Universidad Austral de Chile

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1 Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Veterinarias Instituto de Ciencia Animal COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO, NITRÓGENO LÍQUIDO VS -80 C, UTILIZANDO DILUYENTES HIPOMETABOLIZANTES Memoria de Título Presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO JUAN PABLO PRADO ACUÑA VALDIVIA CHILE 2011

2 PROFESOR PATROCINANTE Dr. Alfredo Ramirez R. PROFESOR COPATROCINANTE Dr. Bruno Carvalho M. PROFESORES INFORMANTES Dr. Sebastián Galecio N. Dr. Marcelo Ratto F. FECHA DE APROBACIÓN: 24 de Noviembre de 2011

3 ÍNDICE Capítulos Página 1. RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS 9 5. RESULTADOS DISCUSIÓN REFERENCIAS ANEXOS AGRADECIMIENTOS.. 30

4 1 1. RESUMEN Considerando las diferencias existentes en las tasas de concepción por el uso de semen equino congelado, en comparación con semen fresco o refrigerado y las grandes variaciones en la respuesta a la congelación que presentan distintos sementales, se están probando nuevos protocolos y diluyentes de congelación de semen equino con el objetivo de disminuir estas diferencias. En el proceso de hibernación, la tolerancia a la hipoxia y la hipotermia son dependientes de la enzima AMPK. Al ser un sensor de energía celular, ésta enzima contribuye en la regulación del balance energético y por lo tanto, se ha propuesto evaluar sus efectos en el proceso de criopreservación de espermatozoides de equino. Se evaluó comparativamente la congelabilidad de semen equino, en respuesta a dos métodos: Nitrógeno Líquido (NL) vs Ultracongelación a -80 C. Los parámetros evaluados consideraron: viabilidad, motilidad e integridad acrosomal espermática. Adicionalmente se evaluó la inclusión de AICAR y AMP (activadores de AMPK) como estrategia farmacológica en ambos métodos para mejorar los parámetros nombrados. En este estudio se usó el diluyente HM-0 (Húsar Mawida) como medio base (refrigeración y congelación) sobre el cual se adicionaron por separado: AICAR, 5 AMP, Compuesto C (inhibidor de AMPK) y AICAR + Compuesto C. Posteriormente, terminada la fase de refrigeración a 5º C, las pajuelas de cada tratamiento fueron criopreservadas a -196 c (NL) y a -80 ºC (ultrafreezer) y mantenidas por dos semanas. Finalmente las pajuelas fueron descongeladas y sometidas a análisis in vitro de viabilidad (tinción de eosina/nigrosina), integridad acrosomal (PSA-FITC) y motilidad mediante análisis espermático asistido por computadora (C.A.S.A.). Los resultados indican que la viabilidad no se ve afectada por los agentes farmacológicos usados, ni por el método de criopreservación. El análisis de la integridad acrosomal mostró que el uso de compuesto C disminuye (P <0,05) el porcentaje de espermatozoides con acrosomas intactos (42,9 ± 6,1) en relación a aquellos tratados con AICAR y AICAR + Compuesto C (61,4 ± 11,3 y 59,9 ± 15, respectivamente). No se observaron diferencias en la motilidad entre los tipos de congelación, pero se hallaron diferencias (P <0,05 y P <0,01) en datos que indican mayor progresividad (ALH a -196 C 1,1 ± 0,9 vs -80 C 2,1 ± 1,3 µm y STR a -196 C 55,6 ±9 vs -80 C 65,3 ± 7,6 %). Los resultados muestran que la criopreservación de espermatozoides equinos a -80º C puede ser una alternativa a la criopreservación en NL, aunque se requieren estudios comparativos con más de dos semanas de almacenamiento. La adición de fármacos activadores de AMPK no incrementa ni deteriora los parámetros de calidad espermática evaluados in vitro (viabilidad, reacción acrosomal y motilidad). Palabras clave: Criopreservación, semen, equino, AMPK.

5 2 2. SUMMARY COMPARISON OF TWO STALLION SEMEN CRYOPRESERVATION METHODS, LIQUID NITROGEN VS -80 C, USING HIPOMETABOLIZANTS EXTENDERS Considering to marked differences in conception rates when using frozen semen and fresh or cooled stallion semen, and the high variability in the response to cryopreservation process between stallions, new freezing protocols and cryopreservation extenders are being studied with the aim to reduce these differences. In hibernating animals, hypoxia and hypothermia tolerance are dependent of the AMPK enzyme. As a cellular energy sensor, this enzyme contributes to the regulation of energy balance and therefore, it is proposed to evaluate their effects on the process of cryopreservation of equine spermatozoa. In this study was evaluated the freezability of stallion semen, by comparison of two methods: Liquid Nitrogen (LN) vs Ultrafreezer at -80 C, through the assessment of sperm viability, sperm motility and acrosomal integrity. Additionally was evaluated the inclusion of AICAR and 5 AMP (AMPK activators) as a strategy for improving named parameters. Furthermore HM-0 (Hussar Mawida) was used as basic extender (refrigeration and cryopreservation) separately added of: AICAR, 5'AMP, Compound C (AMPK inhibitor), and AICAR + Compound C. At end of cooling phase at 5 C, samples (straws) of each treatment were cryopreserved at -196 C (LN) and - 80 C (ultrafreezer) and stored for two weeks. Finally, straws were thawed and processed for in vitro analysis of sperm viability (eosin/nigrosine staining), acrosomal integrity (PSA-FITC) and sperm motility by C.A.S.A. (Computer Assisted Sperm Analysis). We observed that sperm viability was not affected by the pharmacologic agents, neither the cryopreservation method. Acrosomal integrity analysis exhibited that the use of Compound C decreases (P <0.05) the percentage of sperm acrosomal integrity (42.9 ± 6.1) compared to sperm treated with AICAR and AICAR + Compound C (61.4 ± 11.3 and 59.9 ± 15, respectively). It was not observed differences in sperm motility between the cryopreserved methods, but differences was found (P <0.05 and P <0.01) indicating more incremental data (ALH at -196 C 1.1 ± 0.9 vs - 80 C 2.1 ± 1.3 µm and STR at -196 C 55.6 ± 9 vs -80 C 65.3 ± 7.6%). In conclusion, equine sperm cryopreservation at -80 C may be an option to cryopreservation in LN, although comparative studies are needed with more than two weeks of storage. The addition of AMPK activators drugs did not improve neither deteriorate in vitro parameters of cryopreserved sperm quality (sperm viability, acrosomal reaction and sperm motility). Key words: Cryopreservation, equine, semen, AMPK.

