ALTERACIONES CROMOSÓMICAS EN NIÑOS CON LEUCEMIA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA Unidad Iztapalapa PROGRAMA DOCENTE DE INVESTIGACIÓN (PDI) ALTERACIONES CROMOSÓMICAS EN NIÑOS CON LEUCEMIA EVERARDO HERNÁNDEZ PLATA ASESORA INTERNA M. en C. Ma. de los Ángeles Aguilar Santamaría Departamento de Ciencias de la Salud (UAM-I) ASESORA EXTERNA M. en C. Ana Claudia Velázquez Wong Hospital de Pediatría (CMN SXXI del IMSS) Abril,

2 INTRODUCCIÓN Las anormalidades cromosómicas en las neoplasias se adquieren durante el proceso de la tumorigénesis. Estas aberraciones están restringidas al tejido neoplásico y no están presentes en otras células del cuerpo. La distribución de las anormalidades no es azarosa y se ha visto que tanto los tumores benignos como los malignos muestran alteraciones cromosómicas 1. Dos clases de eventos mitóticos pueden afectar a los cromosomas en las células neoplásicas: 1) La segregación anormal o no disyunción, que resulta en cambios en el número de los cromosomas que van de monosomías o trisomías a haploidías o poliploidías. 2) El rompimiento de los cromosomas causado por factores exógenos como la radiación ionizante, virus y agentes químicos mutagénicos, y factores endógenos entre los que se encuentran los sistemas enzimáticos, incluyendo la replicación, transcripción o recombinación del DNA. Esto resulta en deleciones, duplicaciones, inversiones, translocaciones, inserciones o amplificaciones 1. La leucemia es un cáncer de la sangre que se caracteriza por el aumento permanente, anormal y desordenado del número de leucocitos que da lugar a una invasión de la médula ósea e impide, a su vez, el desarrollo normal de las células progenitoras de la sangre 2. Según el tipo de células clonadas se pueden distinguir diversos tipos de leucemias 2 : Leucemia linfoblástica aguda. Leucemia mieloblástica aguda. Leucemia mieloide crónica. Leucemia linfática crónica. Las leucemias agudas se caracterizan por la sustitución de la médula ósea normal por células blásticas de una clona originada en la transformación maligna de una célula madre hematopoyética 2. La leucemia mieloblástica aguda (LMA) está caracterizada por una acumulación excesiva de células inmaduras precursoras de la línea no linfática en la médula ósea debido al bloqueo de la maduración celular. La LMA tiene una menor incidencia que la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y un amplio espectro de incidencia con respecto a la edad. En los Estados Unidos de Norteamérica se presentan 2.5 casos por cada 100,000 habitantes al año, con una predominancia 2

3 en el sexo masculino. Este tipo de leucemia es más común en los adultos y se presenta con mayor frecuencia entre los 55 y 60 años de edad 3. Las alteraciones cromosómicas que se han encontrado en casos con LMA han sido variadas. Entre ellas se han visto alteraciones numéricas (hiper o hipodiploidías), y estructurales entre las que destacan las inversiones (especialmente en el cromosoma 16) y las translocaciones [v. gr. t(8;21), t(9;11), t(15;17)] 1. La leucemia mieloide crónica (LMC) representa aproximadamente del 15 al 20% de todos los casos de leucemia y es más común en el intervalo de los 40 a los 50 años de edad 1. Dado que todos los linajes hematopoyéticos están involucrados en el proceso de la enfermedad, se piensa que el evento neoplásico inicia a nivel de las células troncales pluripotentes 4. Posteriormente se incrementa el número de células inmaduras en la médula ósea y en la sangre periférica y generalmente se presenta anemia, trombocitopenia, acumulación extramedular de las células blásticas y una reducida respuesta al tratamiento que esté recibiendo el paciente 1. La LMC fue la primera neoplasia en ser asociada con una anormalidad cromosómica específica y recurrente. Más del 90% de los pacientes con esta enfermedad presentan la translocación t(9;22) 1. Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es un término general usado para describir un grupo heterogéneo de neoplasias de origen linfoide, que se manifiesta por síntomas hematológicos, debido principalmente a la proliferación clonal, la acumulación y la infiltración de las células hematopoyéticas 5-7. Aunque un número no despreciable de casos ocurre en adultos, se presenta con mayor frecuencia entre los niños, en los que es el tipo de neoplasia más frecuente, registrándose la mayor incidencia entre los 2 y los 6 años de edad; sin embargo, se ha demostrado que la enfermedad tiene una distribución bimodal, con un segundo pico de incidencia alrededor de los 50 años, que tiende a disminuir constantemente conforme se avanza hacia la vejez 5,6,8. Hay una mayor predominancia de la enfermedad en los varones después del primer año de edad y se ha reportado una mayor incidencia en los niños americanos blancos que en los negros. Así, aproximadamente 3,000 nuevos casos de LLA infantil se reportan al año en los Estados Unidos de Norteamérica (EUA) y el riesgo de que un niño blanco desarrolle LLA durante los primeros 10 años de vida es de 1 en 2,880 5,6,9. La etiología de las leucemias no es del todo conocida pero se ha sugerido que sea de naturaleza multifactorial. Entre los factores que predisponen al individuo a sufrir 3

