-C (σ CC ) y los modos de flexión de C-H (β CH ). Esto se debe a que se espera que la coordinación al catión metálico ocurra a través de los átomos de oxígeno, por lo que el mayor efecto se encontraría en los modos de vibración involucrando estos átomos. De hecho, se observa que el mayor desplazamiento al rojo respecto al catecol libre ocurrió para la banda G (asignada al modo de estiramiento C-O σ CO ). Para confirmar las asignaciones vibracionales de las transiciones observadas en los espectros IRMPD se realizaron cálculos computacionales. A pesar de su naturaleza multifotónica, el espectro IRMPD refleja predominantemente la absorción del primer fotón (Apéndice A.5, pág. 262). Esta observación justifica una comparación del espectro IRMPD experimental con los espectros de absorción IR de un fotón. Tabla 4.8. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol 96 comparadas con la de los iones aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+. Modo [Ca(catecol) 2(H 2O) 2] 2+ [Ca(catecol) 2(H 2O)] 2+ vibracional a b exp / cm - b exp / cm - catecol exp c / cm - σ CC ( 9a) 636 [7] C 646 [2] C 68 C σ CC ( 9b) σ CC( 8b) σ CC( 8a) σ CC ( 5) β COH 495 [2] D 489 [] D 58 D 354 E 36 [8] E, F 3 [5] E, F 36 F σ CO 234 [8] G 225 [6] G 258 G β COH 23 [2] H 98 [7] H 9 H β CH( 8b) β OH β CH( 9a) β OH 57 I 58 I 8 [5] J 7 [] J 94 J a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson ( ni ) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C 2v asignadas consistentemente en la Ref 98 y adaptadas para las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm - ) está entre corchetes. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6 asignadas sobre la base de las Ref. 97 y

196 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo Estructuras de los clusters de calcio(ii) con catecol microhidratados Se emplearon resultados previos de espectroscopía IR informados para el catecol libre 97 y derivados de catecol como la dopamina 22, así como clusters de calcio(ii) con agua 2 como guías para comenzar los cálculos. Una exploración exhaustiva de la superficie de energía de potencial de los iones aducto está fuera del objetivo de este trabajo y la meta es más bien determinar el perfil IR de distintos motivos de unión que pueden anticiparse para estos clusters con el fin último de conocer sus estructuras para explicar los espectros de masa. Como aproximación a las estructuras de los clusters microhidratados de calcio con catecol, inicialmente se consideraron complejos consistentes en un único ligando de catecol coordinado al catión metálico. Esta simplificación apuntó a examinar y comparar estructuras que presentaran distintos motivos de unión al metal así como posibles tautómeros del ligando. La ocurrencia de tautómeros debió ser considerada en complejos de Pb(II) con nucleobases 23 para dar cuenta de los resultados experimentales IRMPD de los complejos generados por ESI y por este motivo fueron tenidos en cuenta. Los espectros IR calculados se muestran en la Figura 4.9 en orden creciente de energía para las ocho estructuras optimizadas 2Ca-2Ch. Las tres estructuras de menor energía (2Ca, 2Cb y 2Cc) resultaron ser tautómeros ceto-enólicos de la estructura 2Cd, en los que al menos uno de los grupos hidroxilo aparece desprotonado (en su forma ceto) y el protón se encuentra sobre un átomo de carbono en posición orto o para respecto a este grupo. En las cuatro estructuras 2Ca-2Cd, ambos átomos de oxígeno coordinan al calcio, es decir, el ligando se coordina al metal de modo bidentado. Por otra parte, las estructuras 2Cg y 2Ch que presentan una coordinación similar pero en las cuales ambos grupos hidroxilo están desprotonados resultaron ser las de mayor energía, mientras que las estructuras 2Ce coordinada a través de un único átomo de oxígeno y 2Cf mostrando una interacción -catión metálico 95 exhibieron valores de energía intermedios. 79

197 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Intensidad/ km.mol Ca Intensidad / km.mol Ca. kcal mol - Intensidad / km.mol - Intensidad / km.mol Cb 2Cc Intensidad / km.mol - Intensidad / km.mol Cb 2Cc 3.2 kcal mol kcal mol - 4 2Cd 4 2Cd 8. kcal mol - Intensidad / km.mol - 2 Intensidad / km.mol número de onda / cm número de onda / cm - 4 2Ce 4 2Ce 25.2 kcal mol - Intensidad / km.mol - 2 Intensidad / km.mol - 2 Intensidad / km.mol Cf Intensidad / km.mol Cf 25.7 kcal mol - Intensidad / km.mol Cg Intensidad / km.mol Cg 3.3 kcal mol - Intensidad / km.mol Ch número de onda / cm - Intensidad / km.mol Ch 32.9 kcal mol número de onda / cm - Figura 4.9. Comparación de los espectros IR lineales calculados para ocho complejos dicargados de catecol con calcio 2Ca-2Ch al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) junto a las estructuras y diferencias de energía relativa entre las mismas. Las líneas en rojo corresponden a algunas de las bandas de absorción de los iones aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ de las Figuras 4.7 y

