Caso 201 : Recta de calibrado para análisis de fosfato (Regresión lineal sin pesos estadísticos) (F. J. Burguillo, USAL)
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- Catalina Torregrosa Alcaraz
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1 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato 1 Caso 201 : Recta de calibrado para análisis de fosfato (Regresión lineal sin pesos estadísticos) (F. J. Burguillo, USAL) CASO PRÁCTICO Uno de los procedimientos mas utilizados para analizar fosfato en disolución es el método de Allen (Biochem. J. (1940), 34, 858), que implica la adición de un exceso de molibdato amónico a la muestra acidulada con ácido perclórico, reducción del fosfomolibdato formado a Mo 3+ con 2,4 diaminofenol y metabisulfito sódico y lectura de la absorbancia a 680 nm. En un laboratorio, se han preparado unos patrones de fosfato potásico y se han medido las correspondientes absorbancias en un espectrofotómetro, obteniéndose los siguientes resultados: [Fosfato] / mm Absorbancia Se desean analizar estos datos con el fin de construir una recta de calibrado del tipo Ley de Beer con un término constante C de línea base (absorbancia de los reactivos): [ fosfato] C Absorbanci a = ε l + que en términos matemáticos podríamos escribir como la ecuación de una recta: TEORÍA y = m x + C El ajuste de una recta a unos datos se realiza habitualmente mediante el método de optimización de los mínimos cuadrados. En el caso de una función lineal en los parámetros, como es la recta, este procedimiento se denomina regresión lineal. En general, la regresión de una variable dependiente y frente a una variable independiente x es de la forma: y = f (x, θ ) + ε donde θ es un vector de parámetros desconocidos e independientes (θ 1, θ 2, θ 3,... θ P ) y ε es el error experimental. Como es sabido, dados n pares de observaciones (x 1,y 1 ), (x 2,y 2 ), (x 3,y 3 ),... (x n,y n ), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ consiste en calcular el valor de θ que minimiza la suma de cuadrados de los residuales: ( y f (, )) 2 donde SSQ es la llamada suma de residuales al cuadrado (sum of squares). SSQ = θ i x i Para que el ajuste por mínimos cuadrados tenga las propiedades estadísticas adecuadas, es necesario que los errores ε i sigan una distribución normal de media cero (medidas no sesgadas) y varianza constante (medidas con misma precisión). Si la varianza de los errores no es constante hay que utilizar la estrategia de los mínimos cuadrados ponderados (regresión
2 2 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato lineal con pesos estadísticos), que consiste en calcular el valor de los parámetros θ que minimiza la suma de los residuales al cuadrado ponderados con sus pesos estadísticos: ( y f ( xi, )) 2 donde los pesos w i se toman igual al inverso de la varianza asociada a cada valor y i : WSSQ = w θ w i = i 2 1 σ i i y donde WSSQ significa ahora suma de residuales al cuadrado ponderados (weighted sum of squares). Los métodos numéricos para calcular el valor de θ que minimiza SSQ o WSSQ dependen principalmente de la forma de la función f respecto a los parámetros θ : a) Si f es lineal en los parámetros, es decir cuando considerada la x como constante la dependencia de y con los parámetros es combinación de sumas y restas (como ocurre en la ecuación de una recta o de un polinomio), entonces la solución es única, exacta y sus propiedades estadísticas están bien establecidas. En estas condiciones la técnica se denomina Regresión lineal (que es la que se utiliza en el presente caso práctico, ya que la ecuación a ajustar es una línea recta). b) Si f es no lineal en los parámetros, es decir, considerada la x como constante la dependencia de y con los parámetros es mas compleja que combinación de sumas y restas (como ocurre en las ecuaciones con exponenciales o con potencias), entonces la solución es aproximada, se obtiene por métodos iterativos y sus propiedades estadísticas son también aproximadas. En estas condiciones la técnica se denomina Regresión no lineal (se utilizará en otros ejercicios mas adelante) La estrategia de ponderar los residuales con sus respectivos pesos estadísticos, se puede aplicar tanto a la regresión lineal como a la no lineal. En el caso práctico que nos ocupa ahora hablaríamos, por tanto, de una Regresión lineal sin pesos estadísticos. Procedimiento paso a paso 1.- Crear un archivo con los datos Seleccionar en el menú principal la opción Archivo > Nuevo archivo tipo ajuste de curvas MAKFIL, para acceder al siguiente cuadro de opciones que nos ofrece varias posibilidades para introducir los datos:
3 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato 3 Las opciones hacen referencia a si el usuario dispone o no de la desviación estándar asociada a cada punto. En el caso actual, en el que no conocemos los valores de s, conviene elegir las dos opciones que vienen activadas por defecto, es decir el introducir las x en orden creciente y que las s sean consideradas iguales a 1 (desviación estándar constante pero desconocida (ajuste sin pesos estadísticos)). A continuación aparece un cuadro de diálogo donde se escribirá el nombre del directorio y del archivo donde se guardarán los datos (por ejemplo: c:\curso\caso201.dat) Después de pulsar OK deberá ir contestando a preguntas sencillas que va haciendo el programa, incluida la del número de pares de datos que se desean introducir, finalmente se desplegará la siguiente pantalla donde se teclean los datos: Al finalizar se pulsa el botón Aceptar. A continuación, aparece el siguiente menú de opciones por si se desea representar los datos, editar algún valor..etc:
4 4 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato por último se guarda el archivo seleccionando Guardar.Para finalizar MAKFIL le indicará que a terminado su ejecución y le preguntará se desea volver a ejecutarlo, entonces diga "NO". 2.- Ajuste de los datos a una recta Seleccionar en el menú principal la opción Ajustes, seguida de la opción Lineal; múltiple lineal y modelos GLM y finalmente Ejecutar. A continuación se despliega un submenú con todas las opciones disponibles: Empezaremos seleccionando Nuevos datos para importar nuestro archivo de datos (c:\curso\caso201.dat), seguidamente seleccionaremos la opción Regresión lineal simple (recta) Automáticamente el programa hace el ajuste de regresión lineal por mínimos cuadrados y muestra la siguiente tabla de resultados:
5 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato 5 En esta tabla, aparece el valor del parámetro, el error estándar (desviación estándar) asociado a ese parámetro y los límites de confianza al 95 % para el parámetro (horquilla de confianza). La tabla muestra, en la última columna de la derecha, la probabilidad p de que el parámetro sea redundante, es decir que sea tan próximo a cero que no esté justificada su inclusión en la ecuación. Cuando p< 0.05 se considera que el parámetro es significativamente distinto de cero (esta prueba se realiza con el test t de Student cuyo fundamento se verá mas adelante). Finalmente, la tabla incluye, en la última línea, el coeficiente de correlación al cuadrado (R 2 ) y el coeficiente de correlación (R). En conclusión, la ecuación de la recta cuando la concentración de fosfato se expresa en mm sería: [ ] Absorbancia = 3.73 Fosfato + siendo las desviaciones estándar de los parámetros de (para la pendiente 3.73) y de (para la ordenada en el origen 0.157), y siendo el coeficiente de correlación de A continuación, aparece un menú en el que se eligen las opciones de salida deseadas: para empezar, basta con que veamos la curva ajustada (mas adelante haremos predicción inversa (calibración) ) Seguidamente el programa muestra diferentes opciones para representar los datos, elegiremos Gráfica ejes originales :
6 6 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato El programa muestra, a continuación, una gráfica en la que figuran los puntos experimentales y el ajuste de la recta a los puntos : Esta gráfica, convendría editarla para rotular el título, las leyendas de los ejes...etc, para lo cual se pincha en Editar y aparece el siguiente menú:
7 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato 7 Se van seleccionando las opciones deseadas y editando la gráfica de manera habitual. Al finalizar, se pica en la opción Ver/guardar y aparecerá la gráfica en su forma final: Para imprimir esta gráfica se pica en el botón Windows (impresora bajo Windows) y aparece el siguiente menú:
8 8 Caso 201: Recta de Calibrado para fosfato en el que basta seleccionar Imprimir para obtener la copia impresa. En el caso de disponer de una impresora Laser-PostScript, se puede imprimir también a través de un controlador PostScript, de mayor calidad, al que se accede picando en el botón PS.
WSSQ = w i (y i f(x i, )) 2
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