Efectos del Ejercicio Físico sobre Señales Intracelulares e Intramusculares y sus Acciones

Transcripción

1 Efectos del Ejercicio Físico sobre Señales Intracelulares e Intramusculares y sus Acciones Dalina García Pan (Bioq.), Carlos Saavedra MSc. No son muchos los años en que las explicaciones a un sin número de fenómenos fisiológicos encuentran su sitio en la biología molecular. Desafortunadamente el incremento desmesurado de las enfermedades crónicas modernas a provocado por fortuna un desarrollo importante en esta área del conocimiento. Por muchos años el tejido adiposo nunca fue considerado y hoy se saben aspectos impensados sobre el, llegándolo a considerar como un importante órgano endocrino. El tejido muscular por muchos años ha sufrido, por parte de la medicina un abandono casi total, sin embargo hoy en el se encuentra el origen directo o indirecto de múltiples alteraciones cardiovasculares y metabólicas. No olvidemos que un infarto al miocardio es producto de alteraciones en los lípidos y el gran responsable de su regulación es el tejido muscular, no olvidemos que frecuencia cardiaca y presión arterial se alteran mucho mas en sujetos con mala capacidad funcional del tejido muscular que en aquellos que tienen una buena capacidad de contracción y de trabajo de este tejido. El presente articulo desea introducir al lector a un dominio que con seguridad será el mas citado por la literatura científica y pretende comenzar a explicar cuales son los mecanismos intracelulares e intramusculares que hacen que el ejercicio físico produzca acciones especificas en las propias células musculares y células anexas, ya que estas parecen ser la clave en la prevención y tratamiento de múltiples enfermedades. Estas adaptaciones metabólicas que ocurren en el músculo esquelético a través del ejercicio físico involucran cambios en la expresión de proteínas que guardan relación con el transporte de glucosa y su respectivo metabolismo. Aproximadamente después de 16 horas de haber efectuado el esfuerzo la expresión de una proteína, como por ejemplo GLUT4 se incrementa en dos veces, permitiendo de esta forma una restitución de los depósitos de glucógeno utilizados y permitiendo un transpaso de la glucosa plasmatica al músculo. Este simple fenómeno implica la fosforilacion de muchas proteínas quinasa que directa o indirectamente provoca modificaciones en la sensibilidad a la insulina, proceso que da origen a múltiples síndromes metabólicos que aquejan a la sociedad actual. De esta forma el ejercicio físico que permite una alta expresión de adaptación o plástica de este tejido estaría contribuyendo a la prevención y al tratamiento de enfermedades graves como la diabetes tipo II, no insulino dependiente. Finalmente estos procesos se asocian a una hipertrofia compensatoria del tejido muscular que incluye mecanismos de regulación celular, como la transcripción, acumulación y translación de RNAm permitiendo así la síntesis de proteínas funcionales y estructurales que en definitiva hacen al tejido muscular mas capaz, mas eficiente y muy efectivo en la regulación del equilibrio entre los substratos que se encuentran en compartimientos intra y extra musculares. Al parecer en este fenómeno se sientan las bases del rol del ejercicio físico en la prevención y elevación

2 de los niveles de salud. Nota: Este trabajo ha sido producto de una revision efectuada por Dalina Garcia Pan quien es titulada en Bioquimica de la Universidad de Buenos Aires, especializada en Nutricion Clinica y que orienta sus estudios hacia las ciencias de la actividad fisica bajo la tutoria de Carlos Saavedra MSc. Resumen El ejercicio físico es un importante estimulo para la regulación de múltiples procesos metabólicos y transcripcionales en el músculo esquelético. Por ejemplo, el ejercicio incrementa la captación de glucosa, la perfusion capilar, la velocidad de síntesis de glucógeno, la sensibilidad a la insulina, lleva a una remodelacion estructural de las células y a una hipertrofia compensatoria. El propósito de este articulo es incursionar sobre los mecanismos intracelulares y las proteínas señal intracelulares que intervienen y regulan estos eventos en el músculo esquelético. Las proteínas señales son proteínas que se encuentran en el citosol de la célula y se encargan de llevar la información desde la superficie de la célula hasta el núcleo. Este mecanismo es gatillado cuando algún ligando (ej. insulina) se une a su receptor presente en la membrana plasmatica de la célula (ej. el receptor de insulina) produciéndose la activación del receptor que es transmitida a modo de cascada a través de las proteínas señal, una proteína señal activa a otra y así sucesivamente hasta llegar a activar proteínas reguladoras de genes en el núcleo (llamadas factores de transcripción) y así provocar la transcripción del ADN a ARNm, con la consiguiente síntesis de proteínas. La activación de estas proteínas señal es mediante fosforilacion en distintos aminoácidos, generalmente tirosina, serina o treonina.. Las proteínas señal mas destacables relacionadas con este tema, son algunas MAP Kinasas: ERK1/2, p38 y JNK, (Las MAP kinasas son proteínas kinasa activadas por mitogenos, un mitogeno es un inductor de proliferación y diferenciación celular, por ejemplo insulina, factores de crecimiento como IGF-1.) y otras proteínas señal como AMP kinasa, Akt, GSK3 y p70s6k. Estas regulan en parte, la captación de glucosa, síntesis de glucógeno, transcripción y regulación genica, síntesis de proteínas e hipertrofia muscular. En cuanto a los mecanismos intracelulares, el aumento en la sensibilidad a la insulina post ejercicio, parece deberse a la disminución en el contenido de glucógeno en la célula muscular y al aumento en la perfusion capilar, asociados al ejercicio y no a un incremento en la cascada de señalización de la insulina. En algunas de las proteínas señal intracelulares, aplicando distintos protocolos de entrenamiento con ejercicios de sobrecarga, se evidencia que las involucradas en la respuesta molecular y celular que llevan a la hipertrofia compensatoria, tienen un periodo refractario, en el cual de no mediar reposo, no es posible que cumplan con su función de manera eficiente. Lo que permitiría manipular la variable intervalo entre carga y reposo, de modo de obtener un entrenamiento mas eficiente.

