XVII Curso Intensivo de Reumatología y XXI Conferencia Dr. Pedro M. Catoggio. Patrones de inmunofluorescencia en anticuerpos anti nucleares

Transcripción

1 XVII Curso Intensivo de Reumatología y XXI Conferencia Dr. Pedro M. Catoggio Patrones de inmunofluorescencia en anticuerpos anti nucleares Orlando Gabriel Carballo 18 de NOVIEMBRE de 2011, Buenos Aires, Argentina

2 Malcolm Hargraves describe las células LE en Fagocitosis de material nuclear intacto por leucocitos polimorfonucleares

3 además el fenómeno L. E. desaparece de la sangre durante la remisión y reaparece durante la recidiva de los pacientes con lupus eritematoso sistémico agudo. Las propiedades físicas del factor sérico L. E. eran similares a las de las gamaglobulinas normales, como bien lo documenta Hargraves, Haserick y Lee.

4 Henry Kunkel. En 1957 H. Holman y Henry Kunkel del Rockefeller Institute for Medical Research de Nueva York demostraron la afinidad del factor sérico al núcleo celular a una nucleoproteína o al ADN. Descubrimiento crucial para el inicio y la utilidad del laboratorio inmunológico para el diagnóstico del lupus.

5 Inmunofluorescencia Indirecta Con los estudios de Coons, Godman, Holman y Kunkel, desarrollaron el fundamento de la inmunofluorescencia que George Friou (1957) establece las bases sólidas para el diagnóstico del lupus en el laboratorio, desarrollando la técnica de IFI para FAN en forma semicuantitativa.

6 Banda Lúpica Burham, Neblett y Fine en 1963 en el departamento de dermatología del Hospital Henry Ford en Detroit demuestran los depósitos de inmunoglobulinas y complemento a nivel de la unión dermoepidérmica.

7 Eng Tan. Describió el anti Sm en los pacientes con lupus, en 1966 Pintura de Stephanie Smith, paciente a la cual debe el nombre el anticuerpo anti Sm. Los anticuerpos son los reporteros del sistema inmunitario que permiten al organismo detectar la presencia de autoantígenos inmunogénicos

8 SUSTRATOS UTILIZADOS EN LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA LA INVESTIGACION DE ANTICUERPOS ANTINUCEOCITOPLASMÁTICOS Cortes criostáticos de hígado de roedores. Cultivos celulares (HEp2, Wil2, HeLa).

9 Patrones por IFI, sustrato Hígado de roedor Patrones descriptos en HEp2 Homogéneo Periférico rico Moteado Nucleolar

10 Número de patrones acumulados identificados en HEp2 desde 1957 Patrones descriptos en HEp2 Nuclear ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ Homogé Homogéneo Granular Grueso Granular Fino Granular Fino Denso Granular Pleomó Pleomórfico Granular Mú Múltiple Granular Escaso Perifé Periférico Lineal Perifé Periférico Granular Nucleolares ¾ ¾ ¾ Homogé Homogéneo Granular Aglomerado Citoplasmáticos ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ Granular grueso Granular reticular Granular fino denso Granular con puntos aislados Fibrilar lineal Fibrilar filamentar Fibrilar segmentar Aparato mitótico ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ NuMANuMA1 NuMANuMA2 Centrí Centríolo Cuerpo medio CENPCENPF (MSA(MSA3)

11 Patrón n citoplasmático tico RR (rings rods) Carlos von Mühlen y Eduart Chan

12 SUSTRATO LINEA CELULAR HEp2 VENTAJAS Expresión de antígenos humanos : especificidad Elevada concentración de Ag: sensibilidad Células en todos los estadíos del ciclo celular Relación núcleocitoplasma en favor del núcleo Presencia de varios nucléolos Citoplasma rico en fibrillas y organelas

13 REQUISITOS DE CALIDAD PARA IMPRONTAS HEp2 Número de células por campo adecuado, cercano al 100 % de confluencia Presencia de células mitóticas: 10% Relación núcleo/citoplasma cercana a 1 Núcleo con nucléolos bien diferenciados. Evaluar la presencia de Ag SSA/Ro

14 Conjugado fluorescente Consideraciones Conjugado antiig G específico o antiig GAM polivalente? En el LES el 96% de los pacientes producen anticuerpos de clase Ig G (N Engl J Med 1966;274: ) los anticuerpos de clase Ig M están asociados a AR, drogas y a la edad y tiene menor significancia diagnóstica (Med Clin North Am 1985;69: ) Consideraciones en la elección del conjugado Evitar la gamma lista para usar. Cc proteica: Razón Ac esp/pr > 0,1 Razón F/P debe estar entre 2,5 4,0 Anticuerpo específico: μg/ml Dilución de trabajo: determinada por la titulación utilizando diluciones seriadas de sueros control negativo y positivo de patrón conocido.