6 3 3. INTRODUCCIÓN El uso de la inseminación artificial (IA) en equinos ha progresado en las últimas décadas debido al desarrollo de diferentes metodologías para la preservación de semen, tanto en estado fresco, refrigerado como congelado. A pesar de esto, las tasas de preñez que se obtienen cuando se utiliza semen equino criopreservado frente a semen fresco o refrigerado, son inferiores y las investigaciones actuales se enfocan mayoritariamente a obtener mejores resultados (Córdova- Izquierdo y col 2006). Si bien las tasas de fertilidad obtenidas mediante el uso de semen congelado son altamente variables (entre 0-100%) (Metcalf 2007), en general se obtienen tasas que varían entre un 45 y un 48% (utilizando semen fresco, las tasas de fertilidad bordean el 57-59%) (Vidament 2005). Actualmente la criopreservación seminal equina se realiza mediante el uso de nitrógeno líquido (NL). Las ventajas de usar semen congelado para ser utilizado en IA son: disminución de los costos de transporte (más barato es trasladar un contenedor de NL que un semental); menor estrés y costo de transporte de la yegua; continuación de la temporada reproductiva en caso de que el reproductor presente alguna lesión o esté compitiendo; las diferentes temporadas reproductivas entre el hemisferio norte y sur no generan problema; utilización de semen de reproductores de alto valor genético, incluso cuando éste haya fallecido; reducción del uso de reproductores genéticamente inferiores, ya que éstos pueden ser seleccionados independientemente de la ubicación geográfica; almacenamiento de semen proveniente de animales jóvenes que serán sometidos a castración (Squires y col 1999). Dentro de las desventajas de la utilización de semen congelado se pueden nombrar: se requiere personal capacitado para procesar, empajuelar y congelar los eyaculados, así como para la IA; el manejo reproductivo de las yeguas a inseminar y la obtención de una óptima fertilidad utilizando semen congelado es de alto costo y las tasas de fertilidad dependerán del momento del ciclo estral en que se encuentre la yegua en el momento de la IA, del sitio de inseminación, de la dosis utilizada y de la concentración espermática; la congelabilidad de espermatozoides entre reproductores es altamente variable, existiendo sementales con mala congelabilidad; necesidad de contenedores de NL en los planteles animales o centros de reproducción (Squires y col 1999; Córdova-Izquierdo y col 2006) RESPUESTA DEL ESPERMATOZOIDE A LA REFRIGERACIÓN Previo a la congelación, los espermatozoides deben refrigerarse a 5 C para que el cambio de temperatura no sea tan drástico. El tiempo que debe permanecer el semen refrigerado antes de ser congelado es variable. Hay estudios que detectan diferencias en la viabilidad celular al congelar

7 4 inmediatamente después de la eyaculación y al congelar después de 24 horas de refrigeración (presentando mayor viabilidad el primer método) (Melo y col 2007). A temperatura corporal (38 C) o temperatura ambiente (20 C aproximadamente) se generan productos de desecho que incrementan la acidez del semen provocando daño celular permanente, además ocurre peroxidación de lípidos de membrana, con lo que la célula de deteriora y muere. A 5 C los lípidos de la membrana plasmática sufren una transición de una fase líquida-cristalina a una fase de gel. Además el metabolismo espermático a temperatura de refrigeración corresponde a un 10% de lo que tendría a temperatura corporal o ambiente. Es así como los productos de desecho y la peroxidación de lípidos de membrana ocurre más lentamente y el deterioro celular también (Squires y col 1999). Los daños generados por la refrigeración se pueden minimizar (pero no evitar en un 100%) mediante la dilución del semen en un medio que contenga crioprotectores, y controlando la tasa de refrigeración. El daño celular puede ser causado directamente por afección de estructuras celulares (ruptura de membranas) o indirectamente por alteración de funciones celulares (desaceleración de procesos metabólicos). Si la curva de disminución de temperatura es muy rápida, se producen daños parcialmente irreversibles caracterizados por un patrón de motilidad anormal (movimientos circulares), rápida pérdida de motilidad, daño de la membrana acrosomal o plasmática, reducción del metabolismo y pérdida de componentes intracelulares. Para realizar la refrigeración, se utilizan diversos dispositivos de enfriamiento que permiten una curva de temperatura controlada (Squires y col 1999). La temperatura seminal puede bajar sin problemas entre los 37ºC a los 20ºC, pero entre 19ºC y 8ºC es una fase crítica para el espermatozoide equino, sin embargo el enfriamiento entre 8ºC y 5ºC puede realizarse rápidamente y mantenerse por varios minutos u horas sin efectos adversos (Morán y col 1992). La tasa de refrigeración de 22ºC a 8ºC debe ser de al menos de 0,5 C/min (en promedio) (Critser y Benson 2003) CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO En 1957, Barker y Gandier lograron obtener una cría mediante IA utilizando semen equino criopreservado a -79 C. No existen a la fecha otros estudios en equinos utilizando estas temperaturas ya que posterior a eso, sólo se ha utilizado -196 en NL para congelar semen equino y aún no se obtienen tasas de fertilidad similares a otras especies (Juliani y Henry 2008). Las tasas de fertilidad observadas mediante el uso de semen equino criopreservado son altamente variables, dependiendo del protocolo de congelación, diluyente usado, crioprotector, método de inseminación artificial y dosis de inseminación, además de la variabilidad entre sementales (Melo y col 2007). Además con la criopreservación aumenta el número de células apoptóticas en comparación con semen fresco, por lo que se hace necesario investigar cómo se pueden mitigar estas consecuencias. Para esto, los protocolos de criopreservación seminal deben ser óptimos, y los parámetros que se deben controlar al manipular semen son: la concentración de solutos extracelulares, la permeabilidad o impermeabilidad de la membrana plasmática a estos