198 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 El análisis de los espectros IR de la Figura 4.9 reveló como mejor candidato en una primera aproximación a la estructura 2Cd, al tener en cuenta las frecuencias de las bandas previamente observadas en los espectros IRMPD obtenidos para los iones aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ (Figuras 4.7 y 4.8). Más aún, puede notarse que en aquellas estructuras que presentaban un tautómero ceto del catecol coordinado al calcio (2Ca, 2Cb, 2Cc, 2Cg, y 2Ch), aparecieron picos agudos en el rango de 5-7 cm - correspondientes al modo de estiramiento C=O (σ C=O ). Sobre la base de la ausencia de bandas que evidencien este modo en los espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, se pueden descartar en principio, estructuras conteniendo tautómeros ceto del catecol. De manera similar, la presencia de dos bandas intensas en la región de estiramiento O-H, exhibidas por las estructuras donde el catecol no se encuentra coordinado de modo bidentado (2Ce y 2Cf), sugeriría que la presencia de estos motivos de unión resulta poco probable. Contando con los resultados anteriores, se procedió a incorporar las moléculas de agua y el ligando adicional de catecol a la estructura 2Cd, generando así nuevos candidatos a estructuras para los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol denotados 2D y 2E, respectivamente. Considerando estudios previos realizados con iones metálicos solvatados con agua, como calcio 2,24 y magnesio 25,26, pueden anticiparse los diferentes motivos que caracterizan el arreglo de las moléculas de agua. De acuerdo al número de coordinación (NC) del calcio, 3, 4, 5 o 6, pueden esperarse estructuras con geometrías trigonal, tetraédrica, piramidal cuadrada u octaédrica, respectivamente. En la Figura 4. pueden observarse las distintas geometrías que se encontraron para 2D y 2E. Algunos de los ángulos de enlace más relevantes de las estructuras de los complejos microhidratados dicargados con calcio y dos ligandos de 2 se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.2, pág. 252). Como se observa en la Figura 4., las estructuras más estables para cada cluster microhidratado (2Da y 2Ea) resultaron aquellas en las que las moléculas de agua se encuentran directamente unidas al Ca(II) con ambos ligandos de catecol coordinados de manera bidentada, alcanzándose así el máximo NC del metal. Las estructuras de mayor energía del cluster monohidratado, 2Db y 2Dc, exhibieron un puente de hidrógeno interligando entre la molécula de agua y un grupo hidroxilo, como lo evidenciaron las distancias relativamente cortas entre ellos (.62 Å y.76 Å para 2Db y 2Dc, respectivamente). La formación de estos puentes de hidrógeno requiere un reordenamiento dentro de la esfera de coordinación del metal, reduciéndose así el NC 8

199 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos de 5 a 4. Para el cluster dihidratado, fueron caracterizadas dos estructuras, 2Ea y 2Eb, con un NC de 6, difiriendo únicamente en la configuración de los ligandos. Las longitudes de enlace en estas estructuras resultaron esencialmente similares, como se observa en la Figura 4.. La estructura optimizada de menor energía (2Ea) puede ser considerada como una geometría octaédrica distorsionada, donde ambas moléculas de agua se encuentran adyacentes, constituyendo por tanto el isómero cis. Por otro lado, la estructura de mayor energía (2Eb) resultó más simétrica con las dos moléculas de agua en lados opuestos del átomo metálico central, resultando entonces el isómero trans. Los espectros IR calculados de las estructuras correspondientes a los clusters microhidratados (Figura 4.) fueron comparados con los espectros IRMPD experimentales de [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ en las Figuras 4. y 4.2, respectivamente. A partir de la comparación de los espectros calculados de las estructuras 2Da, 2Db y 2Dc con el espectro experimental de [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (Figura 4.), resulta claro que éste se encuentra mejor reproducido por el de la estructura 2Da, que además resulta la estructura más favorecida a priori por su menor energía respecto de las otras (Figura 4.). Por otra parte, en la Figura 4.2 se nota que los rasgos predichos tanto por la estructura 2Ea como 2Eb (ligeramente de mayor energía), reproducen bien los espectros experimentales IRMPD del ion aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+. Resultó llamativo no encontrar diferencias entre los espectros IR de estos isómeros cis/trans en la región de -4 cm -, donde las bandas están asociadas con los modos vibracionales de los ligandos. Tal vez, a menores frecuencias podrían encontrarse diferencias en la configuración de 2Ea y 2Eb, por ejemplo, en la región entre 4-5 cm -. Las asignaciones de las frecuencias vibracionales de las estructuras calculadas 2Da, 2Ea y 2Eb se listan en la Tabla 4.9. En general, las desviaciones observadas entre las posiciones de los máximos de las bandas experimentales respecto a las frecuencias de los modos más intensos que contribuyen a las mismas fueron menores a 2 cm - en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H, como se nota en la Tabla

200 83 Figura 4.. Estructuras (con grupos de simetría puntual) de los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol optimizados al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Las energías relativas a K (mostradas entre paréntesis) estan en kcal mol - y las longitudes de enlace estan en Å. Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4

201 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Intensidad / u.a Da Intensidad / u.a Da Intensidad / u.a Db Intensidad / u.a Db Intensidad / u.a Dc Intensidad / u.a c número de onda / cm número de onda / cm - ) Figura 4.. Espectros de absorción IR de las estructuras 2Da, 2Db y 2Dc optimizados al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) comparados con el espectro IRMPD de [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (en negro). Intensidad / u.a Ea Intensidad / u.a Ea Intensidad / u.a Eb Intensidad / u.a Eb número de onda / cm número de onda / cm - Figura 4.2. Espectros de absorción IR de las estructuras 2Ea y 2Eb optimizados al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) comparados con el espectro de IRMPD de [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ (en negro). 84