15 conjugado TITULACION DEL CONJUGADO 1/50 1/100 1/200 Dilución de trabajo: 30 a 60 μg de IgG/ml. 1/400 1/800 control c+ c c+ c c+ c c+ c c+ c 1/ / / / / / / /2560 Título del suero de referencia positivo (control primario)= 1/640

16 Marcador Criterios Dilución de screening: En PBS Adultos:1/801/160 Niños:1/40 Incubación 30' Evitar luz directa sobre preparados Lavado (Azul de Evans) Siembra: Improntas sacarlas del envase inmediatamente antes de la siembra Sembrar cantidad suficiente de controles y muestras para cubrir cada pocillo Utilizar tips adecuados No tocar el pocillo con el tip. Evitar corrientes de aire. Antiγ* Siembra cuidadosa según esquema Lavado: Evitar secado de sustrato. Montaje Líquido de montaje: ph alcalino(>8) Incubación 30 Lavado Eliminar exceso de proteínas no fijadas: lavado rápido con piseta o pipeta. Dos lavados de 510 minutos con PBS. Preferentemente con agitación suave. Evitar volcar el buffer sobre los pocillo. Lectura: Cuarto oscuro. Concordancia de lectores. Doble ciego.

17

18 Fases de la mitosis Positivo Negativo

19 Cultivo de células c HEp2 Debris A

20 Principales regiones de las células c HEp2 2 a ser reconocidas por autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta Membrana nuclear Nucleoplasma Nucleolo Aparato mitótico Citoplasma ANA propiamente dicho En esta presentación todos los anticuerpos que reaccionan con estructuras de la células HEp2 son denominadas ANA Anticuerpos que muy probablemente no sean reconocidos por un ensayo de fase sólida

21 Ac AntiHistonas o AntidsDNA MITOSIS Ac. Anticentroméricos ricos

22 Anticentr centríolos Antilámina nuclear

23 Antihuso mitótico tico (NuMA 2) Antihuso mitótico tico (NuMA 1)

24 AntiSm/RNP AntiSSA/Ro AntiSSB/La

25 Armonización n de la determinación Título del informe. Estandarización n de la determinación. n. Nombre de los patrones. Utilización n de controles: primarios o secundarios. Participación n de programas de evaluación n externa de la calidad. Tipo de informe.

26 Armonización Primer Consenso Argentino de Patrones de Anticuerpos antinucleares HEp2 noviembre de 2008

27 OPCIÓN CONSENSUADA DEL INFORME Anticuerpos antinucleocitoplasmáticos (FAN/ANA) Positivo 1:320 Homogéneo Positivo 1:640 Reticular (tipo mitocondrial) Negativo Se sugiere la determinación de anticuerpos antim2.

28 Primer Consenso HEp2 Nuclear Periférico Lineal Granular Homogéneo Moteado Fino Fino Denso Grueso Grueso tipo matriz Pleomórfico Puntos aislados Centromérico Nucleolar Homogéneo Moteado Aglomerado Citoplasmático Reticular Granular Escaso Fino Fino Denso Granular Polar Fibrilar Lineal Filamental Segmental Aparato Mitótico Centríolo Huso Mitótico NuMA1 (MSA1) NuMA2 Cuerpo Medio (MSA2)

29 Patrón n Nuclear Periférico rico perinuclear en interface y telofase, placa metafásica negativa, con fluorescencia difusa en el citoplasma. Lineal LES, Sjs, Poliartritis seronegativa, Hepatitis autoinmune con vasculitis cerebral o cutanea Granular CBP componente de la membrana interna nuclear, laminina (proteína A de 70 KD, B de 68 KD y C de 60 KD), LAP 1, LAP 2, p58 gp210

30 Patrón n Nuclear Homogéneo nuclear homogéneo en interface, telofase y metafase, nucléolos positivos o negativos. DNA, nucleosomas, cromatina o proteínas relacionadas con DNA (histonas). LES (>90% LES en actividad) (criterio diagnóstico), LES inducido por drogas, artritis crónica juvenil, hepatopatías, etc.