8 5 solutos, y los cambios de temperatura a los cuales será sometido el eyaculado (enfriamiento, congelación y descongelación) (Critser y Benson 2003). Cuando se utiliza NL, se logran temperaturas de -196 C, donde no hay reacciones bioquímicas dentro de la célula y no se ha comprobado que pueda haber cambios de índole genético. Los principales daños que se generan cuando se congelan células son la formación de cristales de hielo intracelular y la descompensación de electrolitos y solutos (Critser y Benson 2003). Para evitar al máximo éstos efectos deletéreos es importante que el paso de refrigeración (5 C) a congelación sea muy rápido (10-20 C/min) (Palacios 1994). Tanto la refrigeración como el almacenamiento de semen en NL, pueden generar daños irreversibles en la membrana plasmática, causando ya sea muerte celular o cambios parecidos a los que se ven durante la capacitación espermática, que dificultan o impiden su capacidad para interactuar con el ovocito. Durante la capacitación espermática ocurre una reorganización y fluidización de la membrana plasmática, aumenta el calcio intracelular, se generan especies reactivas de oxígeno (ROS, productos de desecho), fosforilación de proteínas tirosinas mediadas por AMPc y capacidad de fertilización in vitro. Los eventos que ocurren durante la criopreservación similares a los de capacitación son reorganización y desestabilización de la membrana plasmática, aumento del calcio intracelular, generación de ROS, aparición de proteínas tirosinas fosforiladas y capacidad de fertilización in vitro (Bailey y col 2000). Debido a lo descrito anteriormente es que se desarrolló un concepto que se conoce como Criocapacitación, ya que los cambios que suceden en el espermatozoide durante la capacitación han sido asociados con crioinjurias (Meyers y col 2003) EL ESPERMATOZOIDE Y LA ENERGÍA Para que los espermatozoides lleven a cabo la fecundación, necesitan de altas concentraciones de ATP, tanto para la motilidad, como para la fusión de membranas con el ovocito. Si bien los espermatozoides carecen de muchos de los organelos que participan en los procesos metabólicos, son metabólicamente activos debido a que poseen las enzimas necesarias para realizar las reacciones bioquímicas de la glucólisis, el ciclo de Krebs, la oxidación de ácidos grasos, el transporte de electrolitos y posiblemente la vía de las hexosas monofosfato (Garner y Hafez 2000). Mukai y Okuno 2004 comprobaron que la principal vía de obtención de ATP utilizada para la motilidad en los espermatozoides de ratón proviene de la glucólisis, aunque en el caso de los espermatozoides equinos, según Bedford y Hoskins 1990, la respiración celular seria la principal fuente energética responsable de la motilidad (citado por Cummins 2009).

9 HIBERNACIÓN Existen animales que para conservar energía en el invierno utilizan una estrategia adaptativa llamada hibernación. Esta adaptación ocurre en un periodo donde la demanda energética es alta y la disponibilidad escasa. A nivel celular, la hibernación genera cambios hipometabolizantes para conservar energía, mediante expresión de genes específicos asociados a ARN y proteínas, mediados por fosforilación (activación) de proteínas y enzimas que permiten un uso eficiente de energía. En general se debe lograr un equilibrio energético (relación AMP/ATP), el cual se realiza mediante la disminución de funciones mitocondriales (Carey y col 2003). Se ha comprobado que en periodos carentes de energía/nutrientes algunos tipos celulares activan una enzima mitocondrial denominada quinasa activada por monofosfato de adenosina (AMPK) (Hardie 2011) QUINASA ACTIVADA POR MONOFOSFATO DE ADENOSINA (AMPK) Y FÁRMACOS ASOCIADOS A SU ACTIVACIÓN O INHIBICIÓN La AMPK regula (inhibe) procesos bioquímicos relacionados con la síntesis proteica. Debido a que la síntesis proteica demanda gran cantidad de energía celular, la habilidad de AMPK para modular este proceso hace que sea considerada de gran importancia para la homeostasis tanto celular como a nivel de organismo. Los cambios intracelulares que genera la activación de AMPK se deben principalmente por la activación de proteínas fosforiladoras (activadoras) que incluyen enzimas biosintéticas, transportadores, factores de transcripción, canales iónicos y proteínas de iniciación de ciclos celulares (Hardie 2011), además de un aumento en la relación AMP/ATP (Miranda y col 2007). Hasta el momento no existen reportes de la presencia de AMPK específicamente en espermatozoides de mamíferos, pero resultados no publicados del Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile indican la presencia de enzimas tipo AMPK en espermatozoides de ratón, bovino, humano y equinos. Existen fármacos capaces de activar la AMPK, algunos de los cuales son utilizados en tratamientos contra enfermedades como diabetes mellitus tipo 2 disminuyendo la resistencia a la insulina, estos son metformina y fenformina. También se utiliza una molécula artificial llamada ribonucleósido 5-aminoimidazol 4-carboxamida (AICAR), éste último es el compuesto más utilizado para la caracterización de los efectos de la AMPK (Sakamoto y col 2004; Miranda y col 2007). Así como hay moléculas capaces de activar AMPK, existe también una molécula con la capacidad de inhibir esta enzima. Éste es el Compuesto C, una molécula permeable, potente y selectiva, que inhibe reversiblemente a AMPK, compitiendo con ATP en ausencia de AMP (Zhou y col 2001).

10 DILUYENTES DE CONGELACIÓN ESPERMÁTICA Existen varios diluyentes de congelación comerciales ocupados para manipulación de semen equino. Dentro de los más utilizados se puede nombrar, EDTA-lactosa, INRA 82 y Botucrío (Alvarenga y Papa 2011). Éstos diluyentes contienen lipoproteínas, las cuales son adheridas por la membrana plasmática del espermatozoide y ayudan a la estabilización de las membranas durante la congelación y descongelación. Estas lipoproteínas provienen de productos lácteos, yema de huevo o ambos. Se puede incorporar también monosacáridos (como glucosa o fructosa), disacáridos (sucrosa, lactosa) y trisacáridos (rafinosa). Éstos azúcares otorgan propiedades osmóticas y sirven como fuente de energía (glucosa y fructosa) (Palacios 1994). También se ha propuesto el uso de trehalosa (disacárido) en los diluyentes de congelación de semen equino (Squires y col 2004) Las altas concentraciones de electrolitos en el medio extracelular generan una toxicidad química, la cual puede ser contrarrestada mediante la adición de sustancias permeabilizantes a los diluyentes de congelación, como glicerol o etilenglicol. Los beneficios de éstos compuestos se deben a que aumentan la osmolaridad, por lo que se reducen las concentraciones de electrolitos extracelulares (Mantovani 2002). Además se ha propuesto el uso de moléculas similares al glicerol, pero de menor peso molecular, como las amidas (metil-formamida y dimetil-formamida), las cuales presentan una mayor solubilidad en agua y menor toxicidad celular (Alvarenga y col 2005). Desde 2009 a la fecha, en el Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile, se está probando un diluyente de congelación base, carente de fuentes energéticas exógenas (azúcares) como una estrategia hipometabolizante, llamado HM-0 (Hussar Mawida), que contiene tris (300 mm), ácido cítrico (94,7 mm), glicerol (2%), yema de huevo (15%), estreptomicina (1mg/ml de HM-0) y gentamicina (0,05mg/ml de HM-0). Cabe destacar que la yema de huevo posee una concentración de glucosa libre de 20 mm (Grobas y Mateos 1996), y como en HM-0 hay un 15% de yema, la concentración de glucosa que éste tendría sería de 3,3 mm, que podría ser utilizada por el espermatozoide como fuente energética EVALUACIÓN ESPERMÁTICA Para llevar a cabo la fecundación, los espermatozoides deben tener intacta tanto la membrana plasmática como acrosomal y mantener una adecuada motilidad (progresiva). Con la criopreservación, la integridad de estas membranas puede verse afectada, así como la motilidad. Es así que se han desarrollado diversas técnicas para evaluar estos parámetros y así determinar la calidad seminal (Córdova-Izquierdo y col 2006). La evaluación de la viabilidad espermática permite determinar el estado de la membrana plasmática. Una de las técnicas más utilizadas es la tinción con eosina/nigrosina, donde por medio

