v = n 1 V max(i)[s] K m (i) + [S]

Transcripción

1 Caso 8: Cálculo de V max y K M en una mezcla de isoenzimas 55 Caso 8. Cálculo de V max y K m en una mezcla de isoenzimas (REGRESIÓN NO LINEAL Y DISCRIMINACIÓN ENTRE MODELOS)(F.J. BURGUILLO, USAL) CASO PRÁCTICO Con una preparación enzimática constituida por dos isoenzimas se realizó el siguiente estudio: 8 puntos experimentales, en el margen de concentraciones de 0.05 a 50 mm, espaciados logarítmicamente y realizándose 5 réplicas por punto (40 datos en total). Las réplicas han servido para la obtención de las desviaciones estándar correspondientes (s i) y nos van a permitir realizar una regresión no lineal con pesos estadísticos ((W i=1/s i, siendo s i la desviación estandar). Los resultados fueron (figuran en caso8.xls) : Usando el paquete SIMFIT, se trata de decidir si las dos isoenzimas de la mezcla tienen el mismo comportamiento cinético (la misma V max y K m) o distinto comportamiento (diferentes V max y K m). TEORÍA La cinética de reacciones catalizadas por varios isoenzimas que actúan sobre un mismo sustrato, se interpretan en muchos casos como la suma de ecuaciones de Michaelis-Menten: v = n 1 V max(i)[s] K m (i) + [S] El objetivo de este ejercicio es ajustar este modelo a los datos experimentales. Para ello empezaremos probando a ver si es suficiente con un ajuste n=1 (grado 1 del modelo), lo que significaría que las isoenzimas tienen el mismo comportamiento cinético y bastaría

2 56 Caso 8: Cálculo de V max y K M en una mezcla de isoenzimas determinar 1 par de valores V max y K m. Si el ajuste no nos parece bueno, probaremos a ajustar el grado del modelo (n=), lo que significaría que las isoenzimas tienen distinto comportamiento cinético y en ese caso es necesario determinar pares de valores V max y K m ( V max (1), K m(1), V max (), K m() ). La función a ajustar es no lineal en los parámetros, por lo que habrá que proceder a un ajuste por regresión no lineal. La desviación estándar asociada a cada concentración de sustrato se puede calcular en este caso a partir de las réplicas. Como es sabido, dados n pares de observaciones (x 1,y 1), (x,y ), (x 3,y 3),... (x n,y n), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ, consiste en calcular el valor θ que minimice la suma de cuadrados de los residuales: WSSQ = w i (y i f(x i, )) donde WSSQ es la llamada suma de residuales al cuadrado con pesos estadisticos (weighted sum of squares). Siendo w i el peso estadístico calculado como el inverso de la varianza de la medida ( ). w i =1/ i En el caso práctico que nos ocupa, hablaríamos de una Regresión no lineal con pesos estadísticos, tomando los pesos como w i =1/s i, siendo s i la desviación estándar de la muestra de 5 réplicas que tenemos a cada valor de concentración de sustrato. Cuando la ecuación es no lineal en los parámetros, hay que utilizar métodos numéricos iterativos para encontrar el valor de los parámetros (θ) que minimizan WSSQ. Estos métodos son de dos tipos: Métodos de búsqueda directa y métodos de gradiente. SIMFIT utiliza una combinación de ambos métodos en secuencia (de búsqueda primero y luego de gradiente). PROCEDIMIENTO PASO A PASO 1.- Abrir el archivo Excel y copiar y pegar los datos a través del portapapeles Abrir el archivo Excel denominado caso8.xls, seleccionar y copiar al portapapeles las 3 columnas numéricas para importarlas a SIMFIT en su momento con el botón Paste..- Ajuste de los datos a la ecuación de Michaelis-Menten Seleccionar en el menú principal la opción Fit y en el submenú que se despliega a continuación pulsar en la opción Sum of 1 to n Michaelis-Menten models - mmfit. A continuación aparece una pantalla con cuatro opciones: Provide details, Substrate mode, Inhibitor mode y Quit. Lo recomendable sería echar primero una ojeada rápida al tutorial de Provide details para entender las características de los posibles modelos a ajustar. Al finalizar, se pulsa en Substrate mode y da comienzo el ajuste. En este modo normal, la ecuación general o modelo a ajustar sería la siguiente:

