Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina. Carrera de Especialización

Transcripción

1 Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina Carrera de Especialización en Bacteriología a Clínica

2 Aplicación n de las Técnicas T de Biología Molecular en el Laboratorio de Bacteriología

3 ADN Genoma bacteriano Cromosómico Extracromosómico ARN Plásmidos Transposones Integrones ARNm ARNt ARNr

4 ADN

5 Plásmidos Autorreplicantes Tamaño y número variable Heredables y Transferibles Codifican funciones no esenciales Factor F (Pili sexuales) Factores R (Resistencia a antibióticos) Plásmidos Col (Bacteriocinas) Plásmidos de virulencia (Toxinas) Plásmidos metabólicos (Enzimas)

6 Transferencia de plásmidos Conjugación

7 Transposones Secuencia de ADN que puede saltar de un sitio a otro del ADN Pueden moverse dentro del ADN cromosómico, entre plásmidos o pasar de un plásmido al ADN cromosómico Transposón simple o secuencia de inserción (IS) Transposón compuesto (Tn)

8 Integrones Los integrones son plataformas de ensamblaje que incorporan cassettes genéticos y los convierten en genes funcionales asegurando su correcta expresión. Los integrones no son autotranferibles, pero al asociarse a transposones pueden moverse. Estructura Promotor de la integrasa Gen Intl1 que codifica la integrasa o recombinasa (Cataliza una recombinacion sitioespecifica) Zona atti (donde se insertan las IS) Promotor (uno o dos) para los genes de resistencia insertados Gen qaceδ (Resistencia a compuestos de amonio cuaternario) Gen sul1 (Resistencia a sulfonamidas) Zona de lectura abierta Orf 5 (Función desconocida)

9 ARN Un esqueleto de azúcares y fosfatos ARN tiene uracilo en vez de timina. El uracilo se une a la adenina ARN es una cadena simple Tres tipos: ARNm, ARNt y ARNr (70s)

10 Dogma Central de la Biología Molecular

11 Variaciones fenotípicas Cambios en las características de una bacteria sin que se altere su genoma Pueden ser Morfológicas: tamaño, forma, flagelos Cromógenas: producción o no de pigmentos Enzimáticas: producción de enzimas inducibles Patogénicas: capacidad de producir enfermedad Cepa lisa Cepa rugosa

12 Variaciones genotípicas Ocurren al azar Baja frecuencia Heredables No siempre se expresan Mutaciones Sustitución de bases Adición de bases Pérdida de bases Alteración de muchos pares de bases Translocación

13 Estudio del ADN

14 Obtención n del ADN Medios sólidos (agar) Medios Líquidos (caldos) Muestras (Clínicas, alimentos)

15 Lisis celular Lisis alcalina Ebullición Shock térmico Proteinasa K Medios tensioactivos Sonicación Lisozima

16 Extracción n del ADN Fenol/cloroformo Guanidina Sílice Separación magnética Filtración

17 Secuenciación A partir de un fragmento de ADN se determina la secuencia completa de bases

18 Enzimas de restricción Reconocen una determinada secuencia de ADN (4-10 nt más o menos) y la cortan. Se extraen de bacterias y poseen múltiples usos en Biología Molecular

19 Sondas de ADN

20 Sondas de ADN Sustancia radioactiva 32 P o 35 S Compuesto fluorescente Esteres de acridina Enzima Peroxidasa o fosfatasa alcalina Sustancias de captura Biotina (Avidina) o digoxigenina (Ac anti digoxigenina) Anticuerpos

21 Sondas de ADN Hibridación in situ (FISH) Muestra clínica + sonda marcada

22 Sondas de ADN Detección directa en muestras clínicas Neisseria gonorrhoeae Chlamydias Streptococcus Grupo A Gardnerella

23 Sondas de ADN Confirmación de cultivos Mycobacterium spp Streptococcus Grupos A y B S. aureus L. monocytogenes N. gonorrhoeae Campylobacter spp H. influenzae

24 Sondas de ADN Detección de genes de resistencia Gen mec en Staphylococcus Betalactamasas en enterobacterias

25 Chips o arrays de ADN

26 Chips o arrays de ADN

27

28 Clonalidad Variación genotípica Variación genotípica Variación genotípica

29 Clonalidad Tipificación molecular de Acinetobacter baumannii multirresistentes aislados de pacientes internados en la unidad de terapia intensiva de un hospital de adultos Tracogna MF; Presti SE; Gariboglio Vázquez ML; Merino LA

30 Clonalidad

31 Clonalidad

32 Clonalidad

33 Aplicaciones de la PCR en el Instituto de Medicina Regional

34 1. Detección de microorganismos no cultivables o de difícil crecimiento. Mycoplasmas Chlamydias Helicobacter pylori Mycobacterium tuberculosis

35 Helicobacter pylori urea 411 pb

36 Micoplasmas urogenitales pb Mollicutes 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 311 pb 281 pb Ureaplasma Mycoplasma 100 pb ALTERNATIVA DIAGNOSTICA PARA MICROORGANISMOS DE DIFICIL AISLAMIENTO IMPLICADOS EN INFERTILIDAD MASCULINA Gómez, María V.; Deluca, Gerardo D.; Merino, Luis A.

37 2. Detección de genes de virulencia Helicobacter pylori Genes caga, vaca, baba2 Escherichia coli ETEC: genes est, elt EPEC: genes eae, bfp EIEC: gen HipA EHEC: gen eae, stx EAEC: gen AggR Vibrio cholerae Toxina CT: gen ctxa Proteína estructural de la fimbria: gen TCP Staphylococcus aureus Leucocidina de Panton Valentine: gen PVK

38 Helicobacter pylori Genotipificación de Helicobacter pylori en biopsias gástricas Medina MG, Medina ML; Lösch SL, Merino LA

39 Escherichia coli ECEI ECET ECEP ECEH ECET ECEA

40 E. coli verotoxigénica

41 Staphylococcus aureus Luk-PV Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gomez MV; Merino LA

42 4. Detección de genes de resistencia Staphylococcus gen meca Enterobacterias genes de betalactamasas Enterococcus genes vana, vanb, van C

43 Staphylococcus aureus meca Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gómez MV; Merino LA

44 Enterobacterias pb CTX-M

45 5. Detección de patógenos en alimentos o en el ambiente Salmonella Shigella Listeria Campylobacter E. coli 0157

46 Campylobacter M pb C. jejuni 364 pb C. coli Detección e identificación molecular de especies termotolerantes de Campylobacter Gariboglio Vázquez ML, Tracogna MF, Lösch LS, Merino LA

47 GRACIAS POR SU ATENCIÓN! N!