202 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Tabla 4.9. Frecuencias vibracionales experimentales de los iones aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ y [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+ (espectros IRMPD) comparadas con los valores de las estructuras más estables (2Da, 2Ea y 2Eb) calculados al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Modo [Ca(catecol) 2(H 2O)] 2+ vibracional a b exp / cm - 2Da c [Ca(catecol) 2(H 2O) 2] 2+ calc / cm - b exp / cm - 2Ea c calc / cm - 2Eb c calc / cm - asim H 2O 3638 (97) 368 [2] A 3655 (352) 366 (354) sim H 2O 3597 (556) 366 (54) 364 (53) σ OH 366 [2] B 3574 (4) 363 [2] B 3586 (228) 359 (9) b H 2O 645 (38) 639 (257) 636 (27) σ CC ( 9b) 646 [2] C 6 () 636 [7] C 63 (2) 63 (2) σ CC( 8b) 55 (64) 56 (74) 56 (75) 489 [] D 495 [2] D σ CC ( 8a) 477 (42) 475 (47) 477 (47) σ CC ( 5) β COH σ CO 3 [5] E, F 334(78) 36 [8] E, F 333 (69) 333 (7) 238 (74) 243 (6) 225 [6] G 234 [8] G β CH( 9b) 23 (553) 236 (427) 236 (57) β COH 98 [7] H 26 (37) 23 [2] H 22 (49) 22 (398) β CH( 4) 57 I 68 (4) 68 (2) β CH( 9a) 7 [] J 83 (7) 8 [5] J 86 (97) β OH 75 (7) 8 (28) 87 (9) a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson ( ni ) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C 2v asignadas consistentemente en la Ref. 98 y adaptadas a las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm - ) está entre corchetes. c Frecuencias armónicas escaladas por.98 en el rango de la huella digital y por.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol - están entre paréntesis. La banda del espectro IRMPD próxima a 3 cm - resultó ser la peor reproducida por los cálculos DFT, con frecuencias de absorción calculadas mayores que las encontradas experimentalmente. Cabe mencionar que el modo que aparece en esta zona (σ CC ( 5 )) ha sido calificado como problemático en estudios realizados con el fenol 27. En este modo predominan contribuciones de las vibraciones de estiramiento C-C y la molécula se distorsiona en el plano conduciendo a una estructura de Kekule del anillo de benceno, alterando así marcadamente la densidad electrónica entre átomos de carbono. Curiosamente, cuando fueron comparados los espectros IRMPD de complejos de salicilato de calcio 28 con espectros IR calculados usando varios funcionales DFT, así como diferentes conjuntos de funciones base, también se 85

203 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos observaron las mayores desviaciones en la región próxima a 3 cm -. A pesar de esto, la elección del funcional B3LYP y la base 6-3+G(d,p) mostró el mejor compromiso entre la precisión en la predicción de las frecuencias vibracionales y el costo computacional lo que avala nuestra elección y sustenta los resultados obtenidos para catecol. Al comparar las asignaciones de los modos vibracionales realizada previamente considerando el catecol libre (Tablas 4.7 y 4.8) con aquellas predichas para las estructuras más estables de los clusters (Tabla 4.9) puede notarse que la identidad de las asignaciones de los modos vibracionales no difiere, excepto por la banda C que aparece a ~64 cm -, correspondiente en forma predominante al modo de flexión del agua ( b ) y la banda I que aparece a ~6 cm - para [Ca(catecol) 2 (H 2 O) 2 ] 2+, donde la identidad del modo de estiramiento es distinta. Esto último no resulta inesperado dado que esta banda (I) fue identificada sólo en un confómero de catecol (2a), que además no corresponde a la geometría que adopta el catecol en las estructuras de los clusters. De todos modos, las asignaciones tentativas a partir de la comparación directa del espectro infrarrojo del ligando libre son bastante satisfactorias como primera aproximación al proporcionar resultados similares que los obtenidos a partir de las estructuras calculadas. En términos generales, los espectros de absorción IR calculados para las estructuras de menor energía de los iones aducto estudiados coincidieron bastante bien con sus espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, permitiendo así su caracterización estructural así como la asignación de las bandas de absorción en el IR. De esta manera, se encontró que las geometrías de los iones aducto microhidratados de calcio(ii) con catecol se caracterizaron por presentar el mayor número de coordinación posible sobre el metal, con los ligandos de catecol coordinados de forma bidentada y sin evidencia de tautomerización en la estructura de los mismos. Al intentar repetir los experimentos de espectroscopía IRMPD utilizando resorcinol, en lugar de catecol, y calcio en las mismas condiciones experimentales (Capítulo 5, pág. 26), no se obtuvo ninguna señal de los iones aducto dicargados lo cual impidió su estudio por IRMPD. Por este motivo, las estructuras sugeridas para los iones aducto con calcio y resorcinol en la sección 4.4, son propuestas de modo tentativo. 86

204 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional El proceso de reducción o separación de cargas 69 puede ocurrir por CID, a lo largo de la desolvatación en la fuente API o por influencia del solvente 29. Esto se observa cuando un ion múltiplemente cargado deja de ser capaz de estabilizar su carga, lo cual ocurre por ejemplo al disminuir el número de moléculas de solvente en su esfera de solvatación 22. La desestabilización de la carga puede eventualmente conducir a la reducción de carga del ion por transferencia de un protón a uno de los ligandos, como se ejemplifica en la ecuación 4. para la reducción de carga de un metal dicargado microhidratado: [M(H 2 O) n ] 2+ [M(OH)(H 2 O) n-2 ] + + [H 3 O] + (4.) Debe observarse que la reducción de carga se logra por una separación de cargas mientras que el estado de oxidación del metal permanece invariable. La reacción de transferencia protónica interligando, de acuerdo a la ecuación (4.), fue explorada en detalle por cálculos computacionales para los complejos de calcio 22, [Ca(H 2 O) 2 ] 2+, proponiéndose que la reacción procedía a través de un mecanismo en el cual el primer paso corresponde a la migración de una molécula de agua desde la esfera de solvatación interna a la externa. Recientemente, fueron determinados experimentalmente por primera vez 222 los valores umbrales energéticos de este proceso de separación de cargas en fase gaseosa a partir de estudios CID de [Ca(H 2 O) 2 ] 2+ y [Ca(H 2 O) 3 ] 2+, encontrándose valores comparables a los determinados previamente por cálculos computacionales 22. Con el fin de brindar una perspectiva de la disociación de los iones aducto dicargados y las estructuras iónicas relevantes para poder interpretar los espectros de masa obtenidos, se realizaron cálculos computacionales exploratorios. Por este medio, se investigó la posible justificación de las diferencias observadas en la sección (pág. 66) respecto a la formación y abundancias relativas de especies mono y dicargadas formadas en fase gaseosa a partir del calcio (II) con los isómeros catecol 2 y resorcinol 22. Vale la pena recordar que el comportamiento de estos isómeros había resultado peculiar en comparación con aquel de los isómeros de N-óxidos de hidroxipiridinas y pirazinas, ya que de manera opuesta, el compuesto capaz de formar quelatos estables (catecol, en este caso) exhibió iones aducto dicargados (en lugar de monocargados), mientras que aquel con características de ligando monodentado como 87