3 Introducción El ejercicio físico es un importante estimulo para la regulación de múltiples procesos metabólicos y transcripcionales en el músculo esquelético. Por ejemplo, el ejercicio incrementa la captación de glucosa, la perfusion capilar, la velocidad de síntesis de glucógeno, la sensibilidad a la insulina, lleva a una remodelacion estructural de las células y a una hipertrofia compensatoria. Todos estos procesos ocurren en respuesta a modificaciones producidas por el ejercicio en diversos fenómenos tanto autocrinos, paracrinos y sistemicos, como cambios en la concentración de substratos responsables de la producción de energía de la célula muscular. Estos fenómenos a su vez juegan el rol de mensajeros en la respuesta al ejercicio, y van a intervenir y regular múltiples sistemas de transduccion de señales intracelulares en la célula muscular, responsables de regular los diversos procesos metabólicos y transcripcionales (transcripción del DNA a RNA y consecuente síntesis de proteínas) en respuesta al ejercicio. Algunos mensajeros en la respuesta al ejercicio: ph, ATP/ADP, Ca Durante la contracción, las fibras musculares generan estímulos mecánicos, lo que a su vez produce la liberación de numerosos metabolitos. Esto se acompaña de cambios en la temperatura, el ph intracelular, cambio en la relación ATP/ ADP, cambios en la concentración intracelular del Ca y otros metabolitos que podrían actuar como mensajeros en la regulación del funcionamiento celular con el ejercicio. El Ca, regula numerosas proteínas intracelulares, incluyendo calmodulina kinasa, proteína kinasa C (PKC) y calcineurina que son importantes intermediarios en las señales de transduccion intracelular. En la matriz extracelular que interacciona con las células musculares mediante integrinas citoesqueletales también experimenta cambios. Respuestas autocrinas, paracrinas y sistemicas, Los efectos del ejercicio físico en la regulación de los fenómenos anabolicos y el metabolismo del músculo esquelético, están mediados también a través de vías de señalización receptor-ligando. El ejercicio causa potentes respuestas sistemicas, las que incluyen la liberación, entre otras de catecolaminas y otras hormonas. Estas activan receptores de la superficie celular específicos. Un buen ejemplo de este tipo de mecanismo es el incremento en la liberación de adrenalina que mediante la estimulación de receptores B adrenergicos, lleva a la activación de Adenilato Ciclasa, con el consiguiente incremento de AMPc y activación de PKA. Los neurotransmisores relacionados con la calcitonina, el factor neurotrofico ciliar y la neurogulina son ejemplos de mensajeros extracelulares liberados por el nervio motor, los cuales pueden también estimular cascadas de señales intracelulares. La contracción muscular puede también activar receptores a través de mecanismos autocrinos y paracrinos. La elongacion muscular activa vías de señalización intracelular por liberación de factores de crecimiento en forma autocrina, por ej. en el

4 miocito cardiaco mediante angiotensina II. Uno de estos factores es IGF-1 (factor de crecimiento semejante a la insulina) y FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), ambos se incrementan en la contracción muscular, activando vías de señales por mecanismos autocrinos. Además en la contracción muscular, también se libera NO (oxido nítrico) que regula mecanismos, entre ellos el mas importante el de vasodilatacion que esta mediados por GMPc.(un mensajero químico). Como podemos ver, el ejercicio es un complejo estimulo que por medio de diversos mensajeros, Ca, ph, temperatura, hormonas, neurotransmisores, oxido nítrico, factores de crecimiento, modificación en substratos energéticos, etc los cuales van a regular múltiples sistemas de transduccion de señales intracelulares los que a su vez pueden actuar sobre numerosos procesos transcripcionales y metabólicos dentro de la célula muscular. Proteínas señal intracelulares MAP Kinasas Las MAP Kinasas son proteínas quinasas activadas por mitogenos, (un mitogeno es un inductor de proliferación y diferenciación celular, por ejemplo insulina, factores de crecimiento como IGF-1) que también son denominadas ERK o quinasas reguladas por señales extracelulares. Estas MAP kinasas, son activadas por una gran variedad de señales (insulina, factores de crecimiento, factores de stress ambiental) y transmiten estas señales fosforilando numerosos substratos, obteniéndose como resultante varios efectos biológicos. Algunos de ellos son inducción de proliferación, diferenciación celular, hipertrofia, inflamación, apoptosis, metabolismo de carbohidratos y transcripción de genes. La activación de estas proteínas, es mediada por receptores del tipo tirosina quinasa, como el receptor de insulina o los receptores B adrenergicos, que activan proteína G o proteína Ras, estas forman parte de la cascada de señalización, previas a MAP kinasas.