31 Anticuerpos antidsdna Método: : Inmunofluorescencia Indirecta Sustrato: : Crithidia luciliae 60 al 80 % de pacientes con LES (elevada sensibilidad) Marcador serológico (elevada especificidad). Marcador precoz. Criterio diagnóstico. Patogenicidad. Monitoreo. Peter J. B., Shoenfeld Y. (1996). Autoantibodies. Arbuckle,M.R. Elsevier and col. Science Scand. B.V. J. Amsterdam, Immunol. The 54, , Netherlands 2001 Quinetoplasto Núcleo

32 Patrón n Nuclear Moteado Grueso motas de tamaños diversos en células en interface, placa metafásica negativa con o sin gránulos citoplasmáticos que la rodean. LES EMTC EMTC Matriz nuclear Sm (D), U1snRNP (asociado a: Sm B/B, D y E) (Splaisosoma) hnrnp (gránulos de intercromatina)

33 Patrón n Nuclear Moteado Fino motas finas de distribución uniforme, nucléolos positivos (SSB/La) o negativos. Metafases negativos con citoplasmas moteado fino condensado alrededor de la placa metafásica. SSj, LES, LES neonatal, miositis, esclerosis sistémica, hepatopatías autoinmunes. HEp2000 SSA/Ro (52/60) SSB/La Mi2.

34 AntiRo52/TRIM21 Sistema antigénico distinto al Ro60 Codificado en el brazo corto del cromosoma 11. Pertenece a una familia de proteínas RING/Bbox/coiledcoil (RBCC) tripartite motif protein (TRIM) y como una ubiquitina ligasa que es sobre expresada en células mononucleares de sangre perisférica. P. Ghillani et al. Autoimmunity Reviews 10 (2011)

35 Aparición n de autoanticuerpos anticuerpos previo al diagnóstico N Engl J Med 2003;349:

36 Patrón n Nuclear Moteado Fino Denso (ANTILEDGF) Descripción: moteado fino denso sin nucleolos, placas metafásicas positivas. Antígeno: factor de crecimiento derivado del cristalino (LEDGF). Asociación clínica: individuos normales.

37 Patrón n Nuclear moteado fino (tipo Scl70) Nucleoplasma granular fino a homogéneo con nucléolos en interface positivos, placa metafásica positiva. Topoisomerasa I Esclerodermia Síndrome de Raynaud Polimiositis o sindrome de superposición PM/Esclerodermia

38 Patrón Nuclear Centromérico: Nucleoplasma moteado discreto, las motas tienden al apareamiento, metafase moteada, nucléolos no visibles. No hay razón para utilizar otro método confirmatorio CREST CBP Fenómeno de Raynaud Telangiectasas Proteínas centroméricas A (16 kd) B (80 kd) y C (140 kd). Ag localizado en el interior de las láminas del quinetocoro.

39 Análisis de ANA en relación n a la evolución n de los pacientes que en la biopsia hepática inicial se encontraban en el estadío temprano de la enfermedad. M Nakamura. Hepatology Research 2007;37:S412s419

40 Patrón n Nuclear Moteado MúltipleM Nucleoplasma con puntos fluorescentes brillantes y dispersos, no se distingue el nucléolo, metafases negativas. Sp100 sp140 p80 coilina CBP Enfermedades reumáticas inmunoinflamatorias Sjögren primario LES SSc Sind Raynaud

41 Patrón n Nuclear Pleomórfico (PCNA) los núcleo de células en proliferación (fase S) se tiñen en forma pleomórfica (de moteado fino a grueso), núcleos de células en fase G (G0 o G1) y placa metafásica negativos. proteína auxiliar de la DNA polimerasa δ, de 34 kda 3% de pacientes con LES generalmente acompañado con otros patrones, homogéneo o nucleolar.

