Prevalencia de bacteriosis en plantulas de Capsicum annuum L. en invernaderos de Venezuela y su manejo con extracto etanólico de orégano silvestre

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1 Prevalencia de bacteriosis en plantulas de Capsicum annuum L. en invernaderos de Venezuela y su manejo con extracto etanólico de orégano silvestre J. Montilla 1, K. Ramos 2 Y. Jiménez,Y. Escalona y M. Sanabria. 1 Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Estado Lara, Venezuela. jmontilla@ucla.edu.ve 2 karliannyramos@hotmail.com. Resumen El pimiento ocupa el tercer lugar en importancia entre las hortalizas de mayor producción en Venezuela. En el estado Lara se produce la mayoría de plántulas para ser trasplantadas a casas de cultivo de todo el territorio nacional. En los últimos años se han incrementado las enfermedades de importancia epidemiológica. Este trabajo se llevó a cabo con el objetivo de diagnosticar las enfermedades bacterianas en plántulas de pimiento en casas de cultivo y buscar una alternativa ecológica para su control, mediante utilización de extracto etanólico (EE) de orégano silvestre (Limpia origanoides K.). Se analizaron muestras de plántulas con síntomas de bacteriosis y se determinó la prevalencia de estas enfermedades en los sectores Campo Lindo, Rincón de Guardia, Negrete y Tintorero, durante el periodo Octubre 2011 Marzo Las muestras fueron procesadas en el laboratorio de Bacteriología del Postgrado de Agronomía UCLA; las colonias bacterianas obtenidas fueron identificadas a través de pruebas fisiológicas y bioquímicas. La capacidad inhibitoria del EE de orégano fue probado contra las principales bacterias colectadas, evaluándose concentraciones de 6 y 10% sobre su crecimiento, en comparación con Kasugamicina al 1,5%. Los resultados obtenidos mostraron que un total de 14 casas de cultivos evaluadas presentaron síntomas bacterianos, representando el 73,68% de prevalencia de enfermedades bacterianas, donde se determinó la presencia de los géneros Xanthomonas sp., Pseudomonas sp., Erwinia sp., Burkholderia sp., Pantoea sp. Y Agrobacterium sp. En cuanto al efecto del EE sobre el crecimiento bacteriano, se observó que la concentración de mayor capacidad inhibitoria para todas las bacterias fue de EE al 6% de orégano, superando inclusive al tratamiento donde se aplicó Kasugamicina, lo cual representa un potencial como alternativa menos contaminante para el control de estos patógenos, previa su determinación de posibles efectos colaterales sobre los enemigos naturales y salud de los agricultores y consumidores finales de estas hortalizas. Palabras clave: Bacteriosis, Xanthomonas, manejo ecológico INTRODUCCIÓN El cultivo del pimiento ocupa el tercer lugar en importancia entre las hortalizas de mayor producción en Venezuela. Desde hace algunos años los agricultores de la localidad de Quibor estado Lara, producen plántulas de pimiento bajo estructuras protegidas, las cuales son comercializadas a productores de la región y otras zonas del país. El pimiento se ve afectado por diversas enfermedades de importancia epidemiológica, entre ellas las bacteriosis, las cuales pueden causar pérdidas económicas importantes a los productores (Guzmán, 2007). 175