5 MAP kinasas activadas por el ejercicio El ejercicio físico activa MAP kinasas: ERK ½, JNK y p38, las mismas son proteínas señal de distintas cascadas de la familia MAP kinasas, que son activadas por mecanismos aun no del todo claros, pero independientes de la via tradicional receptor-ligando. ERK ½, (kinasas activadas por señales extracelulares uno y dos) ERK ½ son MAP Kinasas (ERK 1 y ERK 2), activadas por MAP Kinasa Kinasa ½ (MEK 1 y MEK 2), que a su vez es activada por Raf1 que es una MAP Kinasa Kinasa Kinasa (MAPKKK). El ejercicio y la contracción incrementan la actividad de MEK ½ y Raf1, ambas están upstream (por encima, previo a) de ERK ½. La activación resultante de ERK ½ es de manera rápida y transitoria. Downstream (por debajo, posterior a) de ERK ½ activadas por el ejercicio han sido identificadas RSK2 (90-kDa ribosomal S6 kinase 2)y MSK ½ (mitogen and stress- activated protein kinase). Se ha estudiado el incremento de activación de ERK ½ en sujetos ejercitados en bicicleta con una pierna sola, comparando con la pierna contralateral como control, y se observo que la activación de ERK ½ en respuesta al ejercicio es de manera local, es decir es un fenómeno tejido especifico, mas que un efecto sistemico. Las moléculas involucradas en esta estimulación tejido especifica permanecen aun sin delucidar. Se sabe que la vía clásica mediante Receptor tirosina kinasa, involucrando Shc, Grb2, IRS-1 puede descartarse como señal upstream de esta regulación, ya que no se ha observado fosforilacion ni incremento de estas proteínas cuando se

6 incrementa la actividad de ERK ½. JNK, (c-jun NH2-terminal kinase) Es una MAP Kinasa, activada por las MAP Kinasa Kinasa 4 y 7, a su vez activada por una MAP Kinasa Kinasa Kinasa. Se ha observado la activación de la cascada de señales JNK en humanos en respuesta al ejercicio efectuado en bicicleta ergometrica, en extensión de rodillas mediante contracción excéntrica y concéntrica de cuadriceps y en pruebas de maratón. La activación de JNK por el ejercicio es sostenida, se mantiene durante el ejercicio y esta asociada con la rápida inducción de genes tempranos, como c-fos y c-jun, por interacción directa con estos factores transcripcionales, regulando así la transcripción genica, generándose posiblemente de esta forma, proteínas del tipo estructural o funcional.p38, Es una MAP Kinasa, activada por MAK Kinasa Kinasa 3 y 6, a su vez activada por otra MAP Kinasa Kinasa Kinasa. Hay 3 isoformas a, b y d (alfa, beta y gamma). a y b se encuentran en cualquier tejido, mientras que d es exclusiva del músculo esquelético y es la isoforma mayormente regulada por el ejercicio físico. Se ha observado un incremento en la activación de la cascada de señales p38 en ejercicio ergometrico y en pruebas de maratón. Evidenciadose que p38 esta involucrada en la regulación de la captación de glucosa debida a la contracción del músculo esquelético, pero aun no están claros los mecanismos por los que se activa p38 con el ejercicio. La activación de estas MAP Kinasas con el ejercicio podría estar comandada por mecanismos sistemicos, autocrinos o paracrinos, así como cambios en el nivel de substratos responsables de la producción de energía en la célula muscular. Los posibles substratos de estas MAP Kinasas en el músculo esquelético, pueden encontrarse tanto en el citosol como en el núcleo. A nivel citosolico se han identificado: RSK (90-kDa ribosomal S6 kinase), MSK (mitogen and stress- activated protien kinase), MNK (MAP kinase- interacting kinase), todas ellas proteínas con actividad enzimática kinasa. A nivel nuclear: ATF-2 (activating transcription factor 2), CHOP (CCAAT/enhancer-binding homologous protein), CREB (AMPc-dependent response element-binding protein), MEF2 (myocite enhancer-binding factor 2), c-fos, c-jun, Elk-1, entre otros, todos ellos factores transcripcionales. De este modo, vemos que la activación de estas MAP Kinasas, puede llevar, por interacción directa con factores transcripcionales o debido a la fosforilacion y consiguiente activación de distintos substratos citosolicos, que por translocacion al núcleo y fosforilacion de factores transcripcionales, a la transcripción de genes como respuesta aguda del músculo esquelético al ejercicio, y a largo plazo a adaptaciones crónicas debidas a una regulación genica.

