Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales en Cinética. Discriminación entre modelos, cálculo de pendientes y asíntotas (F.J.

Transcripción

1 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 1 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales en Cinética. Discriminación entre modelos, cálculo de pendientes y asíntotas (F.J. Burguillo) CASO PRÁCTICO La siguiente tabla de datos corresponde a un estudio de hidrólisis de p-nitrofenil palmitato catalizada por la actividad lipásica de células enteras de la levadura Yarrowia lipolytica. Se midió, a distintos tiempos de reacción, la absorbancia de la muestra debida al p-nitrofenol liberado (4 nm), previo congelado de la reacción al tiempo de muestreo y centrifugación de las células que interferirían en la medida de absorbancia. Se hicieron 3 réplicas a cada tiempo y el resultado se expresó en velocidad actual (mmol/min/mg Pesohumedo de células). La variación de la velocidad actual con el tiempo, presenta la forma de una curva creciente que se puede interpretar con diferentes ecuaciones que se analizan a continuación en el apartado de teoría. t (horas) Velocidad El objetivo de este ejercicio es ajustar estas ecuaciones a los datos experimentales y discriminar, a partir de la bondad de los ajustes, cual de ellas proporciona el mejor ajuste. Encontrada la curva de ajuste, la derivada analítica de dicha función a tiempo cero será la velocidad inicial del proceso. Teoría Los modelos habituales para el ajuste de curvas cinéticas son los siguientes; 1. Modelo lineal... (1 ó 2 parámetros) f(t)=bt + C Cuando los datos de la cinética estudiada siguen un comportamiento prácticamente lineal este es el modelo a utilizar. 2. Modelo cuadrático... (2 ó 3 parámetros) f(t)=at + Bt 2 + C Es útil cuando se dispone unicamente de los datos iniciales de la cinética estudiada y se quiere estimar con ellos los datos de velocidad inicial.

2 2 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales Modelo exponencial (2 ó 3 parámetros) f(t)= [1 1 ( t) ]+C Util para estimar tanto velocidades iniciales de reacción como asíntotas horizontales a tiempos finales. Proporciona buenos ajustes cuando se dispone de un seguimiento completo de la reacción. 4. Modelo de Hill/Michaelis-Menten (2, 3 ó 4 parámetros) f(t)= V max t n Km n + t n Sobre todo es útil para estimar asíndotas horizontales en los tiempos finales de una cinética. si n= 1 también puede dar una buena estima de las velocidades iniciales de la reacción. + C 5. Modelo de fase de latencia/fase exponencial (3 ó 4 parámetros) f(t)=p t + Q [1 1 ( R t) ]+C Este modelo es adecuado para estimar las velocidades iniciales de reacción, tiempos de inducción o latencia, asíndotas lineales inclinadas, etc. Es un modelo que ajusta bien datos provenientes de cinéticas con una fase de inducción más o menos larga, seguida de una fase exponencial brusca. El programa INRATE del paquete SIMFIT realiza todos estos ajustes automáticamente, proporcionando, para cada uno de los modelos, una serie de tablas y tests estadísticos que permiten discriminar cual es el mejor modelo de ajuste. Así mismo, calcula la velocidad inicial y las asíntotas respectivas sobre cada ecuación ajustada. Como es sabido, dados n pares de observaciones (x 1,y 1 ), (x 2,y 2 ), (x 3,y 3 ),... (x n,y n ), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ, consiste en calcular el valor θ que minimice la suma de cuadrados de los residuales: WSSQ = w i (y i f(x i, )) 2 donde WSSQ es la llamada suma de residuales al cuadrado con pesos estadisticos (weighted sum of squares). Siendo w i el peso estadístico calculado como el inverso de la varianza de la medida ( 2 w i = 1/ i ). En el caso práctico que nos ocupa, hablaríamos de una Regresión no lineal con pesos estadísticos, tomando los pesos como 2 w i = 1/s i, siendo la desviación estándar de la muestra de las 3 réplicas que tenemos a cada tiempo. s i PROCEDIMIENTO PASO A PASO 1.- Crear archivo con los datos (o abrir en su momento C:\curso\caso314.dat )

3 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales Ajuste de los datos a las diferentes ecuaciones Seleccionar en el menú principal la opción Ajustes y en el submenú que se despliega pulsar en vel. iniciales/tiempos de inducción/asíntotas (inrate). A continuación aparece una pantalla con opciones: Seleccionar Ejecutar. En el menú de entrada de datos: Seleccionar Introducirlos desde archivo Abrir el archivo: c:\curso\caso314.dat Usa esta fila?, contestar Sí. A continuación aparece la siguiente pantalla con los modelos: dejar las opciones que hay por defecto y marcar, además, la opción f()=: Forzar la curva de ajuste a pasar por el origen a t= (C=). A continuación van saliendo los resultados de todos los ajustes. Para ir avanzando, basta con ir pulsando, según sea necesario, los botones: OK, Sí o Cancelar. Al terminar todos los ajustes pulse Salir para abandonar el programa.

4 4 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 3.- SOLUCIONES 1) El mejor ajuste es el del modelo 3: 2) Los valores de los parámetros y de la velocidad inicial son: 3) La gráfica del ajuste al modelo 3 y la tangente de velocidad inicial es:

5 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 5 4) Si se quiere editar la gráfica anterior se puede pulsar en Advanced y luego en Transfer the control to SIMPLOT, aparecerá un entorno muy poderoso de edición, en el que basta pulsar en el botón deseado y seleccionar lo que se requiere, por ejemplo para dibujar las barras de error hay que pulsar en Data y luego en Error bars y seleccionar el tipo de barra deseado.