TRABAJO DE LABORATORIO Y RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS: ENZIMAS

Transcripción

1 ATIVIDAD RÁTIA N 2 TRABAJ DE LABRATRI Y RESLUIÓN DE RBLEMAS: ENZIMAS INTRDUIÓN Una enzima es una proteína que, además de tener las propiedades generales de estas biomoléculas, posee la propiedad de catalizar las reacciones biológicas, la cual será objeto de estudio en esta actividad. Las enzimas participan en casi todos los procesos biológicos que se producen continuamente en los seres vivos, permitiendo que dichos procesos se lleven a cabo en tiempos compatibles con la vida. uando terminemos el curso veremos situaciones en que las enzimas trabajan en forma regulada. La propiedad catalítica de las enzimas hace referencia a que son capaces de aumentar la velocidad de una reacción, es decir disminuye el tiempo necesario para que se forme una determinada cantidad de producto. Es importante analizar energéticamente que sucede. En una reacción química donde la molécula S se transforma en el producto, la molécula S debe activarse (S*), es decir adquirir una determinada energía conocida como Energía libre de Activación ( G*); solamente las moléculas que alcanzan esta energía pueden transformarse en producto y de ello depende la velocidad de la reacción. S <=======> S* <=======> omo se muestra en la Figura, este estado de transición de alta energía (S*), constituye la barrera que debe ser sorteada para que la reacción se lleve a cabo y se pueda transformar la molécula S en el producto. Esta Energía libre de Activación es independiente de la Energía libre de Reacción ( G), comprendida como la diferencia entre la energía libre del producto (G) y la energía libre del reactivo (GS). La inclusión de un catalizador, aumenta la velocidad de la reacción al disminuir esta Energía libre de Activación, sin modificar la Energía libre de Reacción. En enzimología las moléculas cuya transformación es catalizada por una enzima se denominan Sustratos. En las reacciones bioquímicas la Enzima actúa como un catalizador formando un complejo transitorio con su sustrato, y el proceso que ocurre puede describirse del siguiente modo: 19

2 S + E <=======> [ES]* <=======> + E Donde S, es el sustrato sobre el que actúa la enzima (E), la Enzima a través del sitio activo se une específicamente a su sustrato formando un complejo transitorio enzima-sustrato [ES]*, que es el estado activado, y que constituye el paso intermedio que permite transformar el Sustrato en roducto (). Un vez que actuó, la enzima se recupera ya que como todo catalizador no se consume en la reacción, y así puede unirse a otras moléculas de Sustrato. or lo tanto una Enzima como catalizador, aumenta la velocidad de la reacción al disminuir la energía libre de activación ( GENZ*), que es la energía necesaria para alcanzar el estado de transición o estado activado [ES]*, y que representa la barrera que debe ser superada para que la reacción tenga lugar. Esa disminución de la energía libre de activación, permite que una mayor concentración de moléculas de sustrato se encuentren en el estado activado, se forme más cantidad de producto por unidad de tiempo y por ende que la reacción se produzca con mayor velocidad. De este modo, las reacciones biológicas, algunas de las cuales podrían demorar miles de años en transcurrir en ausencia de enzimas, ocurren en segundos o fracciones de éstos. La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura, como algunas proteínas, mientras que otras necesitan además de otros componentes no proteicos, los cuales pueden ser inorgánicos (Mg 2+, a 2+, l -, etc), denominados: FATRES; u orgánicos recibiendo en este último caso el nombre de ENZIMAS (NAD +, FAD); algunas enzimas necesitan de ambos. Las enzimas catalizan reacciones específicas y en determinadas condiciones de p y temperatura la velocidad de la reacción es óptima. Fuera de esas condiciones óptimas la velocidad de reacción disminuye. Km es la constante de Michaelis-Menten y su valor es característico para cada enzima dado que se encuentra asociada con la interacción del sustrato con la enzima; es por ello que su valor es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato. A menor Km mayor afinidad de la enzima por el sustrato y viceversa. BJETIVS Analizar las propiedades de las enzimas. Interpretar la importancia de las enzimas en la complejidad de las reacciones biológicas Adquirir destreza en la resolución de situaciones problemáticas que se plantean en el estudio de la Química Biológica. Valorar el trabajo grupal como una manera de construcción del conocimiento. GUÍA DE RBLEMAS 1- La reacción S posee un G negativo a) Qué significado tiene el G < 0? Realice un gráfico de energía libre en función del transcurso de la reacción. Si esta reacción ocurre en presencia de un catalizador: b) Qué pasará con el G? c) Qué ocurrirá con la energía del estado de transición y el G*? d) ómo se modificarán las velocidades de la reacción de ida y vuelta? 2- La siguiente reacción: AT + Glucosa AD + Glucosa 6- puede ser catalizada por dos enzimas diferentes: la hexoquinasa II y la glucoquinasa. La glucoquinasa usa como sustrato exclusivamente glucosa, mientras que la hexoquinasa usa además de glucosa otras hexosas tales como fructosa y manosa. 20