4 alguna de estas hemopatías se encuentran los ambientales, como la radiación ionizante. Un claro ejemplo de esto lo constituyó la mayor frecuencia de leucemias agudas registradas después de las explosiones atómicas de Hiroshima y Nagasaki, o tras accidentes nucleares como el ocurrido en Chernobyl 2,5,9. También la exposición a diversos agentes químicos se ha implicado en la génesis de estos trastornos. Entre ellos están el benceno y sus derivados, el cloranfenicol, agentes alquilantes, pesticidas y algunos fármacos inmunodepresores 2,5,9. Igualmente se ha asociado con enfermedades genéticas como el síndrome de Down, de Turner, de Bloom, la Anemia de Fanconi y otras alteraciones derivadas del huésped como la difusión de las células de la médula ósea y síndromes de inmunodeficiencia, entre los que destacan la Ataxia Telangiectasia y la Agammaglobulinemia 2,5,9. Finalmente, las leucemias se han asociado con agentes biológicos como el contacto previo con algunos virus como el HTLV-I y HTVL-II 2,5,9. Los mecanismos celulares que se encuentran detrás de la inducción de la LLA son similares en todos los casos. Entre ellos se encuentran las alteraciones numéricas tales como las hipo e hiperdiploidías y la expresión alterada de los protooncogenes; las translocaciones cromosómicas que dan origen a genes de fusión que codifican para cinasas activas y factores de transcripción alterados. Estas alteraciones genéticas contribuyen a la transformación leucémica de las células madre hematopoyéticas, o de sus progenitoras comprometidas, alterando las funciones celulares. Entre estas últimas se encuentra el mantenimiento o aumento de la capacidad ilimitada de auto-renovación, alterando los controles de la proliferación normal, bloqueando la diferenciación y promoviendo la resistencia a las señales apoptóticas 10. Los estudios citogenéticos en pacientes con leucemia han permitido identificar anormalidades cromosómicas numéricas y estructurales relacionadas con las características patofisiológicas de este cáncer. Las alteraciones numéricas, pueden clasificarse en tres grandes grupos 5,11-15 : a) La pseudodiploidía, anormalidad en la que el número total de cromosomas que conforman cada metafase es de 46, pero con alteraciones, ya sea numéricas (ausencia y duplicación de cromosomas de diferente par, por ejemplo), o bien, alteraciones estructurales. b) La hiperdiploidía, caracterizada por presentar 47 cromosomas o más, y c) La hipodiploidía, determinada por poseer 45 cromosomas o menos. Entre las anormalidades estructurales más frecuentes están: 4

5 a) Translocaciones. Definidas como el intercambio de material genético entre cromosomas. Existen varios tipos de ellas pero las más comunes son las recíprocas, en las que dos segmentos de DNA determinados intercambian sus posiciones entre cromosomas distintos. b) Inversiones. En las que una secuencia determinada gira 180 dentro del mismo cromosoma. c) Duplicaciones. Determinadas por la replicación repetida de una secuencia, dentro del mismo cromosoma. d) Deleciones. Caracterizadas por la ausencia de algún segmento que forma parte de un cromosoma. La frecuencia de estas alteraciones varía de acuerdo con la región geográfica en la que se realice el estudio. Entre los niños americanos la pseudodiploidía es la anormalidad numérica más frecuente seguida por la hiperdiploidía y la hipodiploidía, mientras que entre los niños de la India la hipodiploidía registra una mayor incidencia que la hiperdiploidía 10,16. Las translocaciones tienen su origen en la presencia de sitios frágiles, constituidos por secuencias altamente repetitivas que resultan vulnerables a agentes mutagénicos. Por medio de ellas se originan genes de fusión al combinarse secuencias codificadoras diferentes, creándose con ello proteínas con funciones totalmente distintas a las originales. Este tipo de alteraciones cromosómicas ocurren hasta en un 50% de los casos de LLA infantil 17. En la formación del cromosoma Filadelfia se encuentran involucrados puntos de ruptura de los cromosomas 9 y 22 [t(9;22) (q34:q11)] 18 que dan origen a una proteína fusionada. El proto-oncogen ABL, ubicado en el cromosoma 9, codifica para una cinasa específica de tirosina cuya actividad se encuentra altamente regulada en el ambiente celular normal. En contraste, la proteína BCR/ABL, producto de la fusión génica, es una cinasa constitutiva que altera las vías de señalización que controlan la proliferación, sobrevivencia y la auto-renovación de las células madre hematopoyéticas 19. La translocación t(12;21) crea un gen de fusión que incluye la porción 5 de TEL (gen del cromosoma 12), que codifica para un factor transcripcional para la diferenciación de células madre de médula ósea, y prácticamente toda la región codificante del gen AML-1, que codifica para el factor de transcripción de una subunidad del corazón del complejo enzimático de unión al DNA, el regulador maestro de la formación de las células hematopoyéticas troncales definitivas 20, 21. El efecto principal de la proteína de fusión TEL/AML-1 es la inhibición de la actividad transcripcional que inicia normalmente cuando AML-1 se une al DNA 22. Por otro lado, las translocaciones de MLL resultan en proteínas quiméricas que contienen la porción N-terminal de MLL, unida a la porción carbono terminal de 5