2 En la mayoría de los casos, se hace uso indiscriminado de productos químicos para manejar problemas fitopatológicos y de plagas, los cuales afectan el ambiente y la salud pública (Ramachandra et al., 2003; Tagliaferro, 2002). Además se ha demostrado que su eficacia puede ser de corta duración y por ello algunas plagas y patógenos pueden hacerse resistentes a estos, tal es el caso de los antibióticos sulfato de estreptomicina y clorhidrato de oxitetraciclina con uso agrícola muy restringido (López et al., 2005). Ante esta problemática se realizó el presente estudio con la finalidad de identificar los principales problemas bacterianos, sus agentes causales y evaluar productos naturales como el extracto etanólico de orégano silvestre (Limpia origanoides K.) para el control de bacteriosis, lo que disminuiría el uso de antibióticos y fungicidas químicos con acción bacteriostática e iría en pro de la búsqueda de una alternativa de control más ecológica y económicamente rentable. MATERIALES Y METODOS Las casas de cultivos seleccionadas para los muestreos, fueron aquellas ubicadas en el municipio Jiménez del estado Lara, las cuales en el periodo comprendido entre octubre 2011 marzo 2012, estaban produciendo plántulas de pimentón. Se procedió a describir síntomas característicos de bacteriosis según Agrios (2005) y Llácer et al. (2000), como: marchitez, pudrición blanda y manchas foliares. Se determinó el porcentaje de unidades de producción muestreadas, en donde se observaron síntomas característicos de bacteriosis, para determinar la prevalencia, siguiendo la metodología de Campbell y Madden (1990).Muestras de plántulas sintomáticas fueron analizadas en el laboratorio de Bacteriología del Postgrado de Agronomía- UCLA, de las cuales se obtuvieron colonias bacterianas en 48 horas. Las bacterias aisladas fueron identificadas mediante pruebas presuntivas (Tinción rojo congo e Hidróxido de Potasio al 3%), fisiológicas y bioquímicas, siguiendo la metodología de Shaad (2001). Para la obtención del EE se utilizó la metodología de Marcano y Hasegawa (2002). Para ello las hojas se secaron bajo sombra, aproximadamente por 7 días, posteriormente, se molieron en una licuadora Oster MR, el polvo resultante fue colocado en maceración, en un frasco de vidrio de 4 litros, se le adicionó etanol (96%), a una relación de 2,5 litros en 500 g de materia seca, posteriormente el envase fue sellado y cubierto con una bolsa negra, para evitar la incidencia de la luz sobre el macerado. Transcurridos 7 días, se filtró el líquido a través de gasa, transfiriéndolo a un balón de destilación y con la ayuda de un Rotavaporador Brinkmann, se separó el etanol del macerado obteniéndose así el EE puro, el cual se envasó en una botella esterilizada de color ámbar hasta su utilización. Con el fin de evaluar el efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano a nivel in vitro de EE de orégano silvestre (L. origanoides) sobre las principales bacterias diagnosticadas, se evaluaron concentraciones de 6 y 10% del EE, un testigo negativo (agua destilada estéril, ADE) y uno positivo (Kasugamicina) a una dosis comercial (1,5%). El ensayo se realizó siguiendo la metodología de Hernández y Trujillo (2009). Se procedió a sembrar las bacterias en placas que contenían medio agar nutritivo, a razón de 100µl ajustado a 10 8 cel/ml. Seguidamente se colocaron discos de papel de filtro estéril de 5mm de diámetro en forma equidistante, a razón de 5 discos/placa de forma aleatoria por cada concentración y se les añadió 10 µl de EE. Se esperó hasta observar crecimiento bacteriano en las placas (24-48h), posteriormente se procedió a medir con un vernier el ancho (cm) del halo de inhibición del crecimiento de cada una de las bacterias evaluadas, 176

3 para cada una de las dosis. Se utilizó un diseño completamente al azar con 16 repeticiones / tratamiento. Los datos fueron analizados con el programa estadístico Statistix 8.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos mostraron que de un total de 19 estructuras evaluadas, en 14 se observaron síntomas bacterianos, representando el 73,68% de prevalencia de enfermedades bacterianas. Los síntomas bacterianos presentes en las diferentes casas de cultivo fueron manchas foliares, marchitez y pudrición basal, los cuales se encontraron en 56,52%, 30,46%, 13,04% respectivamente. Lo que concuerda con los síntomas observados con mayor prevalencia en las estructuras protegidas, tales manchas foliares, marchitez y pudrición basal, tal como lo señala la literatura (Jarvis, W. 1998). A partir de las estructuras que manifestaron síntomas fueron caracterizadas 46 cepas bacterianas, identificándose 6 géneros, siendo Xanthomonas sp., Pseudomonas sp. y Erwinia sp. las principales bacterias diagnosticadas y en menor proporción los géneros Burkholderia sp., Pantoea sp. y Agrobacterium sp.(tabla 1). Tabla 1. Porcentaje de ocurrencia de géneros bacterianos detectados en invernaderos de producción de plántulas de pimiento. Géneros bacterianos Ocurrencia (%) Xanthomonas sp 34,78 Pseudomonas sp 26,09 Erwinia sp 15,22 Burkholderia sp 10,87 Agrobacterium sp 8,70 Pantoea sp 4,35 Los resultados del efecto del EE de orégano silvestre a las concentraciones 0; 6 y 10% y Kasugamicina al 1,5%, se muestran en la tabla 2. El análisis de varianza reveló diferencias altamente significativas (P 0,01) entre los tratamientos y el testigo. Tabla 2. Efecto del extracto etanólico(ee) de orégano silvestre (Limpia origanoides K.) y Kasugamicina 1,5%, sobre el crecimiento in vitro de Xanthomonas sp., Pseudomonas sp. y Erwinia sp. Tratamiento Xanthomonas Pseudomonas Erwinia ADE 0,5025 c 0,5025 c 0,5025 d 6 % EE 1,0211ª 1,0209ª 1,0058ª 10 % EE 0,8569 b 0,8721 b 0,8832 b 1,5 % Kasumin 0,8696 b 0,7874 b 0,7868 c Significancia 0,0000 ** 0,0000 ** 0,0000 ** CV 8,22 11,47 8,79 1. ADE (Testigo con Agua destilada estéril). 2. Letras iguales indican que no hay diferencias estadísticamente significativas entre medias. 3. Los valores del halo de inhibición son promedios de 16 repeticiones por tratamiento. 4.< 0,01 ** ; 0,01 0,05 *; Ns> 0, CV (Coeficiente de variación) 177