11 8 de un microscopio de campo claro se cuantifican los espermatozoides permeables y los no permeables a la tinción (Modificado de Bloom 1950). Espermatozoides que presentan daño en la membrana acrosomal, o que hayan sufrido reacción acrosomal tienen la misma incapacidad de fecundar que uno no viable o no motil (Squires y col 1999). Dentro de las técnicas para evaluar la integridad acrosomal está la utilización de microscopía de epifluorescencia mediante el uso de una lectina fluorescente, asociada a una aglutinina de Pisum sativum (PSA-FITC) (Salazar y col 2011). La motilidad espermática es un parámetro importante de evaluar, debido a que es necesaria para que los espermatozoides lleguen al sitio de la fecundación, además de facilitar el traspaso de éstos a través de la zona pelúcida. Si bien existen métodos que permiten realizar una evaluación de la motilidad de manera rápida y fácil, mediante observación microscópica directa, también se puede utilizar una evaluación computarizada, siendo más precisa y objetiva (Squires y col 1999). El análisis espermático asistido por computadora (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA) consiste en realizar repetidas fotografías por unidad de tiempo, lo que permite individualizar espermatozoides y construir una trayectoria espermática, mediante la utilización de algoritmos computacionales. (Rodríguez-Gil y col 2007) HIPÓTESIS Es posible mantener los parámetros de calidad de semen equino criopreservándolo a -80 C, al igual que la criopreservación a -196 C utilizando diluyentes hipometabolizantes OBJETIVOS Objetivo General Evaluar comparativamente parámetros de calidad espermática postdescongelación en semen equino criopreservado a -80 C con la congelación tradicional en NL a -196 C Objetivos Específicos Evaluar y comparar parámetros de funcionalidad espermática (viabilidad, reacción acrosomal y motilidad) en semen equino congelado, criopreservado a -80 C y a -196 C. Evaluar el efecto de fármacos hipometabolizantes como parte del diluyente de refrigeración/congelación a -80 C y a -196 C de semen equino para mantener y/o mejorar la calidad seminal postdescongelación.

12 9 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. MATERIAL Se utilizaron 2 eyaculados de 6 sementales (n=12) fina sangre de tiro pesado (razas Bretón de Montaña (n=1), Belga Ardenés (n=2) y Percherón (n=3)) entre 5 y 20 años de edad, pertenecientes al Haras Militar Pupunahue, ubicado en la XIV región de Chile, comuna de Máfil, provincia de Valdivia. Los equipos utilizados fueron: refrigerador eléctrico portátil 1, centrífuga de sobremesa 2, centrífuga refrigerada para microtubos 3, microscopio de campo claro y contraste de fase 4 asociado a C.A.S.A 5, microscopio de epifluorescencia 6, platina térmica 7, baño temperado 8 y Ultrafreezer 9. Además fueron utilizados: Un tanque de NL de 50 L, micropipetas de 10, 100 y 1000 µl, tubos Falcon de 50 y 15 ml, tubos eppendorf de 1,5 ml, portaobjetos de cristal de 26 x 76 mm, cubreobjetos de 24 x 24 mm, pajuelas francesas de 0,5 ml, leche descremada como diluyente de centrifugación y HM-0 como diluyente de refrigeración y congelación. También se utilizaron fármacos como AICAR, 5 AMP y Compuesto C MÉTODOS Todos los procedimientos descritos a continuación, desde la colecta de semen, hasta la congelación fueron realizados según protocolos del proyecto FONDEF D08I1076 Generación de un banco de semen de caballos fina sangre de tiro pesado y se esquematizan en la Figura 1a Colección y evaluación del semen Los 6 sementales utilizados fueron seleccionados por su probada congelabilidad seminal y evaluación andrológica entre 12 reproductores del Haras Militar Pupunahue. Los valores promedios obtenidos en la selección de los sementales en términos de congelabilidad fueron: viabilidad espermática postdescongelación de 36,11±13.69% y motilidad total postdescongelación de 20,06±9,18% (Datos no publicados del Proyecto FONDEF D08I1076). 1 Klimber BCR-25 2 BOECO C-28A 3 BOECO M-240R 4 NIKON Eclipse E200 5 SCA Microptic v NIKON TS100 7 Lab-line N FISHER ULT Freezer ThermoForma