205 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos el resorcinol, mostró iones aducto monocargados con un ligando desprotonado mayoritariamente (en lugar de dicargados o con el contraión cloruro). Entre los iones aducto dicargados microhidratados con calcio se escogió como modelo [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+, por representar la estructura más sencilla y además ser estudiada en la sección anterior a partir de la comparación satisfactoria del espectro IRMPD de este ion aducto con el espectro IR calculado de 2Da. En consecuencia, esta estructura fue tomada como punto de partida para estudiar los mecanismos de fragmentación. Respecto al resorcinol, la imposibilidad de obtener el espectro IRMPD del ion aducto dicargado análogo impidió la confirmación de la estructura del mismo, denotada 22Da por analogía. En este caso, como la estructura de partida no pudo definirse con precisión, el objetivo perseguido no consistió en realizar una búsqueda exhaustiva de la SEP para caracterizar todas las posibles estructuras, sino más bien encontrar posibles estructuras para realizar un análisis energético con fines comparativos. En consecuencia, se exploraron diferentes estructuras, teniendo en consideración y adaptando los motivos favorables hallados para catecol, para el análisis de los caminos de disociación de este ion aducto. Figura 4.3. Esquema de distintos mecanismos de disociación propuestos a partir del ion aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+. Los mecanismos considerados con origen en la estructura 2Da fueron de dos clases (Figura 4.3), pérdidas de ligandos neutros, como una molécula de agua o catecol (caminos A y B, respectivamente) y separación de carga, involucrando la escisión del ion aducto dicargado en dos iones monocargados. Respecto a este último, el mecanismo explorado fue aquel por el cual se produce una transferencia de protón para formar la molécula protonada de catecol y [Ca(catecol)(H 2 O)-H] +, indicado como camino C. Para caracterizar las estructuras de los estados de transición, intermediarios e iones producto primarios de las reacciones de disociación principales, se llevaron a cabo optimizaciones de geometría de los puntos estacionarios encontrados al realizar barridos de la SEP (Capítulo 5, pág. 24), completando la 88

206 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 caracterización por el análisis de frecuencias de los mismos. En la Figura 4.4, se muestran los perfiles de energía a lo largo de los caminos de disociación por los mecanismos estudiados, con las estructuras correspondientes a los puntos estacionarios encontrados. Los parámetros geométricos más significativos de estas estructuras calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) se exhiben en la Figura 4.5 mientras que algunos ángulos de enlace también importantes se resumen en el Capítulo 5 (Tablas 5.2 y 5.2, pág. 252). Como se nota en la Figura 4.4, la pérdida de agua (2PA) constituye el canal de fragmentación de menor energía, como se había observado previamente en los experimentos IRMPD de la sección 4.3. El valor aquí calculado está próximo al medido e informado en la literatura para el complejo análogo Ca(H 2 O) 5 (27 ± 2 kcal mol - ). La pérdida de catecol y los procesos de separación de carga requieren la transferencia de una molécula de catecol desde la esfera interna de coordinación de solvente a la externa, donde se une a través de un enlace de hidrógeno con la molécula de agua formando el intermediario 2De. Al separarse el catecol del calcio, un protón podría ser transferido desde la molécula de agua a la molécula de catecol en la segunda esfera de coordinación, permitiendo de ese modo la formación de dos iones monocargados que se separan mutuamente por repulsión culómbica a través de 2TSC. Vale la pena notar que la similitud entre las barreras energéticas para la separación de cargas (2TSC) y la pérdida neutra de catecol (Camino B) a partir del ion aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (2Da) indicaría que se pueden originar los iones producto [Ca(catecol)(H 2 O)-H] + (2PC), [(catecol)h] + (2Ha) (camino C) y [Ca(catecol)(H 2 O)] 2+ (2PB). Este hecho resulta consistente con el espectro de masa tándem (Figura 4.5, pág. 69), donde se observan ambos iones fragmento. Por otra parte, el valor calculado para la formación de 2PB está próximo al valor medido e informado en la literatura 222 para la energía de la pérdida simultánea de dos moléculas 2+ de agua a partir del complejo análogo Ca(H 2 O) 5 (62 ± 3 kcal mol - ). Los parámetros geométricos de la estructura 2TSC (Figura 4.5), resultaron similares a aquellos encontrados 22 en la estructura análoga calculada a partir de [Ca(H 2 O) 2 ] 2+, aunque con distancias de separación ligeramente mayores en este trabajo, probablemente a causa de la estabilización por el ligando catecol adicional quelando al calcio. 89

207 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Figura 4.4. Perfil de energía para los caminos de pérdida de ligandos y de separación de carga a partir del ion aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (2Da) con las estructuras de los estados de transición, intermediarios y productos de disociación primarios obtenidos al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Las energías en kcal mol - incluyendo correcciones de energía de punto cero (ZPE) son mostradas para todas las estructuras que corresponden a puntos estacionarios. En la Figura 4.6, se muestran el conjunto de estructuras calculadas con los parámetros geométricos más significativos para el ion aducto [Ca(resorcinol) 2 (H 2 O)] 2+ (22Da, 22Da2 y 22Da3) así como para el estado de transición para la separación de carga (22TSC y 22TSC2) y los productos de disociación de los caminos estudiados (22PA, 22PB y 22PC) mientras que algunos ángulos de enlace también importantes se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.22, pág. 253). 9