6 una de las 40 posibilidades que se han encontrado para este rearreglo 23,24. Las proteínas MLL fusionadas, tienden a tener una ganancia de función, que incrementa su actividad transcripcional. Esta alteración provoca un cambio en el patrón normal de expresión de varios genes, contribuyendo al proceso neoplásico 25,26. Las figuras A y B representan los dos mecanismos sugeridos para la formación de genes de fusión. El esquema A representa cómo algunos factores de transcripción de proto-oncogenes que se encuentran silenciados o se expresan con una tasa baja en las células progenitoras de un linaje particular, pueden ser activados cuando se encuentran bajo la regulación de incrementadores potentes que forman parte de genes que se expresan con una tasa alta 27. La figura B representa la ruptura de los genes dentro de los intrones, en donde se ven involucradas las secuencias codificadoras de cada uno de dos genes que codifican para factores de transcripción en diferentes cromosomas, produciendo un gen de fusión que codifica para un factor de transcripción quimérico con funciones alteradas 27. Gracias a la biología molecular se han clonado los puntos de ruptura de las translocaciones, inversiones y deleciones, además de caracterizar algunos de los genes involucrados en estos rearreaglos. Las sondas de DNA se derivan de los puntos de ruptura clonados y constituyen una herramienta muy útil para el 6

7 diagnóstico dado que, en muestras problema, pueden identificar a los genes involucrados sin los requerimientos de la citogenética clásica. Así, por medio de la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), las sondas marcadas con diversos fluorocromos pueden detectar distintos rearreglos cromosómicos tanto en núcleos interfásicos como en metafases. Como resultado, la cantidad de muestra del paciente que puede ser analizada para su diagnóstico, se incrementa sustancialmente 11,24,28. Actualmente todas las anormalidades cromosómicas son consideradas cruciales, tanto para el diagnóstico como para tomar decisiones terapéuticas en pacientes con leucemia u otro tipo de cáncer 6. En algunos protocolos las decisiones del tratamiento están basadas en el cariotipo de células malignas, por lo que la identificación en el laboratorio de citogenética o por análisis moleculares es considerada crucial tanto para el diagnóstico como para tomar decisiones terapéuticas 11,14-16,29,30. Existen muy pocos trabajos que reporten la frecuencia de la enfermedad en la población infantil de América Latina 31 ; sin embargo, en un estudio realizado por Mejía y colaboradores 32 se encontró una incidencia de la LLA del 50.6%, durante el período , en una muestra poblacional de 209 niños mexicanos atendidos en el Hospital General del Instituto Mexicano del Seguro Social, en la Ciudad de México. En virtud de lo anterior, el estudio de las anormalidades citogenéticas presentes en la población mexicana es de suma importancia. OBJETIVO Identificar el tipo y la frecuencia de alteraciones cromosómicas en un grupo de niños mexicanos con leucemia linfoblástica aguda, mediante las técnicas de bandas GTG y FISH. HIPÓTESIS Se esperaría encontrar alteraciones cromosómicas reportadas en la literatura para otros grupos poblacionales aunque, posiblemente, con frecuencias distintas debido a las diferencias étnicas. MATERIAL Y MÉTODO Se trabajó con las preparaciones celulares de 49 pacientes pediátricos quienes habían sido diagnosticados con diferentes tipos de leucemia: LLA, LMA, LMC. Este diagnóstico se realizó con base en el Sistema de Clasificación Citomorfológica 7