13 10 De cada semental seleccionado se obtuvieron 2 eyaculados, con una separación de una semana entre cada uno. La rutina de colección a la que estaban sometidos los reproductores era de 2 a 3 colectas por semana. Cada colecta se realizó utilizando una vagina artificial (modelo Hannover) atemperada a C rellena con agua caliente. En el extremo de la vagina artificial fue adicionado un frasco colector para semen con filtro, que permite separar la porción rica en espermatozoides de la porción gelatinosa del semen (Schober y col 2007). Una vez realizada la colección de semen se registró el volumen del eyaculado. Posteriormente se obtuvo una alícuota de 10µL de semen para evaluar la concentración espermática mediante el uso de una cámara de Neubauer. Además se tomó una alícuota de 7µL de semen para realizar una tinción de eosina/nigrosina y evaluar la viabilidad espermática. Se utilizaron sólo eyaculados con una concentración superior a 100 millones de espermatozoides/ml y 70% de viabilidad o superior Dilución y centrifugación El semen fue diluido con leche descremada (temperada a 37 C) en una proporción de 1:1 en tubos falcon de 50 ml los cuales fueron sometidos a centrifugación a 700 g x 20 minutos. Una vez que los eyaculados fueron centrifugados, se eliminó el sobrenadante y el pellet fue resuspendido con HM-0 (diluyente base), que contiene tris (300 mm), ácido cítrico (94,7 mm), glicerol (2%), yema de huevo (15%), estreptomicina (1mg/ml de HM-0) y gentamicina (0,05mg/ml de HM-0). El volumen de HM-0 utilizado fue variable dependiendo de la concentración inicial de cada eyaculado, y se calculó para que una vez resuspendido, se obtuviera una concentración aproximada de 50 millones de espermatozoides por ml. Ésta concentración fue necesaria para análisis experimentales in vitro principalmente de motilidad en el C.A.S.A., para evitar diluir la muestra, además de optimizar el uso de los eyaculados para lograr realizar todos los tratamientos. Se consideró una pérdida estándar de un 15% de espermatozoides en el sobrenadante. La temperatura ambiente del laboratorio fue de 20 C Tratamientos experimentales Una vez resuspendido el pellet, se alicuotó en 5 tubos falcon de 15 ml (7 ml c/u), para dar paso a los tratamientos. Se rotularon los tubos con códigos adjudicados a cada tratamiento, quedando de la siguiente manera: Tubo 1: HM-0 como control. Tubo 2: HM-0 + AICAR, a una concentración final de 2 mm (Sakamoto y col 2004). Tubo 3: HM AMP a una concentración final de 2 mm (se realizó un experimento previo para determinar la concentración óptima de 5 AMP). Tubo 4: HM-0 + Compuesto C a una concentración de 40 µm (Zhou y col 2001). Tubo 5: HM-0 + AICAR (2 mm) + Compuesto C (40 µm) Refrigeración Una vez realizados los tratamientos, cada uno de ellos fue envasado en 3 pajuelas de 0,5 ml y en 3 pajuelas de 0,5 ml modificadas a 0,35 ml. Después de esto, se inició la refrigeración, donde se bajó la temperatura de las pajuelas desde 20ºC a 5 C en un tiempo de 90 minutos a una tasa de refrigeración de -7,4 C/min (de 20 a 10 C); 1,8 C/min (de 10 a 7 C) y -0,2ºC/min (de 7 a 5 C ) para después mantener la temperatura hasta los 90 minutos (Figura 1b). Para esto, las pajuelas fueron introducidas en un refrigerador eléctrico portátil que permite esa tasa de refrigeración.

14 11 Los pasos anteriormente descritos se realizaron a terreno en el Haras Militar Pupunahue, la refrigeración culminó durante el traslado hacia el Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile, donde se procedieron las siguientes etapas Congelación Congelación a -80 C. La congelación del semen se realizó tanto en NL (a -196 C) como en un Ultrafreezer a -80 C. Debido a que el método a -80 C no está descrito en equinos, se ha debido desarrollar y modificar algunos de los materiales que normalmente se utilizan para la congelación tradicional. Para esto, se desarrolló un dispositivo que permita utilizar la inmersión de pajuelas de 0,5 ml en isopropanol, que es el medio que se utiliza para obtener una tasa de congelación constante hasta llegar a la temperatura deseada (-80 C) (Figura 1b). Esto se hizo modificando tubos falcon de 50 ml para poner dentro de éstos, un tubo falcon de 15 ml. El tubo de 50 ml contuvo 35 ml de isopropanol, y dentro del tubo de 15 ml se introdujeron las pajuelas las cuales fueron cortadas a 11cm (largo máximo de los tubos), obteniendo un volumen máximo de semen de 0,35 ml en cada pajuela (Figura 1b). Datos no publicados del Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile validan este soporte de congelación, donde no hay un efecto deletéreo al disminuir el largo de las pajuelas. Las pajuelas que fueron congeladas a -80 C se introdujeron en los dispositivos (previamente refrigerados a 5 C) y fueron llevadas al Ultrafreezer, donde se mantuvieron hasta el momento de la descongelación. Se obtuvo una tasa de congelación de -1,9 C/min (desde 5 C a -50 C) y de - 0,3 C/min (entre -50 C y -80 C) (Figura 1b) Congelación a -196 C. Las pajuelas que fueron congeladas en NL se dispusieron a 3 cm por encima del vapor del NL durante 20 minutos (en una caja de poliestireno, capacidad 20 L), para luego ser inmersas en NL, y posteriormente distribuidas en los canisteres del tanque de NL. La tasa de congelación que se obtiene utilizando NL es de -60 a -70 C/min (Figura 1b) (Canisso y col 2008; Schober y col 2007). Figura 1a. Esquema del diseño experimental

15 Tiempo (min) Temperatura C * Temperatura C m (20-10 C) =7,4 C/min m (10-7 C) =1,8 C/min m (7-5 C) =0,2 C/min ** Tiempo (min) -200 Figura 1b. Rampas de temperatura obtenidas mediante la congelación se semen en NL (-196 C) (n=3) y a -80 C (n=3) obtenida con termógrafo electrónico programable (Termocupla 10 ). Entre el minuto 0 y 90 ambas curvas representan la refrigeración, que es idéntica para ambos protocolos de congelación. * Componentes de la curva de refrigeración (m). ** La imagen en miniatura muestra el dispositivo utilizado para congelación a -80 C en Ultrafreezer Descongelación El proceso de descongelación fue realizado dos semanas después de congeladas las muestras de semen (Rodríguez-Gil y col 2007). Éste se realizó en baño térmico a 37 C por 30 segundos en un baño temperado (Schober y col 2007). Una vez descongelado, el semen fue sometido a evaluación de la congelabilidad mediante 3 pruebas: viabilidad espermática, integridad acrosomal y motilidad espermática. 10 Data Logger, marca ThermoWorks, modelo TW-USB-TC

16 Evaluación espermática En términos de calidad espermática postdescongelación, se evaluó viabilidad espermática, integridad acrosomal y motilidad espermática. Todas las evaluaciones fueron realizadas en duplicado Viabilidad Espermática. El protocolo seguido para evaluar viabilidad espermática se presenta en el anexo 2. Se utilizó una tinción de eosina/nigrosina y microscopía de campo claro (Modificado de Bloom 1050). Las cabezas de los espermatozoides considerados viables se apreciaron blancos ya que al estar íntegra la membrana plasmática, la eosina no penetra dentro de la célula y por lo tanto no se tiñe, en cambio las cabezas de los espermatozoides no viables se observaron rosadas, debido a que la eosina si logró penetrar la célula. Todo esto se observó sobre un fondo morado otorgado por la nigrosina. Por cada frotis se contaron 200 células Integridad Acrosomal. El protocolo para evaluar integridad acrosomal se presenta en el anexo 3. Se utilizó PSA-FITC y microscopía de epifluorescencia (Modificado de Salazar y col 2011). Utilizando un filtro de 488 nm de excitación, las cabezas de los espermatozoides con el acrosoma intacto se observaron con la mitad superior de color verde fosforescente y la mitad inferior de color negro. Las cabezas de los espermatozoides reaccionados no se tiñen, salvo una línea ecuatorial verde, que corresponde a los residuos de manosa que quedan después de ocurrida la reacción acrosomal Por cada frotis se contaron 200 células Motilidad Espermática. Para evaluar motilidad se utilizó un análisis espermático asistido por computadora (CASA) (Modificado de Salazar y col 2011), cuyo protocolo está en el anexo 4. Los parámetros evaluados mediante CASA se presentan en la tabla Análisis estadístico Los resultados ( ±DE) entre tratamientos, para cada uno de los tipos de congelación, fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía (ANOVA) o Kruskal-Wallis (según si la distribución de los datos fue normal o no, respectivamente). Para comparar cada parámetro evaluado entre la congelación en NL y la congelación a -80 C se utilizó una prueba de t de Student o una prueba de Wilcoxon (dependiendo si la distribución de los datos fue normal o no, respectivamente). Los resultados fueron analizados y graficados mediante el uso del programa GraphPad Prism Versión 5.0, 2007 Graphpad Software, inc.