7 AMP kinasa Es una proteína señal básica en la regulación de múltiples procesos metabólicos y anabolicos en el músculo esquelético. AMP kinasa detecta los niveles de substratos energéticos en la célula. AMP kinasa es sensible a la disminución de los depósitos de energía de la célula y provoca un switch hacia vías de generación de ATP. La AMP kinasa es activada por el incremento en la relación AMP / ATP y creatina fosfato. Los substratos que son sensibles a la acción de AMP kinasa en diversos tejidos incluyen: Acetil-CoA Carboxilasa (ACC), 3-hidroxi-3metil glutaril CoA reductasa, Glicerofosfato aciltransferasa, Oxido nitrico sintetasa endotelial (enos), 6-fosfo fructo 2-quinasa, lipasa hormono sensible y IRS-1. La actividad contractil modifica los niveles energéticos en el músculo esquelético y dependiendo de la intensidad de la contracción puede haber una significativa disminución en la concentración de ATP y de fosfo creatina. De este modo, es decir, con las variaciones de nivel de estos substratos, el ejercicio actúa como un estimulo fisiológico de AMP kinasa. También, AMP kinasa interviene como mediador del transporte de glucosa cuando este es estimulado por la contracción. Esto se ha evidenciado en estudios realizados con AICAR (5 amino imidazol 4 carboxamida ribonucleosido) que es metabolizado por adenosina kinasa generando ZMP, un derivado monofosforilado con efectos similares al AMP sobre la AMP kinasa. AICAR puede estimular el transporte de glucosa en ausencia de insulina, de manera similar al efecto de la contracción. este transporte de glucosa es mediado por translocacion de GLUT 4 a la membrana plasmatica desde el

8 citosol. Las moléculas downstream de AMP kinasa que llevan a la regulación del transporte de glucosa estimulado por contracción no se conocen aun, sin embargo hay evidencias de que p38 es una de las proteínas señal downstream de AMP kinasa involucrada en la regulación del transporte de glucosa. Esta bien establecido que la sensibilidad a la insulina para el transporte de glucosa se incrementa luego del ejercicio en el músculo esquelético. Uno de los posibles mecanismos moleculares involucrados responsables de este incremento estaría relacionado con la variación en el contenido de glucógeno en la célula muscular luego del ejercicio, este mecanismo se detallara en párrafos subsiguientes. Mientras que relacionado con la actividad de AMP kinasa, se ha visto que la contracción, el tratamiento con AICAR y la hipoxia, incrementan el transporte de glucosa estimulado por insulina, esto sugiere que AMP kinasa podría ser una proteína clave en los procesos de señalización que llevan al incremento en la sensibilidad a la insulina post ejercicio. AMP kinasa también interviene en la oxidación de ácidos grasos estimulada por contracción. Tiene un rol importante en la regulación de la oxidación de los ácidos grasos durante el ejercicio. Esto ocurre a través de la fosforilacion de Acetil-CoA Carboxilasa (ACC) por AMP kinasa, resultando en la inactivacion de ACC, que lleva a una caída en los niveles de Malonil-CoA, deshinibiendo Carnitina Palmitol Transferasa con el consecuente aumento del transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria y favoreciendo así la oxidación de ácidos grasos. AMP kinasa también esta involucrada en la regulación genica, esto se ha evidenciado por tratamiento con AICAR, con el que se observa un incremento en la expresión de GLUT 4 y Hexoquinasa en fibras rojas y blancas de múltiples músculos, por activación en la transcripción de los genes correspondientes. Los mecanismos por los que AMP kinasa modula la transcripción genica aun no están claros.

9 Proteínas Señal mediadas por PI3-kinasa (fosfatidil inositol 3 kinasa) La PI3-kinasa es una proteina señal del inicio de la cascada de la insulina. La contracción y la insulina tienen efectos biológicos similares en el músculo esquelético, ambos incrementan la captación de glucosa, de aminoácidos y la síntesis de glucógeno. Una hipótesis es que la insulina y el ejercicio utilicen las mismas proteínas señal en la regulación de esos eventos metabólicos. Sin embargo, el ejercicio o la contracción muscular no incrementan la fosforilacion de tirosina ni en el receptor de insulina ni en IRS-1, primeros eslabones en la señalización de insulina. Downstream de IRS en la vía de señalización de insulina esta la enzima PI3-kinasa, que tampoco se incrementan su activación con el ejercicio. La falta de activación de estas moléculas es consistente con el hallazgo de que la insulina y la contracción utilizan diferentes proteínas señal para producir un incremento en la captación de glucosa y en la síntesis de glucógeno en el músculo esquelético. Este incremento estaría producido en la contracción a través de mecanismos independientes de PI3- kinasa, y si involucra a Akt, GSK3 y p70s6k, todas ellas downstream de PI3-kinasa. Akt Akt, proteína kinasa B. Akt es una serina/treonina kinasa que es activada por una gran variedad de factores de crecimiento de manera dependiente e independiente de PI3-kinasa. Akt en el músculo esquelético media muchos de los efectos celulares de la insulina,

