ESTUDIOS PARA LA PRODUCCION EN MASA DE PLANTAS DE ELITE DE ALCORNOQUE

Transcripción

1 Proyecto Nº SC ESTUDIOS PARA LA PRODUCCION EN MASA DE PLANTAS DE ELITE DE ALCORNOQUE Equipo Investigador: Cristina Celestino Mur (Dra. C.B.) Mariano Toribio Iglesias, (Dr. C.B.) Bárbara Fernández Guijarro (I.M.) Isabel Martínez García-Serrano (I.T.A.) Gemma García Martín (I.A.) Pedro Vicente Mauri Ablanque (I.A.) Emilio Fernández Galiano (I.A.) Javier Francisco Gallego (Dr. C.B.) Javier Hornero del Castillo (Dr. C.B.) Equivalente de jornada completa: 3,45 Centro de Investigación: Instituto Madrileño de Investigación Agraria y Alimentaria. Madrid. Duración: Coste: Enero Diciembre 1997 Miles de pesetas: Financiación INIA 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Las especies mediterráneas como las del género Quercus y en especial el alcornoque (Q. suber) están consideradas de gran interés en las políticas actuales de Investigación y Desarrollo Tecnológico a nivel de la Comisión Europea. De hecho el alcornoque está mencionado como especie prioritaria en el Programa Marco nº 4, habiéndose establecido una red de conservación de recursos genéticos en el programa EUFORGEN (Quercus suber Network). En las actividades de la Unión Europea se contempla financiación para proyectos que incluyan la biotecnología vegetal en su aplicación forestal, por su importancia tanto a nivel científico como social. El interés del alcornoque se basa en su valor ecológico y en la demanda de su materia prima, el corcho, por ello es necesario desarrollar programas de mejora genética de la especie que contemple aspectos de protección, producción y conservación. El presente proyecto continúa la labor realizada en el proyecto anterior INIA nº 9547, donde se determinaron las herramientas básicas necesarias para acometer un programa de mejora genética de la especie, desarrollándose una técnica de multiplicación vegetativa del material selecccionado como es la embriogénesis somática. La embriogénesis somática nos posibilita por un lado la clonación a gran escala de individuos élite, y por otro la obtención de plantas mediante procesos ontogénicos similares a los naturales (semillas), presentándose por ello menos problemas de estructura y de estabilidad genética respecto de otros sistemas de micropropagación. Los objetivos del presente proyecto se dirigen hacia la optimización del protocolo de micropropagación del alcornoque mediante embriogénesis somática, contemplándose los siguientes apartados: - Inducción inicial. Se evalúa la capacidad de obtención de embriogénesis somática en tejidos embrionarios y no embrionarios, determinándose la influencia del genotipo del explanto inicial, el grado de madurez de la planta donante y el estado de desarrollo del explanto. Se establecerá la influencia del medio de cultivo sobre la capacidad embriogénica del material de partida. - Embriogénesis recurrente. Regulación de la formación de embriogénesis secundaria en función de los macronutrientes del medio de cultivo. Se evalúa la influencia del genotipo sobre la capacidad multiplicativa, autoembrionía. Determinación del procedimiento idóneo para la sincronización de los cultivos y separación de estructuras. Se desarrollará el cultivo en medio líquido. - Maduración, germinación y conversión. Influencia de reguladores del crecimiento como el ABA, agentes osmóticos y macronutrientes del medio de cultivo en el proceso de maduración de los embriones somáticos. Determinación de las condiciones de cultivo para la obtención de embriones de calidad (acumulación de sustancias de reserva y equilibrio en fitoreguladores), que nos proporcione buenos índices de conversión (plantas con crecimiento vigoroso capaces de aclimatarse a las condiciones ex vitro). -Variación somaclonal. Se determinará si existe variación genética entre los propágulos de un mismo clon generados por embriogénesis somática, y si dicha posible variación se induce 2