17 14 Tabla 1. Definición de los parámetros de motilidad obtenidos a través del C.A.S.A (Modificado de Rodríguez-Gil y col 2007) Parámetro Unidad Descripción Total Progresivos % Porcentaje de espermatozoides que presentan movimiento progresivo Motilidad Total % Porcentaje total de espermatozoides motiles Velocidad Curvilínea (VCL) µm/s Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria en función del tiempo Velocidad Rectilínea (VSL) Velocidad Media (VAP) Amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza del espermatozoide (ALH) µm/s µm/s µm Distancia recorrida por el espermatozoide entre el primer punto y el último de su trayectoria en función del tiempo Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria media en función del tiempo Desplazamiento medio efectuado por la cabeza del espermatozoide en la trayectoria curvilínea de un lado a otro de su trayectoria media o lineal Índice de linealidad (LIN) % Relación porcentual entre VSL y VCL Índice de rectitud (STR) % Relación porcentual entre VSL y VAP Índice de oscilación (WOB) % Relación porcentual entre VAP y VCL Frecuencia de batida de la cabeza del espermatozoide (BCF) Hz Frecuencia con la cual la trayectoria curvilínea atraviesa la trayectoria lineal en función del tiempo

18 15 5. RESULTADOS 5.1. VIABILIDAD ESPERMÁTICA La caracterización del porcentaje de viabilidad espermática entre el semen fresco y refrigerado a los 90 minutos se presenta en la Figura 2. Los resultados de viabilidad de semen descongelado indican que no existen diferencias significativas entre tratamientos, para ambos tipos de congelación. La comparación de cada uno de los tratamientos entre los tipos de congelación tampoco presenta diferencias significativas (tabla 2). % Viabilidad FRESCO HM-0 AICAR 5'AMP COMP C AICAR+CC Figura 2. Viabilidad espermática promedio de semen fresco y después de 90 minutos de refrigeración (símbolo ). Tabla 2. Viabilidad espermática postdescongelación para cada uno de los tratamientos y tipos de congelación ( ±DE). Tratamientos HM-0 AICAR 5'AMP COMP.C AICAR + CC Tipo de Congelación %Viabilidad -196 C 48,7 ± 15,7-80 C 47,7 ± 11,0-196 C 50,6 ± 12,3-80 C 45,1 ± 6,3-196 C 48,4 ± 14,1-80 C 46,7 ± 10,1-196 C 47,3 ± 15,1-80 C 45,3 ± 9,3-196 C 48,5 ± 11,1-80 C 47,5 ± 7,8

19 INTEGRIDAD ACROSOMAL Con respecto a los resultados del estado acrosomal de las muestras descongeladas de NL, no se observaron diferencias significativas (P < 0,05) entre los tratamientos, pero si se encontraron diferencias significativas entre algunos de los tratamientos en semen descongelado de 80 C, específicamente entre AICAR y Compuesto C (P < 0,05) y entre AICAR + Compuesto C y Compuesto C (P < 0,01), siendo menor el resultado de Compuesto C en ambos casos. Al comparar cada tratamiento entre los tipos de congelación, se encontraron diferencias significativas para AICAR (P < 0,01) y para AICAR + Compuesto C (P < 0,05) (Tabla 3). Tabla 3. Resultados de acrosomas intactos para cada uno de los tratamientos y tipos de congelación ( ±DE) MOTILIDAD Tratamientos HM-0 AICAR 5'AMP COMP.C Tipo de Congelación %Acrosomas Intactos -196 C 54,6 ± 7,2-80 C 51,3 ± 17,4-196 C -80 C 48,2 ± 10,2 a 61,4 ± 11,3 b -196 C 53,3 ± 9,2-80 C 54,5 ± 9,8-196 C 49,0 ± 9,7-80 C 42,9 ± 6,1-196 C 48,5 ± 9,9 AICAR + CC c -80 C 59,9 ± 15,0 d Superíndices: a vs b P <0,01; c vs d P <0,05 Los resultados de la evaluación de motilidad están presentados en la Tabla 4, donde se observan diferencias significativas sólo en el ALH de 5 AMP (P < 0,05) (siendo el resultado de NL más óptimo) y en el STR de Compuesto C (P < 0,01) (siendo el resultado de -80ºC más óptimo). Los resultados de ANOVA para cada una de las variables evaluadas entre tratamientos no presentan diferencias significativas.