10 regulando el crecimiento del músculo esquelético y su metabolismo. En experiencias realizadas con ratones, se ha observado un deterioro en el crecimiento con la deficiencia de Akt1 y con la deficiencia de Akt2 en la reducción de la captación de glucosa. Por otro lado, con técnicas de sobreexpresion de Akt, mediante inyección de DNA, se manifiesta el rol hipertrofico y de prevención de la atrofia muscular de Akt. No esta claro si el ejercicio activa Akt y la utiliza como proteína señal y genera controversia, hay estudios que así lo afirman, y la encuentran relacionada con el metabolismo de carbohidratos (interviniendo en la síntesis y repleción del glucógeno), con el incremento en la sensibilidad a la insulina por el ejercicio, en la regulación de la transcripción de genes, y en la síntesis de proteínas e hipertrofia. GSK3 GSK3, glucógeno sintetasa kinasa 3. Es una serina treonina kinasa, primer upstream de la enzima glucógeno sintetasa (GS), GSK3 fosforila e inactiva a GS, por lo tanto tiene un rol importante en la regulación del metabolismo energético, como así también en la regulación de la transcripción de genes.el ejercicio inactiva a GSK3 de manera distinta a la insulina. La insulina lo hace vía receptor de insulina (IR), IRS (Substrato del receptor de insulina), PI3-kinasa (fosfatidil inositol 3 kinasa), Akt, que fosforila a GSK3 en Serina 9 y 21 desactivándola, con lo que GSK3 al ser inactivada no fosforila a GS, y como la GS es activa cuando esta desfosforilada, la resultante será la estimulación en la síntesis de glucógeno en respuesta a la insulina. El ejercicio, también desactiva a GSK3 en un grado similar al producido por la insulina, pero con la diferencia de que no se observa fosforilacion en Serina 21. Esto sugiere que el ejercicio regula la actividad de GSK3 en el músculo esquelético de un modo alternativo. Algunos estudios realizados en ciclistas muestran que luego de 60 minutos de actividad se incrementa la fosforilacion en Ser 473 de Akt, esto podría explicar la desactivacion de GSK3 por el ejercicio. Las consecuencias fisiológicas de la desactivacion de GSK3 con el ejercicio no se conocen exactamente, una de las funciones es el incremento de actividad de GS, esta seria una parte del mecanismo de regulación de GS. Es probable que GSK3 tenga una función en la regulación de procesos metabólicos y transcripcionales. Se ha observado que GSK3 fosforila factores de transcripción, muchos de los cuales están regulados por el ejercicio. P70S6K Tiene un rol critico en la regulación de la translación del RNA mensajero transcripto, es decir, desde el núcleo hasta el citosol lugar donde se traduce a proteínas. Bloqueando p70s6k se observa una significante inhibición de la síntesis de proteínas en respuesta a la insulina. Un set de ejercicio de sobrecarga provoca un incremento en la síntesis de proteínas, mientras que con el entrenamiento, a manera de adaptación crónica, aparece la hipertrofia muscular. Como hipótesis esta regulación en la síntesis de proteínas debida al ejercicio, podría estar mediada a través de la activación de p70s6k en el músculo esquelético. Se ha observado el incremento en la actividad de p70s6k luego

11 de 6 hs. de contracciones excéntricas máximas y este incremento en la actividad de p70s6k también estaría estrechamente correlacionado con el cambio en la masa muscular luego de 6 semanas de entrenamiento. Como hemos visto el ejercicio físico por medio de modificaciones en distintos parámetros, algunos ya bien establecidos, regula múltiples señales intracelulares en el músculo esquelético, estas, regulan distintas funciones celulares, que se manifiestan como respuestas agudas frente a un único set de ejercicio y como adaptación crónica frente al entrenamiento. A continuación podemos ver un cuadro esquemático de las señales intracelulares y sus efectos sobre diversos fenómenos o mecanismos biológicos A= efectos agudos y C= efectos crónicos Señales intracelulares e Insulino Resistencia En la diabetes tipo II, la insulino resistencia es causada por defectos en el receptor y en las señales de transduccion de la insulina, en IRS-1, y en la cascada de PI3K, esto se manifiesta en una reducida estimulación del transporte de glucosa a través de la translocacion de GLUT4 desde el citosol hacia la membrana plasmatica en las células del músculo esquelético. Como se detallo anteriormente la insulina y la contracción muscular, estimulan la captación de glucosa a través de GLUT4 por intermedio de proteínas señales diferentes, y es posible que esta sea una de las razones por las cuales el ejercicio fisico esta asociado a un mejoramiento en la homeostasis de la glucosa y en la sensibilidad a la insulina. Esto seria debido a que el entrenamiento físico lleva a modificaciones en la expresión y actividad de proteínas clave involucradas en la

12 cascada de señalización de la insulina, manifestándose un incremento en el transporte de glucosa en el músculo esquelético. Estos cambios estarían relacionados con un incremento en la actividad de diversas proteínas señal, como MAP kinasas, AMPK, Akt, que están asociadas en parte con un incremento en la actividad transcripcional, con consiguientes cambios en la síntesis de proteínas incluyendo GLUT4. INSULINA, incremento de su acción con el ejercicio. La insulina tiene efectos en el transporte de glucosa muscular y en la actividad de la glucógeno sintetasa (GS). Facilita la síntesis de glucógeno a través de su acción sobre ambos, en el transporte de glucosa, estimulando la traslocacion de GLUT4 a la membrana y en la GS, estimulando su actividad. La translocacion de GLUT4 involucra al receptor de insulina (IR) y su correspondiente cascada de señales, IRS-1, PI3K, Akt y PKC, como primeros eslabones en la cascada de señales de la insulina y a la fosofolipasa D como lejano eslabón adicional. La actividad de GS es regulada alotericamente por glucosa-6p y covalentemente mediante múltiples fosforilaciones. La insulina incrementa la actividad de la enzima GS por disminución en la fosforilacion de si misma. La cascada en que PI3K esta involucrada en la regulación de GS a través de la desactivacion de GSK3 y activación de PP1 (proteína fosfatasa 1) permite la desfosforilacion de GS por consiguiente su activación. Efectos del ejercicio en el transporte de glucosa y la actividad de glucógeno sintetasa. (GS) Se ha observado experimentalmente mediante espectroscopia de RMN que la velocidad de síntesis de glucógeno después de la deplecion de glucógeno