8 Franco-Americo-Británico (FAB) por el Servicio de Hematología del Hospital de Pediatría del CMNSXXI. Posteriormente fueron canalizadas al laboratorio de Citogenética del mismo Hospital, entre el 9 de abril de 2002 y el 15 de abril de La muestra de pacientes estuvo constituida por 19 mujeres y 30 varones, cuyas edades oscilaron entre los 5 meses y los 17 años (media de 9 años). Las muestras celulares fueron recibidas en jeringas previamente heparinizadas (0.2 ml de heparina) y, para obtener metafases, se emplearon dos métodos de siembra: el directo y el indirecto. Para el primero se utilizaron frascos de cultivo con 10 ml de medio RPMI (Gibco), a los cuales se les agregaron aproximadamente 0.8 ml de la muestra de médula ósea y 125 µl de colchicina (Sigma); se homogenizaron y se dejaron incubar por 40 minutos a 37 C. Para el proceso indirecto, se emplearon frascos de cultivo con 7 ml de medio RPMI (Gibco), a los cuales se les agregó la misma cantidad de muestra antes mencionada; se mezclaron mediante una leve agitación y se incubaron durante 72 horas a 37 C. Finalizada la incubación, se agregó la misma cantidad de colchicina que en el método directo y se dejó actuar por 40 minutos a 37 C. El proceso de la cosecha fue llevado a cabo de acuerdo con el método convencional 33. Una vez que hubo actuado la colchicina, las muestras fueron centrifugadas, se eliminó el sobrenadante, y los botones fueron resuspendidos en solución hipotónica (KCl M) (Merck) a 37 C; se homogenizaron y se incubaron durante 30 minutos a 37 C. Finalmente, las muestras fueron lavadas y fijadas con solución Carnoy (metanol (Merck) y ácido acético (Merck) en relación 3:1). Las preparaciones de cada paciente fueron divididas en dos lotes: A) para análisis de Bandas GTG, y B) para análisis con FISH. En el análisis del cariotipo de las muestras, se empleó la técnica de bandas GTG 34, y se clasificaron según el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética (ISCN) 35. La generación de bandas GTG se logró colocando en vasos de Coplin, 50 ml de solución proteolítica, constituida por fosfato de potasio (KH 2 PO M) (Merck), fosfato dibásico de sodio (Na 2 HPO M) (Merck) y tripsina (Gibco). La mezcla fue incubada a 37 C, al menos 30 minutos antes de realizar las bandas. Se introdujeron las laminillas durante 10 segundos en la solución con tripsina. Inmediatamente después se transfirieron a una solución de cloruro de sodio (Merck) al 0.9% con el objetivo de detener la acción enzimática, y se tiñeron con 8

9 los colorantes de Wright (Sigma) y de Giemsa (Sigma). Por último, las laminillas fueron enjuagadas para eliminar el exceso de colorante. Se analizaron en promedio de 15 a 20 metafases por cada caso y se empleó la nomenclatura estándar 35 Para detectar alteraciones estructurales específicas se empleó la Hibridación in situ con Fluorescencia (FISH). Las células de médula ósea fijadas previamente se procesaron de acuerdo con las instrucciones de la manufactura de las sondas empleadas 36. El DNA de las preparaciones celulares fue desnaturalizado en formamida al 70% y fijado en una serie de etanol en diferentes concentraciones (70, 85 y 100%). Se agregó la sonda correspondiente, se colocó un cubreobjetos, se selló y se dejó hibridar durante dos noches. Las preparaciones fueron lavadas con formamida al 50% y contrateñidas con DAPI para poder ser analizadas en el microscopio de fluorescencia 28. Dado que en algunos grupos poblacionales 10,16 determinadas alteraciones estructurales se presentan frecuentemente asociadas con la leucemia, adquieren un gran valor diagnóstico y pronóstico, de este modo las sondas utilizadas fueron: 1) LSI BCR/ABL Dual Color, Single Fusion Translocation Probe (Vysis), para detectar la translocación t(9;22), 2) LSI TEL/AML 1 ES Dual Color Translocation Probe (Vysis) para detectar la translocación t(12;21), y 3) LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Vysis), para detectar rearreglos de 11q Una vez realizadas las hibridaciones se procedió a leer en su totalidad las regiones hibridadas, tomando en cuenta para el resultado final solamente aquellos núcleos bien definidos, separados y con las señales nítidas. De los 49 pacientes incluidos inicialmente en el estudio se analizaron en promedio 4 laminillas de cada individuo para detectar alteraciones numéricas y estructurales, y 3 preparaciones para seleccionar regiones en donde hubiera un alto número de núcleos (5 20 aprox. por campo de 100X) y la mayor limpieza posible (ausencia de residuos citoplasmáticos). RESULTADOS Y DISCUSIÓN De los 49 pacientes iniciales, 37 casos fueron excluidos del análisis de bandas G por carecer de metafases de calidad adecuada que permitiera la identificación de alteraciones numéricas o estructurales y sólo 19 casos cubrieron los requisitos necesarios para ser analizados con FISH. 9