20 17 Tabla 4. Comparación de cada uno de los parámetros de motilidad, para cada tratamiento, entre los tipos de congelación ( ±DE). Tipo de Progresivos Motiles VCL VSL VAP ALH LIN STR WOB BCF Tratamiento Congelación (%) (%) (µm/s) (µm/s) (µm/s) (µm) (%) (%) (%) (Hz) HM ,5 ± 3,3 17,3 ± 12,1 27,6 ± 8,1 8,5 ± 5,2 14,2 ± 7,4 1,2 ± 1,2 29,9 ± 11,7 57,9 ± 8,4 49,1 ± 13,9 4,6 ± 4,5-80 4,1 ± 4,5 22,9 ± 13,0 32,7 ± 12,4 11,5 ± 4,7 18,0 ± 7,0 1,7 ± 1,3 35,2 ± 7,7 63,2 ± 5,6 55,3 ± 8,8 5,7 ± 4,7 AICAR ,7 ± 6,2 20,0 ± 17,1 29,3 ± 10,0 9,1 ± 5,8 15,5 ± 8,0 1,0 ± 1,1 28,8 ± 13,2 55,2 ± 9,8 50,2 ± 14,2 4,3 ± 4,6-80 5,2 ± 5,6 21,9 ± 15,0 35,1 ± 11,9 12,5 ± 6,1 19,1 ± 8,2 1,9 ± 1,3 33,7 ± 9,1 62,9 ± 8,7 52,8 ± 8,9 6,5 ± 4,6 5'AMP ,5 ± 13,0 23,8 ± 21,3 31,9 ± 12,9 12,3 ± 10,7 18,8 ± 13,1 1,1 ± 0,9 a 33,4 ± 17,8 59,4 ± 12,4 56,3 ± 22,1 4,2 ± 3,9-80 4,4 ± 4,2 27,4 ± 14,7 32,2 ± 12,6 11,5 ± 4,2 18,7 ± 7,5 2,1 ± 1,3 b 36,8 ± 10,6 61,6 ± 9,2 58,2 ± 9,6 7,0 ± 4,2 COMP. C ,8 ± 1,7 15,7 ± 8,9 29,4 ± 10,1 9,1 ± 5,9 15,5 ± 8,2 1,1 ± 1,0 28,7 ± 11,7 55,6 ± 9,0 c 50,4 ± 13,0 4,5 ± 4,2-80 3,5 ± 3,2 19,0 ± 11,9 33,9 ± 12,7 12,4 ± 7,1 18,7 ± 9,4 1,9 ± 1,4 36,8 ± 12,4 65,3 ± 7,6 d 55,3 ± 13,9 6,5 ± 4,6 AICAR + CC ,6 ± 1,9 15,5 ± 8,5 28,3 ± 7,7 8,0 ± 4,6 14,1 ± 6,0 0,9 ± 0,7 27,2 ± 12,2 53,7 ± 10,2 48,7 ± 13,4 4,2 ± 3,6-80 4,5 ± 4,5 20,9 ± 12,3 37,1 ± 17,7 11,8 ± 5,2 19,5 ± 9,1 1,2 ± 1,5 34,1 ± 10,0 61,4 ± 9,6 54,0 ± 11,8 4,2 ± 4,6 Superíndices: a vs b P < 0,05; c vs d P < 0,01.

21 18 6. DISCUSIÓN Los valores de viabilidad espermática aceptables para semen equino descongelado (destinado a IA) bordean el 50%. Los resultados de viabilidad tanto para los tipos de congelación, como para los distintos tratamientos no presentaron diferencias significativas (P <0,05), y están acordes con resultados obtenidos en otros experimentos (Tabla 2) (Mantovani y col 2002). Esto indica que la congelación a -80 C no es más deletérea que la congelación tradicional en NL (al menos para este parámetro) y que los distintos tratamientos no generan cambios en la membrana plasmática que evidencien una mayor o menor viabilidad. Con respecto a la integridad acrosomal, según Salazar y col 2011, valores ~65% de espermatozoides con acrosoma intacto son aceptables para semen descongelado. Los porcentajes de integridad acrosomal obtenidos en este estudio son inferiores que los valores de referencia, (entre 42,9±6,1 y 61,4±11,3) y al comparar los tipos de congelación, se observaron diferencias significativas (P <0,01 y P <0,05) al utilizar AICAR y AICAR + Compuesto C, respectivamente (obteniendo un mayor porcentaje de acrosomas intactos al congelar a -80 C) (Tabla 3). No existen antecedentes que permitan explicar dichos resultados, pero podría deberse a la menor tasa de congelación. La tasa de congelación obtenida mediante la criopreservación seminal a -80 C (- 1,9 C/min, desde 5 C a -50 C, y de -0,3 C/min, entre -50 C y -80 C) es notablemente más lenta que la observada en NL (-60 a -70 C/min) (Figura 1b). Además la utilización de Compuesto C, que inactiva AMPK, impediría que AICAR genere su acción (activar AMPK), por lo que cabe la posibilidad que las diferencias obtenidas no estén asociadas a la activación o inhibición de dicha enzima en espermatozoides de equino. Para determinar si existe relación o interacción entre el tipo de congelación y el efecto de los fármacos utilizados habría que realizar un análisis factorial. Para que un eyaculado pueda ser utilizado en IA, se buscan ciertos parámetros de motilidad óptimos, que si bien no permiten predecir una tasa de fertilidad adecuada, son necesarios para catalogar un eyaculado de buena o mala calidad (Kuisma y col 2006). La motilidad total postdescongelación debería ser superior al 30% y la motilidad progresiva superior al 20% aproximadamente (Juliani y Henry 2008, Salazar y col 2011). Aunque pueden existir variaciones entre razas, dentro de una raza también se pueden encontrar resultados variables entre sementales. Un estudio comparativo entre razas de tiro pesado (razas Tori y Estonian) muestra resultados de motilidad total de semen descongelado entre un 42,3% (Estonian) y un 43,4% (Tori), no presentando diferencias significativas entre razas (Kavak y col 2003), por el contrario en un estudio realizado con razas Percherón y Bretón de Montaña por Braun y col 1995, ninguno de los reproductores alcanzó porcentajes de motilidad total postdescongelación aceptables para IA (entre 13,7±5,1 y 24,7±8%), categorizando a los equinos de tiro pesado como malos congeladores. Los resultados obtenidos al analizar la motilidad espermática son similares a los observados en el experimento de Braun y col 1995 (Tabla 4) y por lo tanto no se pueden considerar adecuados para ser utilizados en IA. Si bien, no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos, al utilizar 5 AMP en la congelación a -196 C, se obtienen mejores