3 Caso 8: Cálculo de V max y K M en una mezcla de isoenzimas 57 v = n 1 V max(i)[s] K m (i) + [S] (1) donde n se llama grado del modelo (cuando n=1 tendremos la ecuación de Michaelis-Menten habitual, cuando n= tendremos la suma de ecuaciones de Michaelis-Menten ( isoenzimas)...etc). Primero deberemos importar los valores que tenemos copiados en el portapapeles. Para ello seleccionamos New data > Paste > OK > Open, e iniciamos el análisis seleccionando Analyse the current data set. A continuación se pregunta el Lowest model order to fit, en nuestro caso aceptaremos el 1 que viene por defecto. Luego el programa pregunta el Highest model to fit, a lo que contestaremos (por defecto ya viene ), ya que ahora deseamos comparar el ajuste de la ecuación (1) con 1 término con el ajuste a la ecuación (1) con términos. La pantalla siguiente nos ofrece diferentes métodos para elegir las estimas iniciales, seleccionaremos la que viene por defecto (Short Random search). A continuación aparece un submenú para elegir los resultados del análisis que uno desea, dejaremos seleccionados los que vienen por defecto. Realizado el ajuste, el programa presenta en pantalla los parámetros encontrados, la matriz de correlación de los parámetros, seguida de la tabla que muestra los datos experimentales junto a los valores teóricos ajustados. Por último, aparece una tabla con toda la estadística asociada al ajuste. Todo ello referente al modelo de grado 1 (n=1), es decir 1 sóla ecuación de Michaelis-Menten. Seguidamente el programa muestra diferentes opciones para representar los datos, elegiremos Original plot axes. Vista la gráfica anterior sería interesante pulsar Cancel y, al regresar al menú de tipos de representación, podríamos elegir ahora la ópción Lineweaver-Burk. El programa preguntará primero Select components for linear extrapolation, seleccionaremos Component (line?). Se obtendrá la conocida representación doble inversa de 1/v frente a 1/[S], que es líneal en este caso como es sabido. A continuación deberiamos pulsar Cancel y, al regresar al menú de tipos de representación, podríamos elegir ahora la ópción Eadie-Hofstee. El programa preguntará de nuevo si queremos extrapolar hasta los ejes los símbolos o la línea, seleccionaremos la línea. Se obtendrá la conocida representación de v frente a v/[s], que es también líneal en este caso como es conocido. Para terminar la sesión, pulsar Cancel > Cancel plot. A continuación, comienza a realizarse automáticamente el ajuste al modelo de grado (n=), es decir al modelo suma de ecuaciones de Michaelis-menten. Seguiremos la misma secuencia de pasos que los vistos anteriormente. Cuando se obtiene la representación gráfica de los ajustes superpuestos, además de poder ver dicha representación en distintos espacios (Directo, Lineweaver-Burk, Eadie-Hostee, etc.). También se puede hacer una representación aún mas interesante, que es suporponer la deconvolución del ajuste a Michaelis-Menten a las funciones que lo forman, con el fín de apreciar la contribución de cada función al ajuste global, para ello basta con pulsar Cancel y luego Plot the deconvolution.

4 58 Caso 8: Cálculo de V max y K M en una mezcla de isoenzimas 3.- SOLUCIONES La ecuación que mejor se ajusta a los datos es la de grado ( ecuaciones de Michaelis Menten). En la siguiente tabla aparecen reflejados los valores de V max y K m : Las gráficas con los ajustes superpuestos a 1 y Michaelis-Menten resultan ser en el espacio directo y de Eadie-Hofstee las siguientes: La gráfica de deconvolución de las dos ecuaciones de Michaelis-Menten es :

5 Caso 8: Cálculo de V max y K M en una mezcla de isoenzimas 59