208 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Figura 4.5. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p), correspondientes a los puntos estacionarios del perfil de energía a partir del ion aducto [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (2Da) mostrados en la Figura

209 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Figura 4.6. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p), obtenidas para el ion aducto [Ca(resorcinol) 2 (H 2 O)] 2+ (22Da-3), el estado de transición para la separación de cargas (22TSC-2) y los productos de disociación primarios de los caminos estudiados (22PA, 22PB y 22PC). 92

210 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Como puede observarse en la Figura 4.6, las estructuras de los complejos de calcio(ii) con resorcinol presentan una mayor libertad conformacional a causa de la coordinación monodentada de los ligandos y la mayor distancia entre los grupos hidroxilo que permite la formación de puentes de hidrógeno interligando. Debe tenerse presente además que las estructuras mostradas fueron obtenidas a partir de un muestreo parcial y no exhaustivo de la SEP, debido a la cantidad de grados de libertad que exhiben estos complejos, y por lo tanto, podrían no representar las conformaciones correspondientes a los mínimos de menor energía. Puede verse entonces la importancia de IRMPD para la selección de las estructuras precisas. Sin embargo, el valor energético de estas estructuras optimizadas sirve como parámetro para comprobar si las estructuras propuestas no presentan al menos, valores comparables con los de las estructuras análogas con catecol, así como los complejos de calcio con agua. En la Tabla 4., se presentan los valores de las energías relativas para los estados de transición de la separación de carga y sus productos, así como para los productos de pérdida de agua y de ligando a partir de los iones aducto de calcio dicargados con dos ligandos y una molécula de agua, calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p). Además, se incluyeron los valores de literatura disponibles determinados experimentalmente para los complejos de calcio(ii) análogos. A partir de la Tabla 4. se encuentra que las estructuras con catecol presentan una barrera energética ~2 kcal mol - mayor que las de resorcinol para los caminos de disociación B (pérdida de ligando neutro) y C (separación de carga), mientras que la misma es 2 kcal mol - menor para la pérdida de agua (A). Esta diferencia resulta acorde con el modo de coordinación de ambos ligandos, es decir, bidentado para el catecol y monodentado para el resorcinol, ya que como se observa en el perfil de la Figura 4.4, los intermediarios de las estructuras de catecol donde un ligando se coordina de forma monodentada (2Dc y 2Dd) presentan una diferencia de energía similar relativa a la estructura más estable (2Da), donde el modo de coordinación es bidentado. Por otra parte, si bien los valores calculados para los complejos de catecol se correlacionaron bien con los disponibles medidos experimentalmente en complejos de calcio dicargados con agua, no ocurrió lo mismo para los de resorcinol, en especial para la pérdida de agua. Esto podría deberse a las interacciones intermoleculares 93

211 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos presentes en las estructuras propuestas para los clusters de resorcinol monohidratados, 22Da-3 (Figura 4.6), que presentan un puente de hidrógeno entre la molécula de agua y uno de los ligandos, que se encuentran ausentes en los complejos dicargados de calcio microhidratados con NC < 7. Tabla 4.. Energías relativas a K calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) a partir de [Ca(catecol) 2 (H 2 O)] 2+ (2Da) y [Ca(resorcinol) 2 (H 2 O)] 2+ (22Da) para los caminos de separación de carga y pérdida de ligandos Estructura Energía a / kcal mol - Complejo Energía b / kcal mol - Estructura Energía a / kcal mol - Complejo Energía b / kcal mol - 2Da [Ca(H 2O) 5] 2+ 22Da2.4 2PA + H 2O 2PB + 2a [Ca(H 2O) 4] 2+ + H 2O [Ca(H 2O) 3] H 2O 27 ± 2 62 ± 3 22Da [Ca(H 2O) 3] 2+ 22Da3.8 22PA + H 2O 22PB + 22a TSC TSC TSC [Ca(H 2O) 2] 2+ + H 2O 4 ± 2 [CaOH(H 2O)] + + H 3O + 39 ± 4 2PC 22PC Ha + 22Ha a Evaluaciones de energía calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) incluyendo correcciones de punto cero. b Valores umbrales energéticos determinados experimentalmente en la Ref Los cálculos computacionales al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p) sugieren que en el caso de los complejos dicargados de calcio con catecol y resorcinol monohidratados, la pérdida de una molécula de agua es el canal de fragmentación de menor energía seguido por productos de separación de carga y la pérdida de una molécula neutra de ligando, en acuerdo con las especies observadas al efectuar CID sobre los iones aducto dicargados de calcio con estos compuestos. Sin embargo, los canales de fragmentación de mayor energía presentaron diferencias apreciables entre ambos sistemas, ofreciendo una barrera menor en 2 kcal mol -, en el caso del resorcinol. Esta diferencia se origina en el diferente modo de coordinación de ambos ligandos, facilitándose la ocurrencia de procesos de separación de carga para ligandos monodentados, como el resorcinol, justificando así las diferencias entre isómeros antes observadas en los espectros de masa. 94

