El laboratorio en el diagnóstico de la infección chagásica

Transcripción

1 El laboratorio en el diagnóstico de la infección chagásica Dra. Beatriz Basso Profesora, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Universidad Nacional de Córdoba Jefa del Laboratorio de Parasitología, Coordinación Nacional de Control de Vectores, Córdoba Dr. Edgardo Moretti Profesor, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Jefe de Laboratorio, Coordinación Nacional de Control de Vectores, Córdoba INTRODUCCION La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias en nuestro país y en Latinoamérica. Para su correcto diagnóstico debe interactuar todo el equipo de salud, y evaluar los datos clínicos, de laboratorio y epidemiológicos. Es importante resaltar que el Laboratorio juega un rol fundamental y muchas veces determinante en el diagnóstico de infección. Por ello, es imprescindible conocer dos aspectos cruciales, de acuerdo a los objetivos del estudio: Cuándo realizar un análisis Qué pruebas efectuar En este sentido, se debe tener en cuenta que independientemente de la vía de transmisión del T. cruzi, cuando éste ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que comprenden entre 7 a 15 días, período después del cual recién se pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parásito. De tal manera, como en otras enfermedades infecciosas, en Enfermedad de Chagas existe un 1

2 periodo de ventana, que es indispensable conocer, para evitar la realización de estudios parasitológicos y/o serológicos en un momento inadecuado, con la consecuencia de posibles falsos resultados negativos. Es fundamental tener en cuenta la siguiente premisa: LA MEJOR PRUEBA DE LABORATORIO PIERDE SU UTILIDAD CUANDO SE REALIZA EN EL MOMENTO INADECUADO Luego de este período de ventana, comienza la fase aguda, en donde la suma de las pruebas parasitológicas presentan una sensibilidad superior al 95%, para luego decaer hasta llegar al 50% o menos en el periodo crónico de la enfermedad. A partir de los 30 días aproximadamente, deben implementarse simultáneamente las metodologías serológicas. Desde el final del período agudo y durante todo el curso posterior de la infección, las pruebas serológicas en su conjunto presentan una sensibilidad cercana al 100% (Fig. 1) y crónico Fig. 1: Sensibilidad (S) de los métodos parasitológicos en el período de latencia, agudo 100 Parasitología Serología 50 S Latencia Agudo Crónico Infección 2

3 Estudios parasitologicos: Toma de muestra: En el momento del contagio deben realizarse al menos dos pruebas serológicas para Chagas, a los fines de conocer si el paciente tiene ya una infección previa. Si la misma es negativa, es necesaria una segunda muestra, obtenida respetando el periodo de latencia o ventana desde el inicio de la posible infección. Como se ha mencionado, en el período agudo debe realizarse la búsqueda del parásito mediante métodos parasitológicos, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la disponibilidad de recursos humanos capacitados y equipamiento en cada laboratorio. COMO EN TODA ENFERMEDAD INFECCIOSA, LA DETECCIÓN DEL PARASITO ES EL ÚNICO PARÁMETRO DE CERTEZA DIAGNÓSTICA Las metodologías actualmente recomendadas son: Examen en fresco: es el más simple y consiste en examinar una gota de sangre al microscopio, entre porta y cubreobjetos. Técnica de concentración de Strout: se realiza en sangre obtenida sin anticoagulante. Una vez retraído el coágulo, se centrifuga a bajas revoluciones, se aspira luego el suero y con el sedimento, (hematíes y leucocitos no retenidos por el coágulo y resto de suero) se vuelve a centrifugar a mayor velocidad. El sedimento se observa al microscopio entre porta y cubreobjetos, a 40x; deben realizarse 3 o 4 preparados, no menos de 300 campos/ preparado. En los casos positivos se observan los tripomastigotes con su clásico movimiento, que resulta inconfundible para un observador experimentado. Si se realiza fijación y coloración, lo cual en esta técnica no es indispensable pero puede ser de utilidad para laboratoristas con poca experiencia, se observarán los tripomastigotes con su forma típica, con núcleo central y cinetoplasto subterminal (Fig 2) Para neonatos se puede usar la microtécnica o microstrout, cuya única diferencia es que se realiza con un volumen de sangre menor (aproximadamente 500 ul, en tubos de plástico tipo Eppendorf). En nuestra experiencia esta microtécnica tiene una sensibilidad elevada, similar a la técnica del Strout convencional. 3