3 por la técnica y a que nivel del proceso. Se evaluará la influencia del genotipo sobre la aparición de variación somaclonal. Basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han desarrollado diversos marcadores moleculares a nivel de DNA, entre ellos los RAPDs, empleándose con éxito en la detección de variabilidad genética en distintas especies vegetales. - Anatomía e histología de la embriogénesis. Para poder optimizar este protocolo de micropropagación se necesita definir el momento en el que se inicia la formación del embrión somático, así como su patrón de evolución posterior, por sus implicaciones sobre la estabilidad genética del clon. Por ello se determinará el origen histológico (uni o pluricelular) y las características del desarrollo ontogénico de los embriones somáticos, así como la influencia de las condiciones de cultivo sobre dicho desarrollo. RESULTADOS 1. Se ha establecido una serie de líneas embriogénicas obtenidas a partir de la inducción de embriogénesis sobre embrión cigótico procedente de bellotas de polinización abierta de diferentes árboles, y sobre material vegetal adulto (hojas y amentos) de distintos árboles y procedencias. Se ha constatado la influencia del genotipo sobre la característica inducción de embriogénesis somática. 2. La característica recuperación de la capacidad de crecimiento por embriogénesis recurrente de las diferentes líneas embriogénicas almacenadas en condiciones de bajo crecimiento está también influida por el genotipo. 3. Se obtiene un cierto grado de sincronización en la formación de embriones secundarios excindibles de las masas embriogénicas en condiciones de deprivación en nutrientes. Medios con alto contenido osmótico incrementa la poliembrionía en embriones en proliferación. 4. El campo electromagnético generado por los componentes eléctricos de las cámaras de cultivo (fitotrón) puede influir en el crecimiento de los cultivos vegetales. Un campo electromagnético experimental de baja frecuencia (50 Hz, 15 µt) generado mediante un sistema de bobinas Helmhotz, redujo el número de embriones excindibles en uno de los genotipos ensayados. 5. La presencia de ABA y de PEG en el medio de maduración promueve la formación de embriogénesis secundaria en detrimento de la germinación. Los embriones madurados en condiciones de deprivación de nutrientes rindieron aceptables tasas de germinación coordinada, pero se obtuvieron plantas poco vigorosas. Un ciclo adicional de maduración en medios con más alto contenido en macronutrientes incrementó en algun caso el contenido en materia seca., pero previno la germinación. 6. Optimización y estandarización del protocolo para la extracción y amplificación de patrones de RAPDs en embriones somáticos, y hojas de alcornoque. 7. No se ha detectado variación somaclonal con los patrones de RAPDs dentro de cada uno de los 12 genotipos ensayados. Se ha determinado la estabilidad genética en el proceso de embriogénesis recurrente en el genotipo ensayado después de varios ciclos proliferativos. Tampoco se ha detectado variación somaclonal en plantas obtenidas de embrión somático ni en embriones sometidos a cultivo con 2,4-D. 3

4 8. Se ha determinado el origen multicelular de la embriogénesis secundaria a partir de las células de la caliptra y de las células de parénquima del cotiledón En masas proliferativas en degeneración, se muestra un origen unicelular de la embriogénesis recurrente. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES Aportaciones al sector científico La información generada por el proyecto se transfiere al sector científico mediante las publicaciones en revistas científicas, y mediante las comunicaciones orales o presentación de paneles en las diferentes Reuniones, Congresos y Grupos de trabajo en los que se ha participado. Aportaciones a la administración: 1.- Conocimientos técnicos sobre la embriogénesis somática como un sistema de micropropagación vegetativa de material vegetal genéticamente seleccionado. 2.- Protocolo para la clonación de plantas élite de alcornoque mediante embriogénesis somática. 3.-Estandarización del protocolo de extracción y amplificación de marcadores moleculares RAPDs para la detección de posible variación somaclonal a nivel de la fase de embriogénesis recurrente en el alcornoque. 4.- Aplicación de la técnica de RAPDs en estudios sobre variabilidad de esta especie, ya que se ha comprobado el nivel discriminatorio de la técnica al posibilitar el agrupamiento de distintos genotipos en función de sus distancias genéticas. 5.- Mantener el clima de colaboración entre distintos grupos de trabajo internacionales y nacionales. El Dr. M. Toribio es participante en el Grupo de Trabajo 1 Physiology and Control of Plant Propagation in vitro de la Acción Cost 822 de la Unión Europea. La colaboración con el equipo de la Dra. M. Molinas del Laboratori del Suro, Universidad de Gerona, ha posibilitado la caracterización a nivel histológico de procesos morfogénicos en alcornoque. La colaboración con la Dra. M. Picazo del Departamento de Biología Celular y Genética, Universidad de Alcalá, ha posibilitado el estudio de los efectos de campos electromagnéticos sobre diferentes procesos morfogénicos en alcornoque. Aportaciones al sector: La transferencia de resultados al sector viverista ó productor de alcornocal, en el ámbito de la micropropagación mediante embriogénesis somática, aún no es posible ya que no se ha podido optimizar todo el proceso embriogénico. El principal problema a resolver en el alcornoque, como en otras especies arbóreas, es la conversión del embrión somático en plantas viables para un crecimiento activo en condiciones de invernadero. 4