3 a) Explique cómo se puede medir la actividad enzimática. b) A concentración de enzima constante se obtuvieron los siguientes datos cinéticos: oncentración de sustrato (Glucosa, mm) Velocidad Glucoquinasa (µmoles de Glucosa 6-/seg.) oncentración de sustrato (Glucosa, mm) Velocidad exoquinasa (µmoles de Glucosa 6-/seg.) ,1 0, , ,5 1, ,5 2, , c) Determine gráficamente el Km para cada enzima d) Defina Km y discuta la relación entre Km y afinidad e) uál de las dos enzimas tiene mayor afinidad por la glucosa? f) uál de las dos enzimas tiene mayor Especificidad por la glucosa? g) Discuta si existe relación entre Afinidad y Especificidad de una enzima 3- a) La siguiente reacción química S ---> puede ser catalizada por tres enzimas diferentes A, B, y. Las enzimas A y también pueden catalizar la siguiente reacción W ---> Z. La concentración de las enzimas A, B y es la misma. 21

4 En base a los gráficos y a los datos presentados aquí determine: b) uál tiene mayor afinidad por el sustrato? or qué? c) uál tiene mayor poder catalítico? or qué? d) uál es la más específica para S? or qué? e) Qué condiciones de p y temperatura elegiría para trabajar experimentalmente con cada una de las enzimas? Justifique por qué a otros valores de p y temperatura diferentes a los que Ud. eligió la enzima pierde actividad. TRABAJ DE LABRATRI omentarios teóricos sobre la experiencia Las caseínas son las proteínas más abundantes de la leche (alrededor del 80%), el resto se denominan proteínas séricas. Existen distintos tipos de caseínas (α, β y κ) y estas pueden asociarse en estructuras cuaternarias complejas. En presencia de iones a 2+ estos complejos forman agregados esféricos heterogéneos en tamaño y composición, denominados micelas. Más del 90% de la caseína de la leche se encuentra en forma micelar, el resto se encuentra como monómeros o pequeños agregados. La digestión enzimática de la proteína caseína la realiza una enzima proteolítica, la renina, presente en el estómago de los mamíferos jóvenes (generalmente se la obtiene del estómago de terneros). Dicha enzima se conoce bajo diversos nombres: renina, quimosina, cuajo o fermentolab. Su rol en la digestión es coagular la leche en el estómago, proceso importante en lactantes. Así la renina convierte a la leche en un queso, permitiendo que se retenga por más tiempo en el tracto digestivo. Si la leche no se coagulara pasaría muy rápido perdiendo la oportunidad de una buena digestión de sus proteínas. La secreción de renina es máxima durante los primeros días después del nacimiento. uando el lactante empieza a cambiar su ingesta de leche por otros alimentos sólidos variados, la concentración de renina comienza a disminuir y aumenta la concentración de otra enzima proteolítica, la pepsina y que puede actuar sobre mayor tipo de proteínas. La reacción por la cual la enzima, renina, actúa sobre su sustrato, la caseína, es la siguiente: ASEÍNA (soluble) ARAASEÍNA (insoluble) + RTESA (soluble) 100% de aa. RENINA 94% de aa. 6% de aa. omo se observa, la renina hidroliza sólo en forma parcial a su sustrato la caseína. Esto se debe a que su efecto hidrolítico es absolutamente específico, hidroliza exclusivamente la unión peptídica formada entre estos aminoácidos: fenilalanina y metionina, no pudiendo hidrolizar otras uniones peptídicas. Debido a esta especificidad tan estricta de la renina, ésta ve restringida su acción hidrolítica a tan solo ese particular enlace peptídico presente en la caseína. La k-caseína es una proteína anfipática que, en presencia de iones a 2+, se mantiene en suspensión; sin embargo luego de la acción hidrolítica de la renina, su producto: la para-kcaseína se separa, formando el queso. or lo tanto, la acción de la renina sobre la caseína ocasiona la coagulación de la leche y dando origen a la separación del queso o cuajo, del suero. Esta acción se emplea en el proceso de fabricación del queso. Es así que la leche, líquida, en su estado físico natural, se coagula por la acción de la enzima renina, al hidrolizar su sustrato, la caseína; dando como productos: la paracaseína, que es uno de los componentes proteicos del queso o cuajada; y la proteosa, que es uno de los componentes del suero. 22