10 Se identificaron tres casos pseudodiploides, es decir, el 27% de los 11 pacientes diagnosticados con LLA. Aunque en estos casos el número cromosómico pareciera ser normal, la baja calidad de las figuras mitóticas con cromosomas encimados no permitió precisar su número; además, la morfología alterada de cada uno de ellos sugirió la presencia de alteraciones estructurales. De este modo, si las figuras mitóticas estuvieran constituidas por un número cromosómico distinto a 2n = 46, corresponderían a hipo o hiperdiploidías y si, además, existieran alteraciones estructurales entre los cromosomas, esas metafases serían doblemente anormales (Fig. 1). Figura 1 Metafase pseudodiploide. La flecha señala cromosomas encimados y el No. cromosómico parece ser 2n = 46. Muestra de médula ósea de paciente con LLA teñida con Giemsa y Wright. 100X. En uno de los tres casos pseudodiploides se identificó la deleción de la parte terminal del brazo largo del cromosoma 22. Esta alteración fue confirmada por dos especialistas altamente calificadas del Laboratorio de Citogenética en donde se realizó este estudio. Ambas coincidieron en la posible formación del cromosoma Filadelfia como resultado de una translocación recíproca entre segmentos distales de los brazos largos de los cromosomas 9 y 22: t(9;22) (q34;q11) 37 (Fig. 2). El hecho de haber observado una alteración estructural específica (22q-) sólo en un caso de los 49 analizados corrobora la dificultad que constituye el trabajar con muestras de médula ósea con LLA, ya que los cromosomas tienden a ser irregulares y poco nítidos, como lo han encontrado también Pérez-Vera et al 15, Williams et al 33, Secker-Walker et al 38 y Nordgren

11 Figura 2 Mitosis en las que se identificó la deleción del brazo largo del cromosoma 22 (22 q - ). Las flechas oscuras señalan al cromosoma 22 delecionado; las flechas delgadas, a su homólogo (normal) Muestras de médula ósea de paciente con LLA teñidas con Giemsa y Wright. 100X. En dos individuos diferentes, se identificaron hiperdiploidías con un número cromosómico superior a 50, lo que representó el 18% del total de las alteraciones numéricas (Fig. 3). El número exacto de cromosomas en cada caso no pudo ser precisado debido a la baja calidad de las metafases y a la presencia constante de cúmulos de cromatina, mismos que podían ser interpretados como una sola estructura, una fusión de distintos cromosomas, o bien, como varios de ellos condensados de forma independiente pero apilados en el mismo lugar. Figura 3 Metafase hiperdiploide. No. cromosómico 2n superior a 50. Muestra de médula ósea de paciente con LLA, teñida con Giemsa y Wright. 100X. 11

12 El haber observado una mayor cantidad de cromosomas a la normal sugiere la posibilidad de aneuploidías y, para identificar los cromosomas en exceso se requeriría contar con el patrón de bandas GTG bien definido. Las anormalidades cromosómicas observadas, y la dificultad del análisis del cariotipo mediante bandas GTG en las muestras trabajadas confirman algunas de las características que se encuentran en las leucemias, de acuerdo con lo reportado en la literatura 40. Cabe mencionar que en un caso extra, diagnosticado con Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA), también se identificó este tipo de anormalidades además de metafases hiperdiploides (2n>50). Asimismo, se identificaron metafases hipodiploides en otros 5 pacientes con LLA, representando el 55% del total de las alteraciones numéricas y, con ello, la alteración más frecuente de este tipo en la muestra poblacional estudiada. En estas figuras mitóticas con 2n<46 se observaron alteraciones similares a las descritas en las hiperdiploidías, por lo que tampoco fue posible precisar el número cromosómico (figura 4). Figura 4 Metafase hipodiploide. No. cromosómico 2n inferior a 46. Muestra de médula ósea de paciente con LLA teñida con Giemsa y Wright. 100X. En la muestra poblacional estudiada se observa que la hipodiploidía es la anormalidad más común mientras que la pseudodiploidía es la alteración cromosómica más frecuente en varios grupos poblacionales extranjeros (Gráfica 1). Este dato representa grandes desventajas para la población mexicana dado el mal pronóstico asociado con un número cromosómico menor a