42 Patrón n Nucleolar Homogéneo Coloración fluorescente difusa de los nucléolos, metafase negativa Fosfoproteína de 37 kda B23 Fosfoproteína nucleolina 110 kda Complejos proteico PM/Scl Proteínas asociadas a RNA Th/72, To/82 del complejo RNasa MRP/RNasa P Sindrome de Raynaud, SSc. LES y otras enf reumáticas sistémicas

43 Patrón n Nucleolar Aglomerado (antifibrilarina) Fluorescencia nucleolar muy homogénea y grumosa (en agrupamientos) (clumpy) Células en estadios de metafase y telofase con coloración amorfa característica. Proteína básica de 84 kda componente del U3snRNP Esclerosis Sistémica (negros) Hipertención pulmonar

44 Patrón n Nucleolar Moteado Nucleolar moteado en células en interface, en placa metafásica 1 a 3 puntos fluorescentes vistos como cuerpos cromatínicos correspondientes a las regiones de organización nucleolar (NOR) NOR 90 Complejo RNA Pol I, RNA Pol III y RNA Pol II Esclerodermia (LES, LES juvenil Sind de Sjögren Fenómeno de Raynaud)

45 Gráfica de supervivencia de pacientes con Esclerodermia Curso benigno Fibrosis intersticial pulmonar Hipertensión pulmonar Afecciones cardíacas y renales M. Kuwana. Art & Rheum. 1994;37:7583

46 Anticuerpos antihuso mitótico tico NuMA1 NuMA2 Centrofilina (240 kda) Proteína HsEg5 Sindrome de Sjögren Raro en LES y SSc Infecciones por micoplasma LES SSc? Centro de organización del microtubulo Pericentrina, CEp250, α y γ enolasa MSA2 (Mitotic Spindle Antigen 2) SSc, Sind de Ry, inf por micoplasmas SSc Fenómeno de Ry

47 Patrones Citoplasmáticos ticos Sindromes antisintetasas: Jo1 PL7 PL12 EEA1 Fosfatidil serina GWB Sjögren primario (GWB) LES Neuropsiquiátrico nefritis Ribosomal P P0, P1, P2 Golgina Macrogolgina SjS, LES, RA, sindromes de superposición

48 Patrones Citoplasmáticos ticos CBP HCA tipo I Actina F (46 kda) M2 M4, M8 y M9

49 Especificidad de ANA

50

51

52

53

54

55 Conclusiones El médico debe solicitar la determinación de AAN sólo si el paciente presenta clínica compatible con una enfermedad autoinmune inflamatoria. Solicitar ENA aún si el AAN es negativo cuando persistan los síntomas y signos clínicos compatibles con enfermedad autoinmune inflamatoria. Para la correcta interpretación de una AAN se debe tener en cuenta el título y el patrón. No siempre un AAN positivo es acompañado por una prueba para anticuerpos específicos positivos.

56 Hacemos un buen uso del ANA/Hep2? Cómo y que hacer para mejorar la técnica? t Es posible mejorar la utilidad clínica? Las nuevas tecnologías ayudan a los diagnósticos? Cuáles son los problemas reales de la economía a de la salud: El dinero gastado en el momento del diagnóstico. Costos relacionados con la evolución n a largo plazo. Es necesario llegar a un acuerdo entre los médicos m dicos y de bioquímicos para encontrar soluciones correctas.!

57 Por qué usar la técnica t de ANA/HEp2 2 por IFI? Solamente las células permeables intactas contienen los autoantígenos in situ en el real estado conformacional. ( El chip multiparamétrico ideal ) La mezcla de autoantígenos sobre fase sólida (ELISA, beads, arrays, etc) son muchas veces incapaces de ser reconocidos por los ANA. Un resultado de screening por técnicas automatizadas negativo puede no ser verdadero ( ) Un resultado de ELISA positivo/ifi negativo, por el momento, tiene un dudoso significado clínico. El reconocimiento visual morfológico de los patrones utilizando un sustrato de elección en un talento natural de muchos bioquímicos. (Alan Wiik).

58 Conclusiones Los ANA probablemente reflejan los mecanismos de lesión tisular, las influencias genéticas, microambientales y tal vez la etiología. Los ANA están relacionados con el diagnóstico, subsíndrome, manifestaciones clínicas y el pronóstico. Pueden ayudar a la planificación del seguimiento y la terapia. Son de particular valor en las formas tempranas de la enfermedad. Deben ser revelados por IFI/HEp2. La utilización óptima de los resultados de ANA dependen de una estrecha colaboración médico bioquímico. Las plataformas modernas de pruebas para ANA pueden ser más fáciles de implementar pero, no mejores! Es necesario organizar reuniones de armonización y estandarización de técnica, informes, nombres de patrones, etc.

59 Laboratorio de Inmunología Área de Inmunología Viviana Novoa Neri Nuñez Mirta Cervellini Fernanda Ingénito Hernán Coraggio Leticia Yamamoto Paula Saporiti Graciela Ramos Romina Guevara Natalia Caba Gabriela Díaz Muchas Gracias