Elaboró Revisó: Autorizó. M. en MM. Dianelly Yazmin Colli Magaña. del Angel DE ELISA FECHA DE ELABORACIÓN: Hoja 1 de 15 CCAYAC-PV-154
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- César Hidalgo Cabrera
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1 Hoja 1 de 15 PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL PARA HIGADO DE BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA EL KIT DE NUEVO DESARROLLO RIDASCREEN FAST R-BIOPHARM R-1711 Elaboró Revisó: Autorizó I.A. Sara Vargas García M. en C. Luz Sandra Sánchez del Angel M. en MM. Dianelly Yazmin Colli Magaña
2 Hoja 2 de 15 ÍNDICE. 1. OBJETIVO 2. ALCANCE 3. METODO DE ENSAYO 4. EQUIPO 5. MATERIALES 6. REACTIVOS 7. MUESTRA 8. DESARROLLO EXPERIMENTAL Verificación del Sistema de ELISA Repetibilidad Reproducibilidad (precisión intermedia) Especificidad % de Recobro Ruido de fondo de matriz. 9. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 10. BIBLIOGRAFIA
3 Hoja 3 de OBJETIVO 1.1 Objetivo general: Realizar la confirmación del método de prueba para la determinación de clenbuterol en muestras de hígado bovina por medio del uso del kit de ELISA R Objetivos específicos: Diseñar y desarrollar los ensayos para determinar: Repetibilidad, Precisión intermedia, Especificidad/selectividad, Recuperación, Verificación del sistema de ELISA. 2. ALCANCE: Esta confirmación aplica al método para la determinación de clenbuterol en muestras de hígado con el kit de Clenbuterol Fast de R-Biopharm R MÉTODO DE ENSAYO Método CCAYAC-M-265/8 utilizando el kit de nuevo desarrollo Clenbuterol Fast Ridascreen R Diagrama del proceso analítico. Son 3 etapas de preparación de la muestra: Homogeneización, extracción y evaporación. I) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
4 Hoja 4 de Diagrama analítico de flujo (prueba de ELISA): (sin filtro)
5 Hoja 5 de EQUIPO. Equipo Centrifuga Refrigerador Características Marca:Thermo mod. Heraeus refrigerada. De 8 camisas con velocidad de 3500 a 4500 rpm. y control de temperatura Equipo modular.temperatura promedio 2 C a 8 C. ID 2929 Calificación /Calibración, M. Preventivo Congelador Equipo modular.temperatura promedio -20 C. Congelador Con temperatura promedio -20 C. Balanza Granataria con sensibilidad de 0.01g Procesador de alimentos u Sistema de homogeneización Ultraturrax homogeneizador Lector de ELISA Marca:Biotek modelo: ELx800 con longitud de onda de 400 a 750 nm. De escritorio con software Ridasoftwin, data reduction for Equipo de Computo inmunoassays R-Biopharm. Termómetro De vidrio, con escala de 20 a 100 C de inmersión parcial. Termómetro De vidrio, con escala de menos -2 a 10 C 882 NA Vortex De un plato con regulador de agitación. Marca VWR 2970 De 2 a 20 µl 836 De 50 a 300 µl 831 Micropipetas de volumen variable Micropipeta multicanal Micropipeta multicanal De 100 a 1000 µl 841 De 500 a 5000 µl 2973 De 30 a 300 µl 2614 de 8 canales de volumen variable de 50 a 300 mcl. de 8 canales de volumen variable de 30 a 300 μl 5. MATERIALES. Material de laboratorio de uso general.
6 Hoja 6 de REACTIVOS. 6.1 Generales. Nombre Formula Marca, Grado o pureza Lote y Especificación Agua tipo I H 2O Agua Tipo I N/A Buffer de lavado Incluido en Kit de detección R-Biopharm N/A Kit RIDASCREEN Clenbuterol ensayo inmunoenzimático R-Biopharm Cat: R1711 Acetonitrilo CH 3CN pureza grado 99% Clenbuterol Fast Con placa de 96 micropozos, 6 estándares (std 1 [0 ppt], std 2 [75 ppt], std 3 [150 ppt], std 4 [300 ppt], std 5 [900 ppt], std 6 [2700 ppt]), 1 sol conjugado, 1 sol. sustrato/cromógeno, 1 sol. de paro 1 sol. buffer de lavado 6.2 PATRONES DE REFERENCIA. Nombre Formula Marca, Grado o pureza C RIDA Clenbuterol Spiking 12H 18Cl 2N 2O clenbuterol en Solution buffer de lavado R-Biopharm Cat: R1799 Catalogo 7. MUESTRA. Se recomienda partir de una matriz muy fresca ya sea que contenga o no clenbuterol, la cual se debe caracterizar realizando por lo menos 6 repeticiones independientes. Si la matriz es negativa a la presencia de clenbuterol, se puede utilizar como matriz de soporte para preparar los niveles del ensayo a través de la fortificación. 7.1 Muestra control negativa de hígado caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas en la rutina de trabajo, donde se ha obtenido un resultado de concentración menor a 100 ppt. 7.2 Muestra control positiva de hígado caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas en la rutina de trabajo y que contienen una concentración aproximada entre 900 y 2700 ppt. De no contar con este tipo de muestras trabajar con el esquema de fortificación.