5 Sin embargo las posibilidades de aplicación de la técnica en las metodologías de mejora genética basadas en la clonación de individuos seleccionados es prometedora. Se ha podido obtener embriogénesis somática a partir de material adulto (hojas y amentos tomados directamente del árbol) lo cual es importante al posibilitar la propagación de cualquier genotipo deseado. La gran capacidad proliferativa de algunos genotipos nos permitiría la propagación a gran escala; además al no haberse detectado variación somaclonal inducida por la técnica, nos aseguraría la estabilidad genética del clon siempre y cuando el individuo donante inicial fuera genéticamente uniforme. FORMACIÓN DE PERSONAL Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Bárbara Fernández Guijarro, titulada Embriogénesis somática en Quercus suber L., en la E.T.S. Ingenieros de Montes de la Universidad Politécnica de Madrid. Septiembre, Apto cum laude. PUBLICACIONES Artículos científicos Puigderrajols, P., Fernández-Guijarro, B., Toribio, M., Molinas, M Origin and early development of secondary embryos in Quercus suber L. International Journal of Plant Sciences, Gallego F.J., Martínez, I., Celestino, C., Toribio, M Testing somaclonal variation using RAPDs in Quercus suber L. somatic embryos. International. Journal of Plant Sciences, Gallego F.J., Martínez I A method of improving reliability in RAPDs. BioTechniques, Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Fernández-Guijarro B., Celestino, C., Toribio M. Influencia del genotipo y del grado de desarrollo en la inducción de embriogénesis somática sobre embriones cigóticos de Quercus suber L. IV Congresso Luso-Espanhol de Fisiología Vegetal. Lisboa (Portugal). Octubre, Ed.: Universidad Técnica de Lisboa. Puigderrajols, P., Fernández-Guijarro B., Toribio, M., Molinas, M. Origen meristemático de los embriones somáticos secundarios en Quercus suber. VI Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular. Lleida (España). Octubre, Ed.: S.E.B.C. - Universitat de Lleida. Puigderrajols P., Molinas, M., Fernández-Guijarro, B., Toribio, M. Histology of secondary embryogenesis in Quercus suber. Workshop of the Working Group 1: Physiology and control of plant propagation in vitro. University of Gent (Belgica). Septiembre, Ed.: Unión Europea. Acción COST 822. García, G., Fernández-Galiano, E., Mauri, P.V. Efecto de la aplicación del ABA en el medio de cultivo de embriones somáticos de alcornoque. Propagaçao vegetativa de especies leñosas. Castelo Branco (Portugal)

6 García G., Fernández-Galiano, E., Mauri, P.V. Liquid medium culture of Quercus suber L. somatic embryos. Comparation between solid and liquid culture and among different growing media. IIIth International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. Jerusalem (Israel). Junio, Celestino, C., Fernández-Guijarro, B., Toribio, M. Genetic control on recurrent embryogenesis in cork oak somatic embryos cultured under different conditions. Workshop of the Working Group 1 : Physiology and control of plant propagation in vitro. Cesena (Italia). Septiembre, Ed.: Unión Europea. Acción COST 822. Celestino, C., Picazo, M.L., Toribio, M., Álvarez-Ude, J., Bardasano, J.L. Influencia de campos electromagnéticos sobre distintos procesos morfogénicos en alcornoque (Quercus suber L.). Bioelectromagnetismo y Salud Pública. Universidad de Alcalá de Henares (España). Octubre, Ed.: I.B.A.S.C. Toribio M., Celestino, C., Fernández-Guijarro, B., Gallego, F.J., Martínez, I., Hornero, J., Puigderrajols, P., Molinas, M. Somatic embryogenesis in Quercus. Diversity and Adaptation in Oak Species. Working Party on Genetics of Quercus. University of Pennsylvania (U.S.A.). Octubre, Ed.: I.U.F.R.O. - University of Pennsylvania. Gallego F.J., Martínez, I., Hornero, J., Celestino, C., Toribio, M. Utilización de marcadores moleculares para la detección de variación somaclonal en embriones somáticos de alcornoque. II Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. Barcelona (España). Noviembre, Ed.: S.E.C.I.V.T.V. Toribio, M., Celestino, C., Gallego, F.J., Martínez, I. Inducción de embriogénesis somática en amentos de encina y alcornoque. II Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. Barcelona (España). Noviembre, Ed.: S.E.C.I.V.T.V. Celestino C., Fernández-Guijarro, B., Toribio, M. Influencia del medio de cultivo en la maduración y germinación de embriones somáticos de Quercus suber L. II Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. Barcelona (España). Noviembre, Ed.: S.E.C.I.V.T.V. Puigderrajols P., Toribio, M., Molinas, M. Embriogénesis sobre cotiledones de origen somático en Quercus suber. V Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal. Córdoba (España). Septiembre, Ed.: S.E.F.V. García G., Fernández-Galiano, E., Mauri, P.V Efecto de las distintas concentraciones de sacarosa y ABA en la maduración de embriones somáticos de alcornoque (Quercus suber L.) cultivados en medio líquido. V Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal. Córdoba (España). Septiembre, García G., Fernández-Galiano, E., Mauri, P.V Multiplicación vegetativa de alcornoque mediante embriogénesis somática. I Congreso Forestal Hispano-Luso. Pamplona (España). Junio,