5 La pepsina, en cambio, es otra enzima proteolítica que actúa hidrolizando preferentemente los enlaces peptídicos formados entre un aminoácido aromáticos y cualquier otro aminoácido, por lo que su efecto proteolítico sobre la proteína caseína es mayor que el efecto de la acción de la renina, y además puede hidrolizar a la mayoría de las proteínas. El p óptimo de acción de la renina en su actividad proteolítica es entre 3.8 a 4.0 y el p límite de su actividad es entre 7.3 a 7.5. Mientras que para la pepsina los respectivos p son entre: 1.8 a 2.0 y 6.6 a 6.7. Actividades 1- bservación de la solubilidad de proteínas de la leche a distintos p y su relación con el punto isoeléctrico. 2- Verificación de la acción enzimática de la renina. 3- omprobación de la influencia del p del medio sobre la actividad enzimática de la renina. Materiales Se utilizará como material de estudio: leche. Reactivos Agua destilada. al 2 (loruro de calcio, pro-análisis). Se usará una solución al 12% de cloruro de calcio en ácido clorhídrico 0,1 N. Na (hidróxido de sódio, pro-análisis). Se usará una solución 0,1 N de hidróxido de sodio en agua destilada. l (ácido clorhídrico, pro-análisis). Se usará una solución 0,1 N de ácido clorhídrico en agua destilada. reparación enzimática. Solución de cuajo. Leche fluida de vaca. Equipamiento de laboratorio Baño termostatizado tros materiales de laboratorio Tubos medios de ensayo. Tapones de goma para tubos de ensayo. ipetas. Gradillas para tubos de ensayo. robetas. Matraces. Erlenmeyers. Barillas de vidrio. Espátula. Frascos de vidrio y de plástico. Goteros. Marcadores de tinta permanente. Descripción de la experiencia a- A 200 ml de leche, agregar 8 gotas de 12% al 2 en l 0,1 N. b- olocar en la gradilla 4 tubos, respetando el orden, las cantidades y los tiempos, según se indican en el siguiente cuadro: 23

6 LEE 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml Na ml l - 8 gotas - - RENINA gotas 4 gotas c.- Agitar suavemente todos los tubos. d.- Incubar a 45, en un baño termostatizado, durante 15 minutos. e.- bservar todos los tubos y describirlos. f.- Explique lo sucedido en los tubos 2, 3 y 4. g.- Agregue Na al tubo 2 y explique lo que sucede. h.- Realice un gráfico utilizando una formula general de un aminoácido que explique los cambios de carga en diferentes p y muestre el punto isoeléctrico. ómo se explican estos cambios en una proteína? GUÍA MLEMENTARIA DE RBLEMAS 1- Mencione y explique las propiedades de las enzimas. 2 - Teniendo en cuenta las siguientes reacciones, indique para cada caso que enzima cataliza la misma. a) + NAD + NAD + L-Malato b) 2 xalo-acetato 2 + AT + AD + Glucosa c) N 3 Glucosa Fosfato N N 3 N N N 3N L-Arginina L-rnitina Urea N 2 24

7 d) Fructosa -1,6- difosfato Dihidroacetonafosfato Gliceraldehido-3-fosfato e) D-Glucosa-6-Fosfato f) D-Fructosa-6-Fosfato N 2 3 N N 4 + AT 3 N AD + i + 2 L-Glutamato Amonio L-Glutamina 3- Analice el siguiente gráfico y determine cuál de las dos enzimas tiene mayor afinidad por glucosa. Justifique su respuesta. Enz A ( _ ) Enz B (- - - ) 4- Los datos cinéticos de actividad enzimática y p (Tabla 1), y de actividad enzimática y Temperatura (Tabla 2) se obtuvieron experimentalmente para una determinada reacción enzimática. a) Realice los gráficos de los valores de actividad enzimática en función del p; y de actividad enzimática en función de la Temperatura. b) Indique cuál es el p y la temperatura óptimos para la actividad de esa enzima. c) Analice en cada gráfico en qué condiciones se realizó el experimento, y qué ocurre por debajo y por encima de los respectivos valores óptimos. 25

8 Tabla 1 Tabla 2 Actividad Actividad p enzimática enzimática Temperatura ( ) Una muestra de leche se dejó a temperatura ambiente y al cabo del día se observó que la leche se cortó. Explique si hay alguna relación entre el fenómeno físico observado y cambios en algunas de las estructuras químicas de las proteínas. A qué podría atribuir los cambios observados? Son estos cambios reversibles? ómo lo demostraría? 6- La pepsina y la renina son enzimas proteolíticas (hidrolizan proteínas) y ambas pueden hidrolizar la caseína (proteína abundante en la leche). A una muestra de leche, llevada a p 3, se le agrega renina y se incuba a 37 durante 15 minutos. Explique qué ocurrirá. Y si simultáneamente se le hubiera agregado pepsina? Diga cuál de ellas es más específica en su acción y porqué? 26