22 19 resultados (en todos los parámetros evaluados) comparados con AICAR + Compuesto C, dónde la enzima AMPK permanece inhibida. Menores valores de ALH para 5 AMP (NL = 1,1 ± 0,9 vs - 80 = 2,1 ± 1,3) indican mayor progresividad de los espermatozoides. Adicionalmente, el otro valor significativo, que indica mayor progresividad, es el STR para Compuesto C en el descongelado de -80 C (NL = 55,6 ± 9,0 vs -80 = 65,3 ± 7,6). La linealidad del movimiento espermático está altamente relacionada con la fertilidad, y por lo tanto es un parámetro deseable al momento de evaluar la motilidad espermática (Rodríguez-Martínez 2000). Además la gran cantidad de plasma seminal emitido durante la eyaculación en estas razas de caballos puede contribuir a una pobre congelabilidad seminal (Braun y col 1995). Los resultados obtenidos, principalmente en viabilidad espermática, demuestran que no hay diferencias significativas (P <0,05) entre los métodos de congelación pero en los otros parámetros evaluados, las diferencias encontradas no muestran una tendencia clara sobre qué método de criopreservación es mejor. A temperaturas de -196 C (NL) no hay reacciones bioquímicas dentro de la célula, sin embargo existen estudios que afirman que sobre los -130 C puede aún existir agua no congelada intracelularmente, lo que permitiría funciones celulares que traen como consecuencia degradación celular (Palacios 1994; Foote 2002). Devireddy y col 2002, demostró que la tasa de congelación óptima de semen equino era de ~29 C/min (en ausencia de agentes crioprotectores) y de ~60 C/min (en presencia de agentes crioprotectores, como en HM-0 que contiene glicerol como criopretector). A pesar que la tasa de refrigeración es idéntica para ambos métodos y la tasa de congelación utilizada para congelar a -80 C es distinta y más lenta que la curva utilizada en NL, no queda demostrado que ocurriera degradación celular al criopreservar espermatozoides de equino a -80 C (al menos a las 2 semanas postcongelación), en comparación con el método tradicional (NL, donde se utilizó la curva descrita por Devireddy y col 2002). Al congelar en NL se utilizaron pajuelas de 0,5 ml y en la congelación a -80 C se utilizaron las mismas pajuelas modificadas en su largo, cuyo volumen final fue de 0,35 ml. Ésta diferencia de volumen podría otorgar diferencias en los parámetros evaluados al comparar ambos tipos de congelación, ya que cambia el largo de las pajuelas, pero se mantiene la concentración espermática (relación diluyente de congelación/espermatozoides) y la relación congelante/plástico/semen. Existen estudios donde evalúan la congelación de semen equino en pajuelas de 0,5 y 0,25 ml a distintas concentraciones espermáticas. Las pajuelas de 0,25 ml tienen menor calibre, por lo que la relación congelante/plástico/semen es distinta que en las pajuelas de 0,5 ml. Aún así, solamente el VCL fue significativamente mayor en pajuelas de 0,25 ml, todos los otros factores evaluados (viabilidad, y los distintos parámetros de motilidad) no presentaron diferencias significativas al utilizar distintos volúmenes de almacenamiento, pero si a distintas concentraciones, obteniendo mejores resultados a menores concentraciones (100 x10 6 vs 200 y 400 x10 6 de espermatozoides/ml), además se pueden presentar diferencias por los sementales utilizados en los distintos experimentos (Nascimiento y col 2008). La concentración utilizada para ésta memoria de título fue de 50 x10 6 espermatozoides/ml, necesaria para los análisis de motilidad realizados por el C.A.S.A. sin diluir y no deberían existir efectos deletéreos en las características postdescongelación, al respecto Salazar y col 2011, reportan el uso de concentraciones de 20 x10 6 espermatozoides/ml para congelar semen equino, obteniendo porcentajes de motilidad total postdescongelación 30%.

23 20 El diluyente de congelación utilizado (HM-0), a excepción del escaso contenido de glucosa disponible por la presencia de yema de huevo (3,3 mm) y del contenido de ácido cítrico de HM-0, el cuál podría ser utilizado por la célula en el ciclo de Krebs para obtener energía (Garner y Hafez 2000), no contiene fuentes energéticas y por lo tanto no contiene nutrientes para el espermatozoide, a diferencia de los diluyentes comerciales normalmente utilizados, como Botucrío, EDTA-lactosa ó INRA 82 (Alvarenga y Papa 2011). Datos no publicados del Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile compararon viabilidad, integridad acrosomal y motilidad (total y progresiva) en semen descongelado de todos los reproductores utilizados en el proyecto FONDEF D08I1076, utilizando el diluyente HM-0 versus otros diluyentes comerciales como Botucrío y Maxcrío, y no se presentaron diferencias significativas en éstos parámetros, validando por lo tanto su utilización como diluyente experimental base. La razón para utilizar AICAR y 5 AMP en los experimentos realizados, se basa principalmente en lograr disminuir el gasto de ATP, activando la AMPK y de esta forma detener o disminuir los procesos catabólicos propios de la célula. En condiciones normales AMPK se activa por el aumento de la relación AMP/ATP (Sakamoto y col 2004). Está demostrado que la cascada fosforilativa de AMPK se activa además, en respuesta a cambios térmicos, para otorgar mejor eficiencia en el uso de ATP, lo que permitiría sobrevivir a ciertos animales en condiciones desfavorables como ocurre por ejemplo en la hibernación (Frederich y col 2009). Existen pruebas de que no todas las células corporales responden igual a la estimulación de AMPK, así por ejemplo, en células hepáticas, musculares, cardiacas, y del sistema nervioso central, está demostrado que ésta enzima cumple un rol muy importante y que por lo tanto otorga propiedades de alta resistencia a factores de estrés como hipoxia e hipotermia (Miranda y col 2007). Pero también hay estudios que dan a conocer la existencia de células que no presentan buena respuesta frente a la acción de AICAR, como algunas células renales (Menze y col 2010). Datos no publicados del Laboratorio de Criobiología y análisis espermático de la Universidad Austral de Chile, indican que existen enzimas de tipo AMPK en espermatozoides de equino, pero debido a los resultados de ésta memoria de título se deja abierta la posibilidad de que los espermatozoides, específicamente del equino, presentan una isoforma de AMPK insensible a los fármacos clásicamente usados para su activación y que por lo tanto expliquen el efecto entre activadores e inhibidores que permitan una mejor sobrevivencia después de la criopreservación, tanto en NL como a -80 C. En éste estudio, se consideraron 90 minutos (refrigeración) antes de llevar a cabo ambos tipos de congelación, por ello, la ventana de activación (tiempo) de la enzima AMPK es la refrigeración. Menze y col 2010, realizó estudios con varios tipos celulares, utilizando AICAR para activar AMPK, donde previo a la congelación, mantenía las células con AICAR durante 24 horas. Es por esto que el tiempo de activación utilizado en los experimentos de ésta memoria de título pudo haber sido insuficiente.

24 CONCLUSIONES De acuerdo a las condiciones en las cuales se realizó este estudio, se puede concluir que: La congelación a -80 C podría ser una alternativa a la congelación tradicional a -196 C (NL), y también como método alternativo de mantención de muestras o dosis previamente congeladas en NL, pero se requieren más estudios que la validen. La adición de fármacos hipometabolizantes, activadores de AMPK, al diluyente de congelación base, no mejora la viabilidad espermática, la integridad acrosomal, ni la motilidad espermática ya obtenida con HM-0, a excepción de AICAR que a -80ºC aumenta el porcentaje de acrosomas intactos.