212 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS A pesar de que la derivatización no es generalmente necesaria para el análisis de compuestos por LC-MS, ya que hoy en día existen fases cromatográficas y condiciones experimentales que permiten el análisis de prácticamente cualquier compuesto, puede resultar conveniente para aumentar la intensidad de las señales al alterar las propiedades de ionización de las moléculas analizadas 5. La derivatización postcolumna es un método comúnmente empleado en cromatografía líquida (LC) para mejorar la sensibilidad de la detección con distintos detectores, como por ejemplo UV o fluorescencia, de ciertas clases de analitos. De manera análoga, también se ha empleado en LC-MS. Por ejemplo, se empleó la adición postcolumna de reactivos como hidróxido de trimetilfenilamonio, 2-mercaptopiridina y cloruro de benzoílo para la detección de compuestos relacionados con armas químicas 223 mejorando la sensibilidad de compuestos difíciles de ionizar por APCI. Sobre la base de la riqueza de información disponible de la química de coordinación, las sales de metales, principalmente de plata, han sido aplicadas como agentes de complejación postcolumna permitiendo aumentar la sensibilidad en la ionización por ESI-MS de una amplia clase de compuestos a través de la formación de complejos estables con este metal por interacciones -catión metálico 7. Otra implementación del uso de metales postcolumna fue en una estrategia LC-MS/MS, para el análisis y diferenciación de isómeros de diglicósidos de flavonoides en mezclas 39 empleando también plata mientras que una estrategia similar fue usada para la elucidación estructural de hidratos de carbono 224 empleando cloruro de cobalto. Teniendo en cuenta estos antecedentes y la capacidad de los dihidroxiarenos de formar complejos con metales 225, se evaluó la posibilidad de emplear una solución metálica como aditivo postcolumna en HPLC para el análisis de mezclas de los isómeros de dihidroxiarenos, previamente diferenciados individualmente por infusión directa en la sección 4.2. Se analizó una mezcla de los compuestos 2-24 en cantidades equimolares. Los complejos de los compuestos detectados por ESI-MS, se obtuvieron mezclando el efluente de salida de la columna de HPLC con la solución del metal, introducida por la bomba de jeringa de infusión directa, a través de una unión en T ubicada antes de la entrada a la fuente de ionización. Entre los metales estudiados en la sección 4.2, se escogió el calcio para realizar este estudio por ofrecer una buena diferenciación entre los isómeros. 95

213 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos La separación cromatográfica óptima entre los isómeros fue lograda usando una columna con fase estacionaria modificada con grupos pentafluorofenilo (PFP) bajo las condiciones de gradiente de acetonitrilo:agua que se detallan en el capítulo 5 (pág. 27). Otras condiciones experimentales testeadas fueron el uso de fase reversa (RP- C8) y de interacción hidrofílica HILIC, así como diferentes fases móviles conteniendo metanol y soluciones diluidas de ácido fórmico (. %) en agua. Los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) obtenidos sin y con el agregado postcolumna de calcio se muestran en la Figura 4.7. En ambos casos se muestra el cromatograma UV obtenido en forma simultánea. En los cromatogramas UV de la Figura 4.7 pueden observarse los 2 pares de compuestos isoméricos con tiempos de retención (T R ).8 / 2. min y 5.5 / 5.8 min, correspondientes a los dihidroxibencenos y dihidroxinaftalenos, respectivamente. Observando los espectros ESI-MS obtenidos con el agregado postcolumna de calcio a los tiempos de retención correspondientes a los compuestos 2-24, resulta posible determinar la identidad de cada uno de los isómeros de los dihidroxiarenos eluídos. Los espectros correspondientes a los 4 compuestos se muestran en la Figura 4.8. Las especies observadas en los espectros de masa de los picos con T R 2., 5.5 y 5.8 min de la Figura 4.8 resultaron coincidentes con las ya identificadas en la Tabla 4.2 (pág. 6) para el catecol 2,,3-naftalendiol 24 y 2,3-naftalendiol 23, respectivamente. Sin embargo, en el espectro de masa restante correspondiente al compuesto 22, se observaron iones aducto de calcio con acetonitrilo, no evidenciándose la presencia del resorcinol en ninguno de ellos. Por este motivo, se investigó si la falla en la detección del resorcinol podría deberse a un efecto del solvente empleado dado que los experimentos antes realizados habían empleado soluciones metanólicas de los analitos y no se había probado con acetonitrilo. Al repetir los experimentos de infusión directa con soluciones de resorcinol en acetonitrilo mezcladas con cloruro de calcio acuoso se comprobó la presencia únicamente de iones aducto conteniendo la sal de metal junto al solvente empleado. De esta manera, quedó en evidencia la importancia del solvente en la formación de los iones aducto con resorcinol, a diferencia de los otros compuestos para los que no hubo diferencias. 96

214 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Intens. [u.a.] x 6.8 a) TIC +MS Intens. [mua] x Cromatograma UV, 9-95 nm Intens. [u.a.] b) TIC +MS x Intens. [mua] x Cromatograma UV, 9-95 nm Tiempo [min] Figura 4.7. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos isómeros 2, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (a) y con agregado postcolumna de calcio (b) empleando un gradiente de acetonitrilo:agua (pág. 27) 97

215 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Intens. [u.a.] MS, TR.8 min m/z Intens MS, TR 2. min [u.a.].25 [M+Ca-H] + x [2M+Ca+H 2O-H] m/z Intens. [M+H] + [u.a.] MS, TR 5.5 min x m/z Intens. [2M+Ca+2H 2O] ++ [u.a.] MS, TR 5.8 min x [M+Ca+2H 2O-H] [3M+Ca] m/z Figura 4.8. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna de calcio obtenidos a partir de una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos 2-24.