4 Fig. 2: Tripomastigotes de sangre periférica coloreados con Giemsa (400 x) La Técnica del tubo capilar descripta por primera vez por Woo (5), en nuestra experiencia no es aconsejable por: a) Puede brindar falsos resultados negativos debido a que: - si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados - el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito si el capilar no se rompe en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero. - Cuando el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observación b) Por razones de Bioseguridad del operador: Esto es crucial, ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc Hemocultivo: método estandarizado en nuestro laboratorio (3 y 4). Es el método de elección por su menor agresividad para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura Brevemente, se siembra sangre heparinizada, recogida en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar 4

5 sangre). Se incuba a 28ºC y se realizan observaciones microscópicas y subcultivos periódicos, desde los 7 y hasta un máximo de 60 días. En nuestra experiencia, la positividad en neonatos infectados o agudos se observa generalmente entre los 7 y los 21 días. En los primeros días pueden observarse masas de amastigotes, que luego se transforman en epimastigotes activamente móviles (Fig 3a). La confirmación de la presencia de masas de amastigotes o epimastigotes se realiza mediante coloración de Giemsa ( se deja secar el preparado e inmediatamente se fija con metanol durante 5 minutos y se colorea con Giemsa 1:10, durante 15 minuto aproximadamente, de acuerdo al tipo de reactivo empleado y se lava suavemente con agua destilada. Dejar secar y observar con aceite de inmersión con objetivo de 100x). (Fig 3b). Fig 3: a) Rosetas de epimastigotes y epimastigotes libres en un hemocultivo (contraste de fase, 400x) b) Epimastigotes coloreados con Giensa a b Xenodiagnóstico: se realiza con la aplicación de 4 cajas con 10 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos, luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x, recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega. (Fig 4) Para obtener una mejor sensibilidad, se puede realizar coloración de Giemsa lento (1:10) previa fijación con vapores de formol durante horas a temperatura ambiente o a 28ºC 5

6 (esto se realiza colocando el preparado, dentro de una cápsula de Petri, con un papel absorbente embebido con formol. Luego de la coloración, se enjuaga con agua destilada, se seca y se observa, de la misma forma que las coloraciones precedentemente descriptas.. Si bien el xenodiagnóstico es considerado el método de referencia, fue utilizado en nuestro grupo hasta el desarrollo del hemocultivo, siendo posteriormente reemplazado por éste, por las ventajas que tiene.(ver Tabla1) Fig 4. a) Cajas con ninfas de Triatoma infestans aplicadas en el brazo de un paciente b) Expresión de una ninfa para obtención de materia fecal c) Imagen microscópica (400x) de un xenodiagnóstico positivo a b c PCR: En lo que respecta a los métodos de biología molecular, como la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha significado un extraordinario avance científico, existe acuerdo generalizado de que aún presenta resultados muy controvertidos en el diagnóstico de la infección chagásica, y actualmente no esta validada para su empleo en el diagnóstico clínico. Por el momento, y hasta que se logre su estandarización y posterior validación, la misma sólo es utilizada en el ámbito de laboratorios de investigación. En la Tabla 1 se resumen las Ventajas y Desventajas de las pruebas parasitologicas en el diagnóstico de Enfermedad de Chagas 6

7 Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico Strout, Microstrout Hemocultivo Xenodiagnóstico PCR Ventajas Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo Elevada sensibilidad Certeza diagnóstica Facilidad en la obtención de la muestra Mediano costo Gold standard Elevada Sensibilidad Desventajas Sensibilidad operador dependiente Requiere experiencia del operador Contaminaciones Método cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja Falsos positivos contaminnaciones) Falsos negativos inhibición.biológica) Infraestructura compleja Costos elevados Aún No Validada En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: examen en fresco, Strout o microstrout y Hemocultivo empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar el diagnóstico de certeza, en cerca del 100 % de los casos durante el período agudo y en la infección congénita. 7