4 En el EE de orégano silvestre (Limpia origanoides K.), se determinaron los grupos de MS: alcaloides, aceites esenciales, antroquinonas, fenoles y saponinas. El mayor efecto inhibitorio sobre todas las bacterias evaluadas se presentó con el EE de orégano al 6% tratamiento (T2); superando al Kasumin 1,5% (T4). Mientras que entre los tratamientos T3 y T4, no hubo diferencia significativa, aunque todos superiores a ADE (T1). El efecto inhibitorio puede deberse a la presencia de diferentes grupos de MS, a los cuales se le ha atribuido propiedades contra hongos y bacterias, como estimulante del crecimiento, el desarrollo fisiológico de la planta, activador de los mecanismos de defensa de las plantas frente a plagas y enfermedades como lo señalaron Barguil et al. (2005) y Arciniegas et al. (2002). Bassole et al. (2003), señalaron el efecto inhibitorio del desarrollo de bacterias Gram negativas, que poseen algunas especies de la familia Verbenaceae, a la cual pertenece Limpia origanoides K. lo cual concuerda con el potencial antibacteriano de esta planta observado en este ensayo. CONCLUSIONES En los sectores Campo lindo, Rincón de guardia y Negrete de la parroquia Tintorero del municipio Jiménez, en el estado Lara, los síntomas de manchas foliares, marchitez y pudrición basal, que se encontraron en plántulas de pimentón (C. annuum L.) fueron 56,52%, 30,46%, y 13,04% de prevalencia respectivamente, y se hallaron asociados con los géneros bacterianos Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, Burkholderia, Agrobacterium y Pantoea. Los géneros bacterianos más prevalentes fueron Xanthomonas, Pseudomonas y Erwinia con una ocurrencia de 34,78%, 26,09% y 15,22% respectivamente. El extracto etanólico de orégano silvestre a una concentración de 6%, mostró in vitro, el mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de todas las bacterias evaluadas, en comparación al producto químico Kasumin al 1,5%. Referencias Agrios, G Fitopatología. México. 5 ta Ed. Editorial Limusa. 621pp. Arciniegas, A., Riveros, A. y Loaiza, J Efectos de extractos vegetales sobre el desarrollo in vitro de Mycosphaerela fijensis, agente causal de la sigatoka negra en Musáceas. En: XV Reunión Internacional ACORBAT-AUGURA. Colombia. 242pp. Barguil, B., Resende, M., Resende, R., Evando, J., Bessera, A., Junior, M. and Salgado, S Effect of extracts from citric biomass, rusted coffee leaves and coffee Berry husks on Phoma costarricencis of coffee plants. Fitopatología Brasilera. 30: Bassole, H., Ouattara, A., Nebie, R., Ouattara, C., Kabore, Z. y Traore, S Chemical composition and antibacterial activities of the essential oils of Lippia chevalieri and Lippia multiflora from Burkina Fasu. Phytochemistry. 62: Campbell, C. y Madden, L Introduction to plant disease epidemiology. John Wiley&Sons, Canada. 560 pp. Hernández, Y. y Trujillo, G Extractos etanólicos de Gliricidia sepium, una alternativa de control de bacterias fitopatógenas en plantas ornamentales. Resumen del XXI Congreso Venezolano de Fitopatología. Isla de Margarita. (22)2: 40. Guzmán, J El cultivo del pimentón y el ají. 3ra Edición. Espasande, S.R.L. Caracas. Venezuela. 151 pp. Jarvis, W Control de enfermedades en cultivos de Invernaderos. Ediciones Mundi- Prensa. España. 291pp. López, B. A., López, B. S., Vázquez, B., Rodríguez, H., Mendoza, E. y Padrón, E Inhibición del crecimiento micelial de Fusarium oxisporum Schlechtend F. sp 178

5 lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen, Rhizoctonia solani Kuhn y Verticillium dahliae Kleb. mediante extractos vegetales acuosos. Revista Mexicana de Fitopatología, 23(2): Llácer, G., Bello, A., López, M. y Trapero, A. Patología Vegetal da Ed. Phytoma España. Valencia- España pp. Marcano, D. y Hasegawa, M Fitoquímica Orgánica. Universidad Central de Venezuela. Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico. Caracas Venezuela. Editorial Torino. 588 pp. Ramachandra, T. y Nagarathna, A Ecodegradation biodiversity and health. Current Science, 85 (9-10): Shaad, D Laboratory Guide for identification of Plant Pathogenic Bacteria.The American Phythopatology Society.3era Edc. St. Paul. Minnesota. 34pp. Tagliaferro Z Niveles de Organoclorados en Leche Materna en Población de Caseríos Expuestos y Parcialmente Expuestos a Plaguicidas del Valle de Quíbor. Tesis de Grado de Magister en Salud Pública. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Venezuela. 148pp. 179