216 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 Cabe destacar que la fase móvil utilizada siempre resulta de un compromiso entre la eficiencia cromatográfica y la sensibilidad en la detección debido al efecto producido sobre la ionización 226. Así, al cambiar el solvente orgánico de la fase móvil por metanol, no fue posible resolver la mezcla de los naftalendioles aunque sí la de los dihidroxibencenos. Luego, partiendo de una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos 2 y 22 se optimizaron las condiciones de separación con la misma columna, pero utilizando un gradiente de metanol:agua (capítulo 5, pág. 27). En la Figura 4.9 se observan los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) junto al cromatograma UV obtenido con el agregado postcolumna de calcio, donde pueden observarse los dos compuestos a T R 3. y 3.6 min. Los espectros de masa correspondientes a estos tiempos de retención se muestran en la Figura 4.2. Como se observa al comparar los espectros de la Figura 4.2 con los correspondientes de la Figura 4.8, al emplear metanol se observaron los iones aducto con calcio característicos de ambos isómeros y con intensidades mayores, mejorando así la sensibilidad del análisis de los mismos para su diferenciación (cf. Fig. 4.4 d y c, pág. 67). Intens. [u.a.] x 6.5 TIC +MS..5. Intens. [mua] x Cromatograma UV, 9-95 nm Tiempo [min] Figura 4.9. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos isómeros 2 y 22 por LC/MS con agregado postcolumna de calcio empleando un gradiente de metanol:agua (pág. 27). 99

217 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos Intens. [u.a.] x 4..8 [M+H] [M+Ca+H 2O-H] MS, TR 3. min Intens. [u.a.] x m/z 2. [2M+Ca+2H 2O] MS, TR 3.6 min m/z Figura 4.2. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna de calcio a partir de una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos isómeros 2 y 22. En la Figura 4.2 se muestra la superposición entre los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) en ausencia y con agregado postcolumna de calcio de la mezcla de los 4 compuestos. El efecto más importante que puede observarse reside en las intensidades de los picos de los compuestos 2, 23 y 24, y en las abundancias absolutas de los iones respectivos en los espectros de masa, cuyos picos base aumentan casi diez veces. Resultados similares fueron observados al emplear una solución equimolar veces más diluida (. mm) aunque con una solución equimolar veces más diluida (. mm) ya no fueron detectadas señales atribuibles a los compuestos en el cromatograma TIC. Por último, se observó el efecto de variar el flujo de la bomba de jeringa, por la cual se introduce el agente de complejación para ser mezclado con el efluente de la columna vía una conexión en T. No se observaron diferencias apreciables utilizando 2

218 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 un flujo entre 3 y 5 l / min, por lo que se empleó el primer valor que fue el usado corrientemente en los experimentos de infusión directa realizados. Sin embargo, se observó que un aumento del flujo a un valor mayor al doble (~ 8 l / min) elevaba la línea de base del cromatograma, es decir, disminuía la relación señal / ruido, mientras que la disminución del flujo a menos de la mitad (~.5 l / min), si bien bajaba la línea base del cromatograma, reducía en mayor proporción la señal, por lo que también disminuía la relación señal / ruido. En consecuencia, el valor de flujo usado resultó óptimo bajo las condiciones experimentales empleadas. Intens. [u.a.] x TIC +MS Tiempo [min] mezcla 2, 22, 23 y 24 (mm) sin calcio agregado mezcla 2, 22, 23 y 24 (mm) con calcio agregado Figura 4.2. Comparación entre los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) para una mezcla equimolar ( mm) de los compuestos isómeros 2, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (línea negra) y con (línea roja) agregado postcolumna de calcio. Este ejemplo muestra que la metodología empleada de complejación postcolumna puede ser utilizada como método para diferenciar isómeros por ESI-MS luego de su separación por HPLC. De esta manera, con un simple experimento LC-ESI-MS, se puede derivar información estructural a partir de los espectros de masa observados de acuerdo al metal agregado postcolumna, evitando el uso de experimentos LC-MS/MS. El agregado de un agente de complejación postcolumna puede constituir además un método para el análisis de analitos difíciles de ionizar en modo positivo, permitiendo su observación o aumentando su sensibilidad, como fue observado para la mayor parte de los compuestos estudiados. Además, resulta simple ya que requiere sólo una conexión en T y como la complejación ocurre postcolumna, el espectro de masa puede modificarse sin cambiar los tiempos de retención de LC, brindando una confirmación altenativa y permitiendo la identificación de diferentes isómeros como fue ilustrado en este caso. 2

219 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos 4.6. Conclusiones La complejación con iones metálicos, a partir de los iones aducto generados por electrospray, permitió encontrar diferencias en los espectros de masa entre cada par de isómeros de dihidroxiarenos, de manera análoga a lo observado en los capítulos precedentes con otros compuestos. Los metales trivalentes, como aluminio y galio, exhibieron principalmente iones aducto conteniendo ligandos desprotonados para los isómeros con sustitución orto, mientras que en aquellos con sustitución meta predominaron los iones aducto con ligandos en su forma neutra. Esta tendencia fue menos evidente con los metales divalentes como cobalto y cobre que mostraron en general más especies comunes a ambos isómeros. En particular, la complejación con calcio presentó un comportamiento llamativo con los isómeros de dihidroxibenceno y dihidroxinaftaleno, observándose en los espectros iones aducto dicargados para las estructuras con sustitución orto, mientras aquellas con sustitución meta mostraron iones aducto monocargados con un ligando desprotonado. Esta aparente contradicción con lo observado en los capítulos precedentes para la complejación diferencial con calcio (II) fue explorada en profundidad mediante distintos experimentos en conjunto con cálculos computacionales. A partir de experimentos en los que se aumentó la concentración de una base, agregada a la solución previo a la infusión de la mezcla de cada compuesto con calcio, se observó un aumento en la abundancia de iones aducto conteniendo especies desprotonadas, aunque estos cambios no explicaron las diferencias entre isómeros observadas en los espectros. Por otra parte, al modificar los parámetros instrumentales de transporte de los iones generados en la fuente de ionización, y realizar luego experimentos CID sobre los iones aducto con calcio dicargados, se observaron iones fragmento conteniendo ligandos desprotonados. Este indicio, que podría explicar las diferencias observadas entre isómeros en términos de las energías involucradas para este proceso, fue investigado por cálculos computacionales. Para realizar el estudio de los caminos de disociación de los iones aducto dicargados con calcio, se realizó primeramente un estudio estructural de los mismos. Las estructuras en fase gaseosa de los clusters microhidratados de calcio(ii) con catecol fueron elucidadas por experimentos de espectroscopia IRMPD en combinación con cálculos computacionales. La concordancia hallada a partir de la comparación 22