13 % Pseudodiploidías Hiperdiploidías Hipodiploidías Americanos Mexicanos Indios Españoles Gráfica 1 Frecuencias de alteraciones numéricas en diferentes poblaciones humanas 10,16,41. Al comparar las frecuencias encontradas de este tipo de alteraciones con otros grupos poblacionales se observa una notable semejanza con los indios, en cuanto a que en ambas poblaciones la hipodiploidía se presenta en más del 30% de los individuos estudiados 16, mientras que tanto entre la población americana 10 como entre la española 41 esta anormalidad es la menos frecuente. Dentro de todos los grupos extranjeros la pseudodiploidía es el tipo de anormalidad más frecuente 10,16,41, dato que no concuerda con la frecuencia que esta anormalidad presentó dentro de la muestra poblacional estudiada (Gráfica 1). Con respecto a las hiperdiploidías, este tipo de alteración se encontró con la menor frecuencia dentro de la muestra de estudio, colocándose por arriba de la observada en la población de la India y por debajo de las encontradas en las poblaciones americana y española. Se sugiere que las diferencias en las frecuencias de las distintas alteraciones cromosómicas observadas dentro de las diferentes poblaciones puedan derivarse de variaciones ambientales o en el lote génico. En virtud de que la pseudodiploidía se ha reportado como la alteración numérica más frecuente y que el tamaño de la muestra fue reducido, se considera conveniente incrementar el número de pacientes para corroborar la tendencia encontrada en este estudio. Asimismo, sería positivo incluir pacientes de diferentes regiones del país pues se ha detectado que existen diferencias en la susceptibilidad al desarrollo de cáncer que están relacionadas con las características propias del 13

14 hábitat y los agentes mutagénicos a los que está expuesto el individuo, encontrándose una mayor recurrencia de casos con Leucemia en regiones con un mayor desarrollo industrial 42. De igual manera, es indispensable contar con una muestra poblacional constituida por igual número de pacientes masculinos que femeninos o, al menos, lo suficientemente grande para que las variaciones numéricas entre ambos grupos no represente diferencias significativas, y se pueda establecer una relación directa del tipo y la frecuencia de alteraciones cromosómicas con el sexo de los individuos. Las laminillas del lote B, destinadas al análisis con FISH se mantuvieron almacenadas a 20 C. En ellas se observaron varias alteraciones que impidieron su inclusión y, en consecuencia, se registró una disminución del número total de preparaciones. Entre otras anormalidades observadas, llamó la atención la gran cantidad de cúmulos de núcleos y residuos citoplasmáticos que impidieron una correcta hibridación y cuantificación adecuada (Fig. 5). Figura 5 Muestra en la que el gran número de cúmulos de núcleos impidió una hibridación correcta de la sonda empleada Núcleos interfásicos de médula ósea con LLA teñidos con DAPI. 100X En los 19 casos diagnosticados con LLA viables para el análisis con FISH, se aplicó al menos una de las tres sondas específicas de este estudio ya que en varios casos no hubo laminillas suficientes para realizar la hibridación con las sondas disponibles. En los casos en los que sí fue posible, se analizaron todas las sondas de referencia. Los detalles del diagnóstico y de la sonda aplicada en cada caso, así como el resultado obtenido se especifican en la Tabla 1. 14

15 Tabla 1.- Resultado obtenido de FISH con las sondas aplicadas a las muestras de cada paciente. Paciente Sexo Diagnóstico Hematología Sonda empleada Resultado Paciente Sexo Diagnóstico Sonda Hematología empleada Resultado 1 M LLA BCR/ABL - MLL - 12 F LLA MLL N.H. TEL-AML1 + 2 M LLA BCR/ABL N.H. BCR/ABL + 13 M LLA MLL + MLL - 3 F LLA BCR/ABL - MLL N.H. 14 M LLA MLL - TEL-AML1 + 4 M LLA TEL-AML1 - BCR/ABL - 15 M LLA 5 F LLA MLL + TEL-AML1-6 M LLA MLL + 16 M LMA BCR/ABL N.H 7 F LLA TEL-AML1 - BCR/ABL - 8 M LLA BCR/ABL + 17 M LMA MLL + BCR/ABL + TEL-AML1-9 M LLA MLL + BCR/ABL + 18 F LMA TEL-AML1 + MLL + 10 F LLA BCR/ABL - BCR/ABL - TEL-AML1-19 M LMC MLL + 11 F LLA MLL N.H. TEL-AML1 - += Positivo para la alteración.- = Negativo para la alteración. N.H.= No ocurrió la hibridación. En esa tabla se observa que, de los ocho casos con LLA procesados con BCR/ABL, tres resultaron positivos para la fusión producto de la translocación t(9;22), lo cual representa el 13% del total de las alteraciones encontradas en la muestra estudiada. Cabe mencionar que esta sonda fue aplicada a un total de doce casos, de los ocho casos con LLA, cinco fueron negativos para esta fusión; otros tres fueron diagnosticados con LMA, uno resultó positivo, otro negativo para la fusión BCR/ABL y, en la muestra restante no ocurrió la hibridación. El último caso al que se le aplicó la misma sonda perteneció a la LMC y resultó negativo para esta alteración. En las figuras 6 y 7 se muestra el patrón de señales observado tanto en las células donde los genes BCR y ABL se encontraban íntegros (señales separadas, verdes para BCR y rojas para ABL), como para aquellas en donde ocurrió la fusión entre estos dos genes (señal amarilla). El número promedio de núcleos hibridados que se encontró en las muestras procesadas con esta sonda fue de 3,