8 Estudios Inmunoserologicos La serología es una disciplina basada en la detección de anticuerpos específicos contra un determinado microorganismo, en este caso el Trypanosoma cruzi. Debería llamarse con mayor propiedad Inmunodiagnóstico, ya que serología es un término antigüo que alude a la utilización de suero como material biológico en el cual se realiza el estudio. De todos modos, ambos términos se consideran sinónimos. El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de probabilidad. Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente el método a emplear, el momento de la toma de muestra y, asimismo, interpretar adecuadamente los resultados. Existen algunos mitos que consideramos deben ser descartados. El primer mito, es que la serología resuelve todos los problemas diagnósticos. Nada más alejado de la realidad, que cualquier lector de las bases elementales de la inmunología no puede desconocer. A diferencia de lo que ocurre en Química Clínica, en Serología se buscan sustancias (anticuerpos o eventualmente antígenos) normalmente ausentes, por lo cual un resultado se expresa como Positivo o Negativo (Todo o nada), lo cual merece una interpretación diferente. Por otro lado, los informes no se expresan en unidades concretas sino relativas ( título ) y, asimismo, se establece un valor de corte arbitrario que puede no ser el mismo para distintas regiones geográficas, por la presencia en alguna de ellas de otros parásitos que puedan interferir en el diagnóstico, dando reacciones cruzadas. Por estas razones, y otras cuya descripción escapa al objetivo de este capítulo: La serología debe interpretarse siempre en términos de probabilidad y en el contexto de la epidemiología y la clínica. 8

9 Métodos serológicos Los métodos actualmente validados son: ELISA (Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay) Fig 4a Inmunofluorescencia (IF) Fig 4b Hemaglutinación indirecta (HAI) Fig 4c Fig 4. Fotografías de las reacciones de ELISA, Inmunofluorescencia y Hemaglutinación a b c La técnica para estos métodos se detalla en los insertos del fabricante. A continuación se explica brevemente cada una de ellas: a) La reacción de ELISA consiste en pegar antígenos solubles del Trypanosoma cruzi (totales o recombinantes) en placas de poliestireno. Sobre cada uno de los reservorios de la placa se coloca suero de pacientes que, si tienen anticuerpos se unen a los antígenos del Tripanosoma. Luego de lavar para eliminar proteínas séricas no involucradas en la unión antígeno-anticuerpo, se agrega un reactivo constituído por anticuerpo anti inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (usualmente peroxidasa o fosfatasa alcalina). Después de un período de incubación y nuevos lavados, se agrega un sustrato de la enzima que, si en la fase sólida se encuentra el doble complejo antígeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos. Para la medición de esta intensidad de color es necesario contar con en espectrofotómetro de lectura vertical. Eventualmente, en laboratorios de baja complejidad se puede efectuar la lectura visual. En la Fig 4 a se pueden observar las reacciones positivas color amarillo y las negativas incoloras. 9

10 b) El método de inmunofluorescencia tiene un fundamento similar, con algunas diferencias importantes. La primera es que el antígeno es particulado (el parásito entero fijado con formaldehído o glutaraldehído). La segunda diferencia radica en que el segundo anticuerpo está marcado con una sustancia fluorescente, ususalmente isotiocianato de fluoresceína y, por último, la lectura se realiza en un microscopio equipado con luz UV. Actualmente existen técnicas combinadas, donde la señal fluorescente puede leerse en un aparato y de esa forma evitar la subjetividad del operador c) La Hemaglutinación indirecta se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse sobre la superficie de glóbulos rojos de carnero o de ave modificada químicamente y actuar como soporte del antígeno. Si en el suero del paciente existen anticuerpos contra los antígenos del parásito, los glóbulos rojos se aglutinan No existen actualmente otras pruebas validadas para diagnóstico de infección chagásica. Un método que fue de gran utilidad durante muchos años, como la Fijación de Complemento (Guerreiro-Machado) ha dejado de utilizarse por razones operativas, entre ellas la dificultad para conseguir los reactivos y su estandarización. Otras técnica como la aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con antígeno de T. cruzi es desaconsejada por su baja confiabilidad (sensibilidad, especificidad y reproductividad). Por último, reacciones como la Inmunocromatografía, que pueden ser muy útiles por la posibilidad de utilizarlas como métodos de screening rápidos en terreno, no están aún disponibles en el mercado en nuestro país. Parámetros para determinar la confiabilidad de un método: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP). S: capacidad de un método de dar resultado positivo en presencia de infección E: capacidad de un método de dar resultado negativo en ausencia de infección VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-) Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor). (Stites, D; Abbas T., 2007) 10