13 postejercicio de baja intensidad es realmente mas elevada que en el reposo. Eso es probablemente porque la actividad de GS es también incrementada en el ejercicio dinámico, el cual disminuye el contenido de glucógeno en el músculo. Así vemos que la actividad de GS es mas elevada en la deplecion de glucógeno comparada a cuando los depósitos están completos en la célula muscular. En estudios realizados con roedores, se han observado modificaciones covalentes en GS y cambios en su localización subcelular, aparentemente debidas a la presencia de glucógeno. Con lo que la redistribución celular de GS inducida por la deplecion de glucógeno, podría hacer que GS sea más susceptible a la desfosforilacion por PP1 incrementándose así su actividad. Insulina, durante el ejercicio. En cuanto a la dependencia de insulina para la captación de glucosa, en estudios in vitro, se observo que durante la contracción muscular existiría una no dependencia, resultando un efecto aditivo o potenciador del ejercicio sobre insulina en la captación de glucosa. Mientras que in vivo para lograr un efecto total del ejercicio sobre la captación de glucosa, se hace necesario un nivel basal plasmatico de insulina. De modo que con la deficiencia de insulina, la captación de glucosa inducida por el ejercicio es menor que con niveles basales normales de insulina. La concentración plasmatica de insulina disminuye hasta un 50 % durante el ejercicio, sin embargo como la perfusion muscular se incrementa notablemente durante el ejercicio comparado con el reposo, la concentración de insulina en el músculo en ejercicio, se incrementa notablemente durante el ejercicio. Esta podría ser la razón del aparente incremento de los efectos de la insulina durante el ejercicio siendo esta la mitad del valor que corresponde a concentraciones plasmaticas basales. Insulina, postejercicio. La sensibilidad a la insulina postejercicio se ve incrementada, de modo que la velocidad de síntesis de glucógeno es mayor, con lo se posibilita una rápida repleción de los depósitos de glucógeno depletados por el ejercicio. Este fenómeno primariamente involucra un incremento en la acción metabólica de la insulina post-ejercicio. También se ha observado que el ejercicio no siempre incrementa la acción de la insulina, por ejemplo, inmediatamente después del ejercicio, la acción de la insulina es disminuida por el incremento en la concentración de catecolaminas y ácidos grasos libres, así mismo, la contracción excéntrica disminuye prolongadamente la acción de la insulina. Este fenómeno podría ser por alteración en la expresión y función de determinadas proteínas. Durante las primeras horas post-ejercicio (3-4 hs), no se hallaron incrementos en la expresión de GLUT4, en señales intracelulares ni en la actividad de GS en el músculo humano. Pasado este tiempo, si se observa un incremento en la expresión de GLUT4 por lo menos en roedores, aunque aun no ha sido reportado en humanos. El hecho de que no se observen modificaciones en las proteínas señal, podría deberse primeramente a que no exista relación entre el incremento de estas señales y el incremento de acción de la insulina, o a que las modificaciones sean en la localización subcelular y los métodos utilizados en estos estudios son en músculo lisado, (mezclado) con lo que se pierde de investigar este tipo de modificación, o

14 simplemente que la sensibilidad de los métodos utilizados no sea la suficiente. El incremento en la perfusion capilar que ocurre durante el ejercicio, incrementa el delivery de insulina y de glucosa, con lo que se incrementa la acción de la insulina en el músculo y la captación de glucosa. Se ha observado que si no se ingieren cantidades suficientes de carbohidratos luego del ejercicio, los depósitos de glocogeno son reconstituidos ligeramente y de manera incompleta. Esto es debido a que luego del ejercicio se normaliza rápidamente la perfusion muscular, con lo que vuelve el delivery de glucosa y insulina a niveles basales. El nivel de los depósitos de glucógeno en la célula muscular parece estar directamente relacionado con la capacidad de la insulina de activar tanto el transporte de glucosa, como la glucógeno sintetasa (GS). En el músculo esquelético en reposo, la insulina activa la síntesis de glucógeno por incremento en la actividad de la GS y en la translocacion de GLUT4 hacia la membrana, esto ocurre por medio de proteínas señal activadas o desactivadas a partir de la unión de la insulina a su receptor. Por mecanismos aun desconocidos el volumen de glucógeno produce una regulación negativa sobre la acción de la insulina en ambos, activación de GS y translucacion de GLUT4. Con el ejercicio se depletan los depósitos de glucógeno, por lo que la acción inhibitoria sobre la acción de la insulina desaparece. En cuanto a los mecanismos moleculares involucrados, se observan cambios en algunas proteínas de la vía de señalización de insulina, con la disminución de los niveles de glucógeno hay activación de Akt y de AMPK. Hay evidencias que muestran que no es necesaria la deplecion de glucógeno para que haya un incremento en la acción de la insulina en el músculo, además de que el incremento en la acción de insulina persiste aun cuando los depósitos de glucógeno ya se hayan repletado. Por lo tanto, las evidencias sugieren que la deplecion de glucógeno postejercicio y el incremento en la perfusion capilar son los factores que mas contribuyen en el incremento en la sensibilidad a la insulina que se manifiesta con el ejercicio.