16 BCR/ABL BCR ABL BCR ABL Figura 6 Figura 7 Núcleo normal, sin fusión génica. Núcleo con fusión génica. Núcleo profásico de médula ósea con LLA. Sonda BCR/ABL. 100X Núcleo interfásico de médula ósea con LLA. Sonda BCR/ABL. 100X Para determinar la frecuencia de la fusión TEL/AML-1 [t(12;21)], se aplicó la sonda correspondiente a las muestras de siete pacientes con LLA, encontrándose tres casos positivos para la fusión, que representan el 8% de las alteraciones encontradas en este estudio; los otros cuatro casos resultaron negativos para esta anormalidad. En un caso con LMA y otro con LMC en los que se empleó esta misma sonda, no se obtuvieron resultados positivos, es decir, no se detectó fusión génica. La figura 8 presenta el patrón de señales que se observó en los núcleos donde los genes se encontraban íntegros dando como resultado señales verdes (TEL) y rojas (AML-1) por separado. En la figura 9 se muestra el patrón de señales que se observó al presentarse la fusión correspondiente. El color amarillo representa la fusión de un gen TEL con un segmento de un gen AML-1. La señal roja barrida representa el residuo del gen AML-1 fusionado, mientras que las señales verdes y rojas nítidas indican la presencia de los otros dos genes íntegros. En los casos tratados con esta sonda se contaron 4,161 núcleos, en promedio. TEL/AML-1 TEL AML-1 TEL AML-1 residual AML-1 Figura 8 Figura 9 Núcleo normal, sin fusión génica. Núcleo con fusión génica. Núcleo interfásico de médula ósea con LLA. Sonda TEL/AML X Núcleo interfásico de médula ósea con LLA. Sonda TEL/AML X 16

17 La sonda MLL fue empleada en 13 muestras. Entre los diez casos con LLA procesados con ella se encontraron cuatro positivos para el rearreglo 11q23, que representan el 17% de las alteraciones cromosómicas detectadas en la muestra de estudio; tres de los casos procesados fueron negativos para la alteración y en otros tres no ocurrió la hibridación. Dos muestras más, correspondientes a pacientes con LMA y otra diagnosticada con LMC resultaron positivas para este rearreglo. En la figura 10 se presenta el patrón de señales esperado para núcleos en donde la región cromosómica se encuentra íntegra y, por lo tanto, resulta negativa para sus rearreglos. En la figura 11 se aprecian dos señales verdes y dos señales rojas, por separado, lo cual indica la ruptura de la región a la que va dirigida la sonda (núcleo positivo para el rearreglo). En las laminillas procesadas con esta sonda 2,286 núcleos, en promedio, hibridaron correctamente. Rearreglo de MLL MLL Figura 10 Figura 11 Núcleo normal, sin rearreglos de MLL. Núcleo con rearreglo de MLL (11q23). Núcleo interfásico de médula ósea con LLA. Sonda MLL. 100X Núcleo interfásico de médula ósea con LLA. Sonda MLL. 100X En la gráfica 2 se comparan las frecuencias de las alteraciones estructurales, detectadas con estas sondas específicas, en la muestra estudiada con las reportadas para la población americana 10 y la española 41 ; nótese que la frecuencia de la fusión TEL/AML-1 para este último grupo no ha sido reportada aún. 17

18 25 20 % BCR/ABL TEL/AML-1 MLL Americanos Mexicanos Españoles Gráfica 2. Frecuencias de alteraciones estructurales presentes en la muestra estudiada, así como en la población americana 10 y española 41. Al analizar las frecuencias de las alteraciones estructurales obtenidas por FISH se pudo observar que, contrario de lo reportado para otros grupos 10, los rearreglos que involucran a la región 11q23, del cromosoma que da nombre a esta alteración, constituyeron la anormalidad presente en mayor proporción en la muestra de estudio, constituyendo el 17% del total de las alteraciones cromosómicas detectadas (Gráfica 2), lo que significaría desventajas para la población mexicana debido al mal pronóstico que representa esta anormalidad 44. La fusión BCR/ABL se presentó en el 13% de los casos con alteraciones cromosómicas constituyendo la segunda alteración estructural más común dentro de los pacientes afectados. Cabe resaltar que la frecuencia que observó esta anormalidad dentro del grupo de estudio fue sensiblemente más alta que la reportada para los otros dos grupos poblacionales 10,41. La t(12;21), detectada por la sonda TEL/AML-1, resultó ser la menos frecuente dentro del grupo de pacientes estudiados, constituyendo un 8% del total de las anormalidades citogenéticas registradas; sin embargo, no fue posible hacer una comparación con la población española 41 dado que para ella no se encontraron registros acerca de la frecuencia de la misma alteración. El alto número de núcleos analizados mediante FISH confirma la gran sensibilidad de esta herramienta misma que constituye una ventaja para el análisis de 18