11 Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Tripanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos serológicos diferentes (ELISA + HAI, ELISA + IF o HAI + IF) Existe una difundida creencia acerca de que la IF es el método de referencia. Ello no es así. Sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras. Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad., permite procesar elevado número de muestras y, además, es la que mejores resultados permite obtener en muestras de sangre entera (sangre con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos biológicos como el trasudado mucoso oral (Basso y col, 1987; Moretti y col, 2004) La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras. EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS SEROLOGICAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL Teniendo en cuenta La posibilidad de reacciones cruzadas con otros parásitos, la realización de dos o más pruebas serológicas no garantiza que el resultado obtenido sea unívoco. Por ello, pueden presentarse situaciones que es necesario conocer y resolver: 11

12 Primer dilema Resultados discordantes Se llama discordancia serológica cuando en un mismo paciente dos pruebas dan distinto resultado Es una situación frecuente en pacientes tratados y en embarazadas Resultado posible en un agudo Ejemplos de resultados y su interpretación ELISA HAI Interpretación Positivo Negativo Discordante Discordante Qué hacer ante un resultado discordante? El Bioquímico Repetir el estudio con la misma muestra Realizar una tercera reacción Solicitar nueva muestra, en lo posible luego de un mínimo de 30 días El Médico NO CONSIDERAR COMO INFECTADO SI AL MENOS DOS METODOS NO DAN RESULTADO + Aceptar y explicarle al paciente que los métodos de laboratorio tienen alcances y limitaciones y que deben valorarse en el contexto clínico y epidemiológico 12

13 Otra situación que suele presentarse en métodos con lectura espectrofotométrica, como es el caso de ELISA, es que los valores de Densidad Optica (DO) se sitúen muy cerca del valor de corte ( ±10% ), en cuyo caso el resultado no debe considerarse positivo ni negativo, sino indeterminado Segundo dilema Resultados indeterminados: Cuando en una reacción con lectura espectrofotométrica se obtiene una densidad óptica dentro de la denominada zona gris ( ± 10% del nivel de corte del kit utilizado) Ejemplo: Nivel de Corte: DO 200 Zona gris : Qué hacer con un resultado indeterminado? Seguir el mismo criterio que para las Discordantes No debe considerarse Positivo o Negativo Objetivos de las pruebas inmunoserológicas Para la interpretación de los resultados es fundamental conocer el objetivo de las pruebas, que pueden ser varios (diagnóstico, control de tratamiento, selección de dadores de sangre, etc). Simplificando, desde un punto de vista epidemiológico y clínico la serología se puede utilizar para: Screening Confirmación diagnóstica 13

14 Para el primer caso se necesita una elevada sensibilidad, mientras que la confirmación requiere alta especificidad. En nuestra experiencia en estudios epidemiológicos la reacción de ELISA es la más adecuada si se realiza una sola técnica, (no recomendado según las pautas que establecen la realización de dos técnicas) ya que presenta una sensibilidad muy elevada. Para la confirmación, como se ha dicho más arriba, es imprescindible la positividad de al menos dos métodos. Como se puede deducir de la figura 1 (Pag 2), durante el período de latencia o ventana, que dura desde el momento de la infección hasta aproximadamente días, no existe ninguna prueba que deba realizarse, ya que seguramente se obtendrán resultados falsos negativos. Solamente se puede efectuar serología a los fines de conocer si existía infección anterior. Resumen: En el período agudo, hasta aproximadamente los 30 días, son de elección las pruebas parasitológicas, que tienen una muy elevada sensibilidad, mientras que en el período indeterminado o crónico los parásitos circulantes son escasos y difícilmente detectables, por lo cual deben utilizarse las pruebas serológicas. Diagnóstico de la infección congénita o del primer año de vida. (ver capítulo Enfermedad de Chagas congénita, Moya y col) Existen situaciones que requieren un tratamiento especial, como la infección congénita. Nuestro grupo de trabajo desarrolló un algoritmo diagnóstico que permite la identificación de los hijos de madres chagásicas que se infectaron durante el embarazo (Moretti y col, 2007; Moya y col, 1985; 1989; 1997; 2005) Es muy importante tener en cuenta que la incidencia de transmisión congénita es de 2 a 8% según la mayoría de los autores. En nuestro grupo alcanza al 2,4 %. Ello tiene un doble 14