7 Respuesta analítica Respuesta Analítica Respuesta analítica Respuesta analítica COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA Hoja 7 de 15 8 DESARROLLO EXPERIMENTAL. 8.1 Determinar la verificación del sistema de ELISA (repetibilidad del sistema) Realizar la curva de calibración del kit 3 veces por un analísta, en la misma corrida y con el mismo kit Leer en el lector de placas de ELISA la densidad óptica (DO) Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenidas en la tabla Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados (X, DS y CV respectivamente). Laboratorio: Unidades Tabla 1 (archivo:xxxxx) (ng/kg= ppt) Respuesta analítica (DO) *ng/kg Curva A Curva B Curva C X DS %CV Laboratorio: Unidades: Formato de gráficas Clenbuterol ng/kg (ppt) Respuesta analítica (DO) ng/kg Curva A Curva B Curva C PROM S Cv 0.00 # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! *Puntos de la curva del kit R # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! # DIV/0! CURVA A CURVA B CURVA C Linealidad del Sistema Curva A Curva B Curva C
8 Hoja 8 de Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación %CV 20% 8.2 Repetibilidad del ensayo Realizar al menos, 6 repeticiones independientes de una muestra positiva y 6 repeticiones de una negativa de carne Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA Leer en lector de placas de ELISA sin filtro Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenidas en la tabla Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados. Replicas Muestra X DS %CV Tabla 2 (Archivo: ) Muestra positiva Analista 1 Muestra negativa Analista Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación CV 20%
9 Hoja 9 de Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestras nativas) Realizar al menos 6 repeticiones independientes de la muestra positiva de hígado, por 2 analistas en 2 diferentes días Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA Leer en lector de placas de ELISA Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenida en la tabla Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados. Replicas Muestra Día Día Xr DSr %CVr X R DS R %CV R Tabla 3 (Archivo: ) Muestra positiva Analista 1 Muestra negativa Analista Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación %CV 20%
10 Hoja 10 de Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestra fortificada en al menos 4 niveles) Se puede elegir cualquier nivel, pero es recomendable aquellos que caigan en la parte lineal de la curva y considerar el límite de corte que actualmente es de 2000 ppt. Se recomienda probar también 500ppt y 300ppt Se realizarán 6 replicas de muestras independientes de la matriz para cada nivel Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA Leer en lector de placas de ELISA Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenidas en la tabla Se calculará, el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados. Replicas Muestra X DS %CV niveles N1 Analista 1 de Tabla 4 (Archivo: ) niveles N2 Analista 1 de niveles N3 Analista 1 de niveles N4 Analista 1 de Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación %CV 20% 8.5 Ruido de fondo de matriz. Se puede omitir el ensayo sobre este parámetro y utilizar los datos generados en el numeral 8.1 de repetibilidad del ensayo. Si esto no es posible entonces proceder como se describe enseguida Realizar 3 replicas de una muestra negativa de hígado, donde la concentración sea menor de 500 ppt. (el nivel puede cambiar de acuerdo al límite de detección del kit) Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA.