15 Proteínas señal, respuestas moleculares y celulares al ejercicio de sobrecarga El entrenamiento con ejercicios de sobrecarga induce respuestas moleculares y celulares necesarias para producir una hipertrofia compensatoria. Para su mejor comprensión se detalla a continuación un estudio realizado por Haddad y Adams en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California publicado en febrero del 2002 en el Journal of Apply Physiology. El estudio se realizo en ratas, para el que fueron elegidos ejercicios isometricos de sobrecarga, ya que la injuria en el músculo de la rata es mínima y en el humano trae como consecuencia una hipertrofia muscular. La estimulación fue eléctrica, consistió en 3 contracciones isometricas máximas por minuto durante 30 minutos. Se compararon las respuestas celulares y moleculares obtenidas con dos protocolos distintos: *Modelo un solo set de ejercicio: Seis grupos de ratas (n=6 por grupo). 30 minutos de ejercicio. Fueron sacrificadas un grupo por vez a distinto tiempo: 0, 2, 6, 12 y 24 hs. postejercicio.

16 Se recolecto el tejido y se realizaron los ensayos que se detallaran mas adelante. *Modelo dos sets de ejercicio: Las ratas asignadas realizaron dos sets consecutivos con distintos tiempos de intervalo de 8, 24 y 48 hs. entre los dos sets (3 grupos, n=18 cada grupo). De cada grupo, 6 ratas fueran sacrificadas a las 16hs., otras 6 ratas a las 24 hs. y otras 6 a las 40 hs. luego de finalizado el segundo set de ejercicio. Se recolecto el tejido. Análisis bioquímicos y moleculares realizados: Detección y cuantificion del RNAm de distintas proteínas (IGF-1, su receptor IGFR-1, Ciclina D1 y Miogenina entre otras) por medio de Transcripción Reversa, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y Densitometria Laser. Detección y cuantificacion de la fosforilacion de proteínas señal intracelulares (p70- s6k y Erk-2) por medio de inmunoblotting con anticuerpos específicos, SDS-page y Western Blot. Resultados obtenidos, Efectos sobre proteínas señal intracelulares En el caso de p70-s6k (downstream de PI3K) y ERK-2 (una MAP Kinasa), no se observan efectos sobre el contenido total de proteína, con lo que no hay aumento en la expresión de las mismas. Si se observa un incremento en la activación de estas proteínas por fosforilacion, este incremento en la fosforilacion podría ser resultado de un incremento en la unión receptores a receptores de factores de crecimiento, incluyendo IGFR-1. Como vimos anteriormente p70-s6k, esta relacionada con una respuesta aguda frente a un único set de ejercicio, como el del incremento en la síntesis de glucógeno y de proteínas, y una adaptación crónica frente al entrenamiento, de hipertrofia muscular. En el caso de ERK-2, vimos que estaría involucrada en la transcripción y regulación genica. En p70-s6k, el incremento en la fosforilacion es significativamente mayor a las 40 hs, luego de dos sets de ejercicio espaciados en 24 o 48 hs. En ERK-2, el nivel de fosforilacion es mayor a las 10 hs. luego de un set de ejercicio, retornando casi a niveles basales luego de 40 hs. Y en el caso de dos sets de ejercicio se prolonga durante mas tiempo la activación, en particular con 48 hs. de reposo entre ambos sets.

17 Efectos sobre IGF-1 y su receptor IGFR-1 La expresión de IGF-1, la transcripción de su RNAm y la traducción a peptido (IGF-1), se incrementan en la respuesta de hipertrofia compensatoria del músculo al ejercicio de sobrecarga. Las acciones de IGF-1 reportadas incluyen la estimulación de la

18 proliferación y diferenciación de células satélite, así como efectos anabolicos similares a los producidos por la insulina. El incremento en los nives de RNAm de IGF-1 es mayor tanto en magnitud como en duración luego de dos sets de ejercicio con respecto a un solo set, y mas significativamente si el intervalo entre los sets es de 24 o 48 hs. Los niveles de RNAm de IGFR-1 también se incrementan significativamente y de un modo similar a IGF-1.