15 significado. Por un lado, es imprescindible el tratamiento de los niños que nacen infectados, pues ello permite una curación definitiva. Por el otro, se debe evitar el tratamiento innecesario en los hijos de madres chagásicas no infectados, ya que las drogas utilizadas no están exentas de efectos secundarios ( Moya y col, 1985; 1997 ) Según el Consenso de Cochabamba ( Carlier y col, 2003), se define infección congénita cuando a) el niño nace de una madre serológicamente positiva (y ocasionalmente parasitológicamente positiva ) ( Moretti y col, 2005). b) Se encuentran parásitos en sangre de cordón o sangre del neonato al nacer o durante los primeros meses, siempre que no haya recibido transfusiones o viva en zona con transmisión vectorial activa c) Se detecten anticuerpos contra el Tripanosoma cruzi cuando hayan desaparecido los anticuerpos maternos de circulación, lo cual actualmente se acepta que ocurre entre los 9 y 12 meses de vida. La detección del parásito asegura el diagnóstico, mientras que la detección de anticuerpos sufre la interferencia de los anticuerpos maternos. Como la detección de IgM no ha demostrado ser eficaz para el diagnóstico de infección chagásica, es necesario recurrir a las curvas serológicas, que miden los niveles de IgG sérica del hijo de madre chagásica. Es importante destacar que el recién nacido hijo de madre chagásica siempre es serológicamente positivo, independientemente de si está infectado o no. La única excepción es que la madre tenga niveles de anticuerpos muy bajos, en el límite de sensibilidad de las técnicas empleadas y, debido a las oscilaciones propias del método, la pruebas en el niño caigan debajo de ese límite. Esto es claramente una excepción, al contrario de lo expresado por algunos autores, y en nuestra experiencia prácticamente no lo observamos. 15

16 Existen básicamente dos tipos de curvas serológicas, como se muestra en la Fig. 2, según el niño nazca infectado, en cuyo caso mantendrá o incrementará sus niveles de anticuerpos durante el primer año de vida, o que por el contrario su positividad se deba a la presencia de anticuerpos maternos. En este último caso, los títulos de anticuerpos caerán hasta negativizarse, siguiendo el catabolismo de la IgG materna. La negativización puede ocurrir entre los 6 y 12 meses de vida. (Fig 5) Título Meses Fig 5: Ejemplo de curvas serológicas en neonatos con infección congénita ( pasaje placentario de anticuerpos maternos ( ) ) o con Es muy importante tener en cuenta que un porcentaje bajo de madres chagásicas transmite la infección, entre un 3 y un 5% según la mayoría de los autores, por lo cual la gran mayoría de los hijos de madres chagásicas presentarán una curva descendente. A los fines académicos y epidemiológicos, se puede distinguir si la infección de un niño durante el primer año de vida se debe a transmisión materna o por otra vía (vectorial, transfusional), de acuerdo al siguiente esquema (Moya y Moretti, 1997) 16