220 Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4 entre los espectros IRMPD y los espectros de absorción IR de las estructuras calculadas de menor energía, pemitió la asignación de los rasgos espectrales y por ende de los motivos de unión estructurales. De esta manera, fueron caracterizadas las geometrías de los iones aducto microhidratados de calcio(ii) con catecol, quedando en evidencia el valor de la espectroscopía IRMPD como medio para comprender la estructura de los iones observados en los espectros de masa. La exploración de los caminos de disociación de los complejos dicargados de calcio con catecol y resorcinol monohidratados, mediante cálculos computacionales al nivel de teoría B3LYP/6-3+G(d,p), mostró la pérdida de agua como el camino de menor energía, en concordancia con lo observado en los experimentos IRMPD para los complejos de calcio con catecol microhidratados. Los caminos de disociación restantes de mayor energía (separación de carga y pérdida de una molécula neutra de ligando), cuyos productos habían sido observados a partir de experimentos CID, mostraron diferencias en las barreras energéticas calculadas para los complejos de ambos isómeros. Estas diferencias originadas por el distinto modo de coordinación de ambos ligandos, explicaría la mayor ocurrencia de procesos de separación de carga a partir de iones aducto dicargados con ligandos monodentados, como el resorcinol, dando como resultado la generación de especies monocargadas. Finalmente, como la complejación con metales resultó prometedora, tanto en la detección como diferenciación de los dihidroxiarenos por MS en modo positivo, se evaluó su aplicación práctica como método de detección en HPLC/ESI-MS. La implementación de una solución de metal como agente complejante postcolumna, ejemplificada con el calcio, mostró un aumento de sensibilidad en la detección de los compuestos estudiados, brindando además información estructural útil a partir de las especies iónicas observadas. 23

221 Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos 24

222 Detalles experimentales 5 Capítulo 5.. Espectrometría de Masa 5... Equipamiento y metodología Todos los espectros de masa y MS/MS fueron realizados utilizando un espectrómetro de masa de alta resolución Bruker microtof-q II (UMyMFOR, FCEN, UBA) equipado con las fuentes ESI, APCI o APPI. Este equipo tiene una configuración QqTOF. Las condiciones típicas de operación de estas fuentes API se muestran en la Tabla 5. y en la Figura 5. se esquematiza la interfase de las fuentes de ionización. La fragmentación por CID de los iones seleccionados en el cuadrupolo Q por m/z se realizó en una celda de colisión consistente en un cuadrupolo (q) de sólo radiofrecuencia (RF) con argón de ultra alta pureza como gas de colisión. El cuadrupolo Q (filtro de masa) se fijó normalmente con una ventana de. Da para la transmisión/ aislamiento de los iones precursores. La celda de colisión se fijó a una energía de 9. ev con un flujo de gas de colisión a un valor de 3% del máximo, fijando la RF a 5 Vpp. Para los experimentos de la sección (pág. 66), la energía de la celda de colisión se fijó a 6. ev con un flujo de gas de colisión de 5% del máximo y la RF fijada a Vpp. Tabla 5.. Parámetros operacionales típicos de las fuentes API empleadas Parámetro ESI APCI APPI Offset de la Placa Final (V) Voltaje del Capilar (kv) Nebulizador (bar) Gas secado (N 2 ) (l / min) Temperatura secado (ºC) Temperatura vaporizador (ºC) NA 8 8 Energía de fotones de la lámpara de Kripton (ev) NA NA Corona (ma) NA 4 NA 25

223 Capítulo 5 Detalles experimentales Figura 5.. Esquema de la interfase entre la fuente de ionización ESI y la entrada al TOF. En las fuentes de APCI y APPI se incorporan los elementos : Vaporizador y 2: aguja de descarga corona (APCI) o lámpara de Kriptón (APPI). La calibración de masa con múltiples puntos fue llevada a cabo usando una solución de formiato de sodio desde m/z 5 hasta 9 en el modo de iones positivo. La adquisición de los datos y el procesamiento se realizaron usando el software Bruker Compass Data Analysis versión 4. suministrado con el instrumento. Las soluciones se inyectaron en la fuente por infusión directa usando una bomba de jeringa KDS a un flujo de 3 l / min. IRMPD: Los análisis de espectroscopía IRMPD de la sección 4.3 fueron realizados en un espectrómetro de masa tándem FT-ICR (Bruker Apex Qe) equipado con una fuente ESI (Apollo II), un cuadrupolo como filtro de masa, un hexapolo como celda de colisión/ acumulación y un imán de 7 T. Dos configuraciones experimentales basadas en el acoplamiento del espectrómetro con distintos láseres IR fueron empleadas. Para el rango espectral de 9-7 cm - fue usado el FEL IR de Centre Laser Infrarouge d Orsay (CδIO) operado a 45 εev. δa salida del FEδ consiste en macropulsos de 8 s de duración con una frecuencia de repetición de 25 Hz, estando compuesto cada uno por 5 micropulsos, de unos pocos picosegundos de duración. La potencia de salida del láser medida antes y después de los experimentos varió entre 4 y 6 mw en el rango de frecuencias de 8-6 cm -. La longitud de onda del láser fue registrada con un monocromador acoplado a un detector de arreglo piroeléctrico. El ancho espectral (anchura a media altura, FWHM) fue menor a.5% de la longitud de onda central. Más detalles sobre el funcionamiento de este equipo experimental puede encontrarse en la Ref