19 Efectos sobre marcadores de proliferación y diferenciación celular En el músculo esquelético, como es sabido, además de células musculares hay células satélite, tejido conectivo y otras estructuras. Cuando ocurre la hipertrofia muscular, es necesario un incremento en estas células anexas para soportar el incremento de tamaño y la mayor capacidad de generar fuerza de la célula muscular hipertrofiada. Para que este fenómeno ocurra es necesario que estas células entren en mitosis, y esto depende de la etapa del ciclo celular en que se encuentren. El ciclo celular es regulado en parte por kinasas dependientes de ciclinas (cdk), unas de ellas son, la ciclina D1 y la miogenina que estimulan a las cdk, llevando a las células a prepararse para entrar en el ciclo, volviéndose mitoticamente activas. Estas células anexas así se diferencian como tales y proliferan durante la hipertrofia muscular. En este estudio se observo un incremento en la transcripción de RNAm de ciclina D1 y miogenina, como así también un incremento paralelo de p21, un inhibidor de cdk.

20 En resumen, el ejercicio de sobrecarga provoca un incremento en la fosforilacion, con la consiguiente activación de diversas proteínas señal intracelulares, como son p70- S6k y ERK-2. Como así también un incremento en la transcripción del RNAm de IGF- 1, su receptor y marcadores de diferenciación y proliferación celular, como son ciclina D1 y miogenina. Este incremento es mayor tanto en magnitud como en duración luego de 2 sets de ejercicio que luego de un único set. En cuanto al tiempo de reposo entre los dos sets, en la mayoría de las respuestas el incremento fue mas significativo con 48 hs de intervalo entre los sets, 24 hs. de reposo también fueron claramente efectivas, mientras que con 8 hs. el incremento en la fosforilacion o en RNAm fue inferior. Estos resultados nos sugieren que los mecanismos que producen estas respuestas (fosforilacion, transcripción a RNAm) tienen un periodo refractario, dentro del cual por mas ejercicio que se realice no van a haber incrementos en ellas. Con esto vemos la importancia que tiene la frecuencia (intervalo carga-reposo) en la dosificación del ejercicio de sobrecarga, ya que varios de los procesos celulares y moleculares que aparecen como respuesta al ejercicio, son susceptibles a la manipulación de los parámetros tales como los intervalos carga-reposo, por este camino y con investigaciones futuras podremos algún día dosificar el ejercicio de modo tal de optimizar sus resultados. Conclusión Esta claro que múltiples mensajeros y sistemas de señales son activados y desactivados durante el ejercicio físico y que el grado de activación de cada proteína su vez es dependiente de múltiples factores en los que se incluye la intensidad del ejercicio, la duración de este y el tipo de fibras involucradas en el esfuerzo dejando en

21 claro que otro rol importante es el lapso de reposo que debería existir entre cada set de ejercicio. El ejercicio físico sistemático otorga como resultado múltiples y favorables procesos de adaptación incluyendo proteínas señales especificas. En relación a la insulino resistencia, podemos señalar que en algunos casos se debe a alteraciones tanto en el receptor mismo de insulina o en las primeras proteínas señal (IRS-1, PI3K) de su cascada de transduccion y podríamos aventurarnos a afirmar que es causa del desencadenamiento de la posterior diabetes tipo II que también puede estar causada por defectos en la transduccion de señales correspondientes al transporte de glucosa en el músculo esquelético. El ejercicio físico ha sido identificado como un activador fisiológico del transporte de glucosa independientemente de insulina, incrementando la expresión de genes y activando el transporte de glucosa por una vía independiente apoyada básicamente en la translocacion de GLUT4 lo que tiene un implicancia terapéutica muy importante en el control de la homeostasis de la glucosa en pacientes diabéticos insulino resistentes. Finalmente a todo lo señalado anteriormente no debemos dejar de mencionar que fenómenos que podríamos denominar gatilladores de base serian el inductor de la optimización de las señales, nos referimos a la deplecion de los depósitos de glucógeno y al incremento en la perfusion capilar como a si mismo la movilización y metabolizacion de los triglicéridos intramusculares. Lecturas recomendadas Kei Sakamoto, Laurie J. Goodyear.: Intracellular signaling in contracting skeletal muscle. J. Appl. Physiol. 2002; 93: (con 160 referencias) Jorgen F. P. Wojtaszewski, Jakob N. Nielsen, Erik A. Richter.: Effect of acute exercise on insulin signaling and action in humans. J. Appl. Physiol. 2002; 93: (con 90 referencias) Fadia Haddad, Gregory R. Adams Acute cellular and molecular responses to resistance exercise. J. Appl. Physiol. 2002; 93: (con 62 referencias) J.W. Ryder, A.V. Chibalin, J.R. Zierath. Intracellular mechanisms underlying increases in glucose uptake in response to insulin or exercise in skeletal muscle. Acta Physiol. Scand. 2001; 171: (con 140 referencias) Kennedy J.W., Hirshman M.F.,Gervino E.V.,Ocel J.V., Forse R.A., Hoenig S.J., Aronson D., Goodyear. Acute Exercise Induces GLUT4 Translocation in Skeletal Muscle of Normal Human Subjects and Subjects With Type 2 Diabetes. Diabetes. 1999; 48: (con 56 referencias) J.R. Daugaard, E.A. Richter. Relationship between muscle fibre composition, glucose transporter protein 4 and exercise training: possible consequences in non-insulindependent diabetes mellitus. Acta Physiol. Scand. 2001; 171: (con 136 referencias)