17 Diagnóstico de la infección chagásica por el laboratorio durante el primer año de vida en hijos de madres chagásicas Grupo Parasitología Serología Interpretación RN * 1er año RN 3-6 m 9-12 m Diagnóstica Infección congénita Infección de origen no confirmado* (Vectorial?, transfusional?, digestiva?) Infección de origen no confirmado* / Ausencia de infección * El diagnóstico parasitológico puede realizarse en el momento del nacimiento, o durante el primer año de vida. Para confirmar infección congénita debe detectarse el parásito y descartar cualquier otra posible vía de infección Desde el punto de vista terapéutico, cualquiera sea la vía de infección, el tratamiento es efectivo mientras más temprano se realice, en nuestra experiencia antes de los tres años de vida, por lo cual es importante realizar el diagnóstico lo más precozmente posible Actualmente, existe una Ley Nacional ( No.26281) que obliga a la investigación de infección chagásica en toda mujer embarazada. (ARTICULO 4º - Es obligatoria la realización y la notificación de las pruebas diagnosticas establecidas según Normas Técnicas del Ministerio de Salud, en toda mujer embarazada, en los recién nacidos, hijos de madres infectadas, hasta el primer año de vida y en el resto de los hijos, menores de CATORCE (14) años de las mismas madres) Para la implementación de esta ley se deben seguir los siguientes pasos: 1- Detección de la gestante chagásica: se debe realizar el control serológico a todas las embarazadas con por lo menos dos reacciones serológicas normatizadas, HAI, ELISA y/o IF (de acuerdo a la disponibilidad de cada centro). 17

18 2- Se deben estudiar todos los hijos de madre chagásica de acuerdo al algoritmo establecido y que se muestra más abajo a) Serología: HAI y ELISA o IF (HAI y IF tituladas), al momento del nacimiento y durante el primer año de vida b) Parasitología: Nuestro grupo recomienda el micro Strout 3- Si el examen parasitológico es positivo, se debe iniciar inmediatamente el tratamiento. De lo contrario, deberán realizarse controles mediante serología titulada, durante el 1º año de vida, opcionalmente y de acuerdo a la necesidad clínica, entre los 3-6 meses de vida y fundamentalmente al año de vida. 4- Todos los niños que no hayan sido estudiados para Chagas, al cumplir el primer año de vida, se les deberá realizar serología convencional en los centros de salud respectivos. Esto será posible cuando asistan para ser inmunizados con la vacuna triple viral, (algunas jurisdicciones superan el 80% de cobertura en este grupo etáreo). Se deberá tener en cuenta que debido a la transferencia pasiva de anticuerpos de tipo IgG de la madre al niño, antes de los 9-12 meses de edad, es necesario demostrar la presencia del parásito para realizar el diagnóstico de infección. Después de los 12 meses la reactividad serológica confirma la infección. Todos los niños con infección confirmada serán tratados de acuerdo a las Normas Nacionales de Atención al Infectado Chagásico. EL DIAGNOSTICO DE INFECCION CONGENITA SE REALIZA POR METODOS PARASITOLOGICOS A PARTIR DEL NACIMIENTO Y DURANTE LOS PRIMEROS MESES DE VIDA Y POR METODOS SEROLOGICOS A PARTIR DE LOS 9-12 MESES 18

19 Algoritmo para el diagnóstico y el tratamiento del hijo de madre chagásica durante el primer año de vida RN 3-6 meses 9 12 meses ( Opcional) Parasitología Serología + + Tratamiento + Seguimiento + + Tratamiento + Tratamiento Fin del estudio + Seguimiento + + Tratamiento + Tratamiento Fin del estudio 19