11 Hoja 11 de Leer en lector de placas de ELISA Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenidas en la tabla Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados. Replicas Muestras X D. E % CV Tabla 5 (Archivo:xxxx ) Muestra Analista Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación %CV 20% 8.6 % de Recobro Trabajar con los niveles de fortificación N1, N2, N3 y N,4 que el laboratorio haya establecido en el numeral 8.4 del presente documento Realizar los cálculos para adicionar una solución estándar de clenbuterol de concentración conocida a una muestra de carne cuya concentración sea menor a 100 ppt (puede ser la muestra que se utilizó para analizar el ruido de fondo). Enseguida se muestra un ejemplo. Ejemplo de cálculo de fortificación: Se desea fortificar una muestra de hígado a 0.4 ppb (ng/ml). El protocolo descrito en el Kit para la preparación de la muestra describe que se debe de partir de 3.0g de hígado. La solución fortificante que se preparó tiene una concentración de 10 ng/ml (ppb). Aplicando la fórmula: Tenemos que: v= C. fortificación x m C. fortificante
12 Hoja 12 de 15 Donde: v= Volumen de la solución fortificante a utilizar (ml) C.fortificación= a la cual se desea fortificar la muestra (ppb) C. fortificante= de la solución fortificante (ppb)(ng/ml) m: Cantidad de muestra fortificar (gramos o ml) Aplicando la fórmula: (0.4ppb) (3.0 g.) v= = 0.12mL = 120µL de sol. fortificadora de 10 ppb g carne 10 ppb Realizar 6 réplicas independientes de cada una de las muestras fortificadas en cada nivel Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA Leer en lector de placas de ELISA Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 6 y Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación de los resultados Realizar cálculos para obtener el % de recuperación, tomando en cuenta el promedio del ruido de fondo. Tabla 6 (Archivo:xxxx ) N1: Cantidad N2: Cantidad adicionada adicionada Promedio Muestra blanco (Carne) Promedio Muestra blanco (Carne) Replicas Muestra Lectura en % Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt ppt X X DS DS %CV %CV % Recuperación
13 Hoja 13 de 15 Tabla 7 (Archivo:xxxx ) N3: Cantidad N4: Cantidad adicionada adicionada Promedio Muestra blanco (Carne) Promedio Muestra blanco (Carne) Replicas Muestra Lectura en % Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt ppt X X DS DS %CV %CV % Recuperación Criterios de aceptación. Herramienta estadística Nomenclatura Criterio Coeficiente de variación %CV 20% % de recuperación %R % 8.7 Especificidad / Selectividad (solo en caso de contar con estándares de ractopamina y salbutamol ó silpaterol) Seleccionar al salbutamol y ractopamina como otros b-agonistas que pueden estar presentes en las matrices estudiadas Seleccionar el nivel al cual se va a realizar el ensayo de especificidad. Se recomienda considerar que la concentración seleccionada sea 10 veces mayor al LD Fortificar con estas dos soluciones y por separado, dos muestras de carne (muestra caracterizada como negativa) y realizar al menos 10 repeticiones para cada uno de los b- agosnistas Realizar el análisis y determine la concentración Realizar otro ensayo con al menos 5 repeticiones independientes con otras dos matrices de carne fortificadas por un lado con clenbuterol y ractopamina y por otro con clenbuterol y salbutamol mezcladas en una proporción 1:3 (1 parte de clenbuterol y 3 partes del otro beta agonista) para verificar posibles interferencias con el analito En caso de existir interferencia con algún(os) analito(s) afín(es), se deberá dejar constancia escrita de este hallazgo en el informe de validación.
14 Hoja 14 de Tabla de criterios de aceptación. 9.1 Los criterios para la confirmación del método de prueba fueron obtenidos de varias guías de validación de fuentes oficiales o del mismo proveedor del kit y se muestra en la siguiente tabla. Tabla 8 (Archivo:xxxx ) Parámetro Criterio de aceptación Fuente bibliográfica Verificación del sistema de ELISA Repetibilidad Precisión intermedia % de Recobro Especificidad / Selectividad Coef. Correlación o linealidad R 2 >90 y CV 20% El coeficiente de variación para un sistema inmunoquimico es 20% El coeficiente de variación para un sistema inmunoquimico debe ser 20% % (aprox. 87% en promedio) Ninguna detección para otros beta agonistas diferentes a clenbuterol Revista Ambito Regulador. Centro para el control estatal de la calidad de los medicamentos CECMED. La Habana No , 2007 Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency 2011 Inserto del Kit RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer). Resultado de la confirmación Conclusión
15 Hoja 15 de Los criterios de validez del método de prueba de ELISA proporcionado por el fabricante del Kit RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R- 1711, se muestra en la siguiente tabla. Tabla 9 (Archivo:xxxx ) Parámetro Criterio de aceptación Resultado de la confirmación Conclusión Temperatura ambiente de realización del ensayo C Absorbancia del estándar 1 (St con cero de concentración) >0.8 %CV entre repeticiones de las inoculaciones en el pozo de la ELISA 10% Comparar con la forma de la curva del Forma de la curva certificado de análisis del kit del mismo lote Recuperación % 10. Bibliografía Inserto del Kit RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany. Inmunoensayo enzimático para el análisis cuantitativo de Clenbuterol y otros β- agonistas. Marzo Métodos Analíticos adecuados a su propósito Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados 2da. Edición Desarrollado por: Eurachem Publicación técnica CNM-MRD-PT-030 CENAM Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer) Application note. R-biopharm. Compiliance criteria for manual testing of RIDASCREEN antibiotic/hormone tests (competitive)
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