19 muestras con LLA dado que, de no ser por ella, un gran número de alteraciones submicroscópicas pasarían inadvertidas tanto en metafases como en núcleos interfásicos; esta idea está de acuerdo con Pérez-Vera et al. 15 y Anastasi et al. 43. Sin embargo, gracias a la citogenética clásica es posible hacer un análisis previo completo del cariotipo y obtener, mediante la observación de los cromosomas, indicios acerca de las sondas específicas a emplear con el FISH. De otra manera la búsqueda de alteraciones particulares de forma azarosa resultaría sumamente cara y poco viable. Además el análisis de la ploidía resulta más económico mediante técnicas de bandas GTG. Al igual que con las alteraciones numéricas, y teniendo en cuenta las dificultades encontradas en el desarrollo del FISH, se sugiere el aumento de la muestra de estudio, con la finalidad de afinar las tendencias que se encuentran dentro de la población mexicana. También sería muy útil crear un banco de datos, en el cual todos los laboratorios de investigación descargaran la información obtenida de sus estudios, para estar en posibilidad de incrementar paulatinamente la información general acerca de las alteraciones cromosómicas presentes en la población mexicana y que los hospitales hicieran el seguimiento detallado de la respuesta al tratamiento aplicado a los pacientes. Esto permitiría tener una visión más clara acerca de las características propias del banco genético de los mexicanos y de su comportamiento ante diversos factores exógenos que predisponen o desencadenan el proceso neoplásico, así como la respuesta a diversos fármacos. Sería muy útil incluir en los expedientes de los pacientes información que permitiera correlacionar el tipo de enfermedad con las características del hábitat en el que desarrollan sus actividades y otras variables, como los hábitos culturales y alimenticios. Estos datos permitirían mejorar los tratamientos a emplear asegurando con ello la pronta y segura recuperación de los pacientes. Además de que servirían como base para el desarrollo de nuevos fármacos que permitieran el abatimiento de costos y la mejora en la respuesta generada por los individuos, con la final de beneficiar a un mayor sector poblacional. Esto implicaría, a su vez, el conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en las alteraciones cromosómicas y los procesos celulares que se ven afectados en función de la expresión génica, tales como la fosforilación excesiva y sin regulación de proteínas involucradas en la progresión y diferenciación celular. En este ámbito la técnica de micro arreglos tiene una amplia aplicación, dada su alta sensibilidad para determinar los perfiles de expresión de diversos genes. 19

20 La información generada por esta técnica resulta muy útil para el entendimiento del proceso neoplásico por lo que se están integrando los datos generados de éste y otros proyectos realizados en el Laboratorio de Citogenética para determinar, en colaboración con el Laboratorio de Biología Molecular, dentro de la misma Unidad de Investigación del Hospital de Pediatría, la tasa o perfiles de expresión de los genes de fusión más frecuentes e importantes en el desarrollo de las leucemias dentro de la población mexicana. CONCLUSIÓN En la muestra de estudio se encontraron algunas de las alteraciones cromosómicas asociadas con las leucemias ya reportadas para otros grupos poblacionales; sin embargo, a diferencia de los norteamericanos, españoles e indios, la hipodiploidía resultó ser la anormalidad numérica más frecuente mientras que, dentro de las alteraciones estructurales, los rearreglos de la región 11q23 (gen MLL) presentaron la mayor frecuencia de las tres alteraciones del mismo tipo analizadas en este trabajo. Con base en las frecuencias que presentaron los diferentes tipos de alteraciones en este estudio, así como en aquellas reportadas para las distintas poblaciones extranjeras se puede concluir que el pronóstico de vida, de los pacientes infantiles con LLA de la muestra estudiada tiende a ser desfavorable, en virtud del alto índice de aparición tanto de las hipodiploidías como de los rearreglos que involucran a la región 23 del brazo largo del cromosoma 11. Las diferencias encontradas entre la muestra analizada y las poblaciones de comparación, podrían atribuirse a variaciones en la carga genética de los diversos grupos aquí analizados, así como a las características ambientales propias de cada región y la respuesta que cada grupo observa a los diferentes tratamientos aplicados. BIBLIOGRAFÍA 1) Gersen S. L., Keagle M. B The Principles of Clinical Cytogenetics. Ed. Humana Press. USA. pp ) Lozano J. A. Leucemias Agudas. Oncología 2002; 21:117. 3) Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T., Flandrin G., Galton D.A.G., Gralnick H.R., and Sultan C. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. Ann. Intern. Med. 1985; 103:

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