20 Perspectivas de nuevas metodologías El material antigénico que se emplea en los métodos serológicos convencionales es, o el parásito completo (IF) fijado o componentes solubles crudos del parásito obtenidos por diferentes procedimientos (ELISA, HAI). Se han utilizado asimismo fracciones antigénicas semipurificadas (Cervetta y col, 1988; Moretti y col, 1998), fundamentalmente para tratar de encontrar marcadores de eficacia terapéutica o indicadores pronósticos. Más recientemente se están utilizando antígenos recombinantes o péptidos sintéticos (Silveira y col, 2001; Girones y col, 2001). De hecho, ya se encuentran disponibles en el mercado kits diagnósticos preparados con antígenos recombinantes. La idea original de utilizar un antígeno o un péptido para optimizar la especificidad no proporcionó los resultados esperados, por lo cual actualmente se utilizan mezclas de recombinantes, que incrementan la sensibilidad sin resentir la especificidad. Se ha preconizado el empleo de métodos con antígenos totales en las reacciones de screenning y metodología recombinante para la confirmación, aunque esta estrategia todavía no está protocolizada. Respecto a nuevos métodos, algunos autores preconizan la inmunocromatografía (Luquetti y col, 2003), método simple que puede realizarse con sangre entera y requiere pocos minutos y entrenamiento mínimo del personal. Su ventaja esencial es que permite ser realizada en terreno, detectar los positivos y allí mismo tomarles muestra de suero, que siempre es el material biológico para confirmación diagnóstica, evitando nuevos viajes y la toma de segundas muestras. En nuestro país aún no está disponible en el mercado. Materiales biológicos Por definición, el material biológico de elección es el suero. Sin embargo, en el trabajo de campo requiere un instrumental no siempre disponible, por lo cual son de elección los métodos que utilizan sangre capilar. En este sentido, en Brasil se utiliza sangre recolectada en papel de filtro y en Argentina el Ministerio de Salud distribuye equipos que contienen frascos con glicerina como conservante (Serokits). En nuestra experiencia, el screening utilizando ambos materiales brinda resultados similares (Basso y col, 1987). En nuestro laboratorio, se ha estudiado la performance del Trasudado mucoso oral como material biológico (Moretti y col, 2004). Este material se obtiene con un dispositivo sencillo, que consta de una almohadilla embebida en una solución hipertónica que se coloca 2 minutos entre la encía y la mejilla. El material que se obtiene es un trasudado, cuya concentración de inmunoglobulinas permite realizar serología, principalmente empleando la técnica de ELISA, con sensibilidad similar a la obtenida con suero o sangre conservada en papel de filtro o glicerina. La gran ventaja es que se trata de un método no invasivo, de gran aceptación entre los niños y que mejora las condiciones de bioseguridad en terreno, al no manipular sangre ni elementos punzantes. Este dispositivo no está aún disponible en el mercado en nuestro país, por lo cual no se puede utilizar a gran escala. 20

21 Para screenings puede emplearse sangre entera recolectada en papel de filtro o glicerina, así como Trasudado mucoso oral LA CONFIRMACIÓN DIAGNOSTICA DEBE REALIZARSE UNICAMENTE EN SUERO Y CON DOS MÉTODOS SEROLÓGICOS En resumen, es importante destacar que las pruebas serológicas para infección chagásica pueden realizarse en laboratorios de baja o mediana complejidad y que el diagnóstico precoz es esencial para la prevención de la patología. Se debe remarcar que sólo es necesario conocer el momento indicado para realizar el estudio, las pruebas a realizar, que deben estar sometidas a estrictos controles de calidad, y su interpretación, que debe ser interdisciplinaria y tener en cuenta el contexto clínico-epidemiológico CONCLUSION El diagnóstico de la infección chagásica está protocolizado, no requiere equipamiento sofisticado y su correcta realización e interpretación es de invalorable utilidad clínica y epidemiológica. Un diagnóstico correcto y oportuno en el paciente con infección aguda o congénita, o durante los primeros años de vida, permite el tratamiento etiológico con alta eficacia terapéutica y, en el paciente crónico, su seguimiento evolutivo. De esta forma, se ayuda a mejorar la calidad de vida del elevado número de personas infectadas o en riesgo de infección en los países del área endémica, y asimismo en regiones tradicionalmente no endémicas y en las cuales la infección chagásica es un problema de salud emergente, como consecuencia de las migraciones y la transmisión interhumana 21

22 BIBLIOGRAFÍA Basso B. y Moretti E. Detección del Trypanosoma cruzi por hemocultivo en pacientes con Enfermedad de Chagas crónica. Medicina (Buenos Aires) 44: l984 Basso B., Moretti E., Vera C., Fontenla S. y Gonzalez G. Detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en muestras de sangre conservadas sobre soportes plásticos. Acta Bioq. Clin. Latinoamer. 21: l987 Carlier Y, Dias JCP, Luquetti AO, Hontebeyrie M, Torrico F, Truyens C. Trypanosomiase américaine ou Maladie de Chagas. In: Editions scientifiques et médicales Elsevier SAS, editor. Encycl. Méd. Chir. Paris : 2002: 21p. Carlier Y, Torrico F., Basso B, Moretti E et al. Congenital infección with Trypanosoma cruzi: from mechanisms of transmission to strategies for diagnosis and control. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36: Cervetta, L., Basso B, Castro I, Santamarina N, Moretti E. Enfermedad de Chagas: Reactividad serológica hacia antígenos crudos y semipurificados del Trypanosoma cruzi en distintos grupos clínicos de pacientes. Medicina 54: Fontenla S., Moretti E., Basso B. y Gonzalez G. Estudio de la confiabilidad de dos técnicas para el inmunodiagnóstico de la Enfermedad de Chagas. Acta Bioq. Clin. Latinoamer. l8: l988. Girones N, Rodriguez CL, Basso B, Bellon JM, Resino S, Muñoz-Fernandez MA, Gea S, Moretti E, Fresno M. Antibodies to an epitope from the cha human autoantigen are markers of Chagas disease. Clin Diagnosis Lab. Immunol. 8: Luqueti, A., Ponce, C., Ponce, E., Estefandiari, J., Schijman, A., Revollo, S., Añez, N., Zingales, B., Aldao, R., Gonzales, A., Levin, M., Umesawa, E., Silveira, J Chagas disease diagnosis: A multicentric evaluation of Chagas Stat-Pak, a rapid immunocrhromatographic assay with recombinant proteins of Trypanosoma cruzi, Diagnostic Microbiology and infectious Disease, 45, 1-7. Manual para la atención del paciente infectado con Tripanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la Nación Moretti E, Basso B, Gil P, Vaca B, Jackeline J. Detección de anticuerpos para Chagas y toxoplasmosis en trasudado mucoso oral. Acta Bioq. Clin. Latinoamericana 2004;38: Moretti E, Basso B, Moya PR. Enfermedad de Chagas congenita: Avances y perspectivas. La Enfermedad de Chagas a la puerta de los 100 años del conocimiento de una endemia 22

23 americana ancestral. Editorial Organización Panamericana de la Salud Pag Moretti E, Cervetta L, Basso B. Enfermedad de Chagas crónica: Efectos del tratamiento en los niveles de anticuerpos hacia antígenos crudos y semipurificados de Trypanosoma cruzi. Boletin Chileno de Parasitología. 53: Moretti E., Basso B, Castro I y col. Chagas disease: study of congenital transmission in cases of acute maternal infection. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 38: Moretti E., Basso B., Cervetta L., Brigada A & Barbieri G. Patterns of cytokines and soluble cellular receptors in the serum of children with acute Chagas disease. Clin Diag Lab. Immunol. 9: Moya P. y Moretti E. Doenca de Chagas congénita. En Clinica e Terapéutica da Doenca de Chapas. Pinto Dias JC e Rodrigues Coura J. Editora Fiocruz Moya P, Basso B y Moretti E. Enfermedad de Chagas congénita: Aspectos epidemiológicos, clínicos, diagnósticos y terapéuticos. Experiencia de 30 años de seguimiento. Rev. Soc. Bras. Med. Trop Vol. 38. Suplemento II; Moya P., Moretti E., Paolasso R., Basso B., Blanco S. y Sanmartino C. Enfermedad de Chagas neonatal. Diagnostico de Laboratorio durante el primer año de vida. Medicina (Buenos Aires) 49: l989 Moya P., Paolasso R., Blanco S., Lapacet M., Sanmartino C., Basso B., Moretti E. y Cura D. Enfermedad de Chagas: Resultados terapeuticos en niños en los primeros meses de vida. Medicina (Buenos Aires) 45: l985 OPS; Mundo Sano. La Enfermedad de Chagas. A la puerta de los 100 años de una endemia americana ancestral.ops/cd/ documentos/unitarias/interior%20libro.pdf Paolasso R. y Basso B. Hemocultivos en la Enfermedad de Chagas-Mazza neonatal. Prensa Medica Argentina 66: l979. Silveira JF, Umezawa ES, Luquetti AO. Chagas disease: recombinant Trypanosoma cruzi antigens for serological diagnosis. Trends parasitol : Stites D; Abbas T. Inmunología básica y Clínica. El Manual Moderno Tarditti A, Gil P, Basso B, Moretti E. Evaluacion de métodos serologicos para diagnóstico de infección chagasica. Presencia Bioquímica Woo P.T. The haematocrito centrifuge technique for the detection of trypanosomes in blood. Can. J. Zool. 47: