DESARROLLO, VALIDACIÓN Y APLICACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE COCAÍNA EN LARVAS DE MOSCAS Elton Solís Esquivel 1,2, Humberto Quiroz Martínez 2, Ariadna Rodríguez Castro 2, Porfirio Díaz Torres 1 y Adolfo Caballero Quintero 1. 1 Dirección de Criminalística y Servicios Periciales, PGJ del Edo. de Nuevo León. C.P. 64649. eltonsolisesquivel@hotmail.com. 2 Facultad de Ciencias Biológicas, UANL. C.P. 66450, 105-F. RESUMEN: Ante la necesidad de determinar la presencia de cocaína en cadáveres en estado de descomposición con colonización de insectos necrófagos, se desarrolló un método de detección y cuantificación de cocaína en larvas de mosca. La forma de extracción fue líquida utilizando como solvente de extracción acetonitrilo. El análisis se llevo a cabo mediante un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución acoplado a Espectrometría de Masas en Tandem. El tiempo de análisis en el cromatografo fue de 4 min y la detección en la espectrómetro fue mediante el Monitoreo de Reacción Múltiple. El método desarrollado presenta parámetros de validación aceptables El LD se estableció en la concentración de 0,625 ng/g. El propósito del método fue cumplido al utilizarlo para considerar el consumo de cocaína ante-mortem en un cadáver al detectar la presencia de cocaína en larvas de Cochliomyia macellaria las cuales de alimentaban de restos del cuerpo. Palabras clave: Diptera, entomotoxicología, entomología forense, cocaína. ABSTRACT: Given the need to determine the presence of cocaine in decaying corpses with colonization of carrion insect, a method was developed for detection and quantification of cocaine in fly larvae. The extraction was using acetonitrile as extraction solvent. The analysis was carried out using high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry tandem. The analysis time in the chromatograph was 4 min and detection in the spectrometer was by multiple reaction monitoring. The method developed presented acceptable validation parameters The LD was established in the concentration of 0.625 ng / g. The purpose of the method was accomplished by using it to consider cocaine ante-mortem on a body to detect the presence of cocaine in larvae of Cochliomyia macellaria which fed on the body. Key words: Diptera, entomotoxicology, forensic entomology, cocaine. Introducción El hallazgo de un cadáver humano en descomposición resulta todo un reto en material criminalística. Establecer la causa, el mecanismo y las circunstancias de muerte de un cadáver humano es si duda de gran interés forense, sin embargo llegar a responder estas incógnitas se vuelca sumamente dificultoso en cadáveres en estado de descomposición. La dificultad de los estudios se incrementa en la medida en la que avanza la descomposición del cadáver, en esta consideración los estudios toxicológicos no son la excepción. La determinación de la presencia de sustancias tóxicas como la cocaína en un cadáver es sin duda uno de los estudios indispensables en la necropsia, las muestras requeridas para llevarlas a cabo son principalmente sangre y orina, sin embargo en un cadáver en avanzada descomposición la colección de estas muestras no resulta posible debido a que no se encuentran en la misma disponibilidad o composición en las que se encontrarían en un cadáver fresco debido a la autolisis y putrefacción. A la par de la autólisis, la putrefacción e incluso la esquelitización es común la colonización de insectos necrófagos los cuales también alteran y propician la desaparición de tejidos y fluidos al alimentarse de ellos. Los primeros insectos en arribar y colonizar el cuerpo son los dípteros y de estos varias especies de moscas carroñeras de las familias Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae y Phoridae. En la etapa larval las moscas se alimenta de tejidos y fluidos del cadáver lo que las hace un potencial biacomulador de algunos tipos de tóxicos que hayan sido consumidos por la persona antes de su deceso y que pudieron incluso haber sido la causa de la muerte (Gennard, 2007; Byrd y Castner, 2001) 847
Las técnicas para la determinación de tóxicos en insectos son generalmente las mismas utilizadas para fluidos y tejidos, estas incluyen Radioinmunoanálisis (RIA), Cromatografía de Gases (GC), Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS) y Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución acoplada a Espectrometría de Masas (HPLC-MS). (Campobasso y cols., 2004). En estas técnicas la HPLC-MS presenta característica particulares que la hacen la técnica idónea para la aplicación forense y esto se debe a que los análisis son cortos, sensibles y específicos (Wood y Cols, 2006) La importancia de generar un método para la determinación de cocaína radica en que junto con la marihuana, son los principales sustancias ilícitas de mayor consumo, sin embargo la cocaína adquiere un mayor interés que la marihuana ya que esta última no se han reportado, hasta el momento, muertes por sobredosis. Por lo anterior, en cadáveres con una avanzada descomposición en la que la sangre, orina u órganos internos no estén disponibles, un método para determinar la presencia de cocaína en larvas de mosca puede ser de gran ayuda en la investigación criminalística al establecer el consumo ante-mortem de este estupefaciente (Introna, 2001). Material y Método Material entomológico. Las larvas fueron obtenidas de una colonia establecida usando como pie de cría larvas de Chrysomya rufifacies colectadas de tres cuerpos humanos en descomposición encontrados en el Estado de Nuevo León, México. La dieta de los adultos fue a base de agua, sacarosa, sacarosa 10% en solución e hígado fresco de res, este último como sustrato de oviposición y único alimento de las larvas. Las larvas utilizadas fueron del tercer estadio las cuales se lavaron con agua destilada, secaron con papel estraza y se sacrificaron por congelación a una temperatura de -20ºC por 24 horas. Reactivos. Los estándares de cocaína y benzoilecgonina-d3 utilizados fueron de la marca Cerillant (Lote FC032007-01A y FC110405). Los solventes fueron grado HPLC y de marca J.T. Baker. El ácido fórmico utilizado fue grado reactivo de marca J. T. Baker. Extracción. 400 mg de masa de larvas, previamente macerada y homogenizada en mortero, les fue agregado 80 µg/ml de una solución de 10 µg/ml de benzoilecgonina-d3 como estándar interno. Por triplicado se llevó a cabo una secuencia de extracción en la cual se agregó 100 µl de agua bidestilada y se homogenizó la mezcla con agitación de 5 min en vortex, posteriormente se agregó 400 µl de acetonitrilo y nuevamente agitación en vortex por 5 min, la mezcla se sonicó por espacio de 5 min y centrifugo por 10 min a 3000 rpm. El sobrenadante fue colectado en un tubo de ensayo. Posterior a las secuencias de extracción se agregó al tubo 500 µl de una solución de acetonitrilo: agua, 95:5%, con 0.05% de acido fórmico, la solución fue agitada en vortex, filtrada con poro de 0,45 nm y trasferida a un vial para su inyección en el cromatógrafo. Cromatografía de Líquidos. Se inyectó 10 µl del extracto en un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) marca Agilent modelo 1100. La columna utilizada fue de la marca Supelco modelo SB-C18 de 2.1 x 30 mm y 1.8 mm tamaño de partícula. La elución se llevo a cabo mediante una mezcla de solución A (agua: acetonitrilo, 98:2% + 0,05% de ácido fórmico) y B (acetonitrilo: agua, 98:2% + 0,05% de ácido fórmico) con un flujo constante de 300 µl/min. La composición inicial fue 90% A, seguido por un gradiente lineal hasta 50% A de 0 a 4 min. 848
Espectrometría de Masas. Se utilizó un Espectrómetro de Masas de Triple Cuadrupolo e Interfase de Electrospray (ESI-MSMS) marca Applied Biosystem modelo API 2000. La detección para ambas sustancia fue mediante el modo de Monitoreo de Múltiple Reacción (MRM), las transiciones seleccionadas en base a optimización para cocaína y benzoilecgonina- D3 fue de 304.0 182.4 y 293.5 171.2 m/z respectivamente. Validación. El método fue validado para selectividad, porcentaje de extracción, linealidad, precisión (intra-día e inter-días), exactitud, limite de detección y límite de cuantificación. La selectividad se evaluó al inyectar 10 blancos de la matriz. Para determinar el recobro (R%) de cocaína en la extracción se comparó el área obtenida de la inyección de muestras enriquecidas (1µg/g) antes y después de la extracción (n=3). La linealidad se evaluó mediante el coeficiente de correlación (r 2 ) obtenido de curvas de calibración (n=6) con seis puntos con concentraciones distintas de cocaína (10, 50, 100, 500, 1000 y 5000 ng/g) preparadas y analizadas en forma independiente por tres días consecutivos. La ecuación de la curva de calibración fue calculada usando el área relativa del pico del analito (cocaína) y del estándar interno (benzoilecgnina-d3). La exactitud y precisión intra-dia (n=5) e inter-días (n=15) fue determinada al analizar cinco replicas independientes de muestras enriquecidas con concentración de 30, 300 y 3000 ng/g en un mismo día y por tres días consecutivos, para la evaluación de la exactitud se calculo su porcentaje de error (E R %) y para la precisión el coeficiente de variación (CV%). El límite de cuantificación (LC) se estableció como el punto más bajo de la curva de calibración y el límite de detección (LD) al analizar muestras enriquecidas (n=3) cuya altura del pico de cocaína fuera tres veces la desviación estándar sobre la media del ruido. Aplicación del método a una muestra real. Se colectaron larvas directamente de restos de un cadáver humano cuya muerte propició investigación forense, los restos correspondieron a partes de extremidades inferiores las cuales fueron encontradas en una planta tratadora de aguas negras en el Estado de Nuevo León, en el mes de junio de 2010. Las larvas fueron extraídas de hendiduras de la pieza cadavérica y posteriormente lavadas vivas con agua destilada, una parte de ellas fueron sacrificas con calor y preservadas en alcohol 70% para su identificación, el resto fue sacrificada con temperatura de -20ºC a fin de analizarlas con el método desarrollado. Resultados Los tiempos de retención t R de la benzoilecgonina-d y la cocaína fueron de 0,42 y 0,45 min respectivamente. (Fig. 1) La inyección de los 10 blancos de la matriz no presentó señales superiores al LD. La R% de extracción fue de 82,38% ± 1.25. Las curvas de calibración (n=6) presentaron una r 2 0,99 y una ecuación de la recta y = 0,213±0x + 0,103±0.074 (Fig. 2). En la determinación de la precisión intra-día e inter-días los CV% fueron menores o igual a 7,45 y 10,00% respectivamente y la exactitud presentó E R % de 95,6 a 97,33%. El LC fue de 10 ng/g y el LD de 0,625 ng/g (Cuadro 1). Las larvas colectadas en los restos del cadáver humano fueron de la especie Cochliomyia macellaria en tercer estadio en las cuales se puso cocaína, sin, embargo su concentración no pudo ser determinada ya que en base a la curva de calibración su concentración se encontraba debajo del límite de cuantificación, pero por encima del límite de detección. 849
Área analíto / Area estandar interno Figura 1. Cromatograma de la inyección del tercer punto de la curva de calibración. Benzoilecgonina-D3 t R = 0,42 min; Cocaína t R = 0,45 min. 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Concentración Cocaína Figura 2. Curva de calibración con seis puntos. r 2 = 0,998; ecuación de la recta y = 0,213x + 0,158 850
Cuadro 1: Validación del método analítico para la determinación de cocaína Parámetro Valor Extracción (R%) n=3 82,38 ± 1.25 Sensibilidad Límite de detección Límite de cuantificación Linealidad Rango r 2 Pendiente Precisión (CV%) Intra día 30 ng/g n = 5 300 ng/g n = 5 3000 ng/g n = 5 Inter día 30 ng/g n = 15 300 ng/g n = 15 3000 ng/g n = 15 Exactitud (E R %) 30 ng/g n = 5 300 ng/g n = 5 3000 ng/g n = 5 0,625 ng/g 10 ng/g 10 5000 ng/g 0,99 0,213 2,17 8,84 7,45 6,78 10,00 8,07 95,60 97,33 96,20 Fig. 3. Resto de extremidad inferior del cadáver encontrado en la planta tratadora de aguas negras. 851
Discusión y Conclusiones En general la metodología desarrollada es rápida, simple y sensible. Se eligió acetonitrilo como solvente de extracción debido a que presenta una baja solubilidad de grasas, a diferencia de solventes como éter etílico, acetato de etilo o cloroformo. El resultado fue una metodología con un porcentaje de extracción superior al 80%. Los resultados obtenidos en la evaluación de los parámetros de linealidad, precisión y exactitud del método fueron aceptables (Food and Drug Administration, 2001; Thompson y cols., 2001) lo que significa que el método permite cuantificar, en forma confiable, cocaína en larvas desde 10 ng/g hasta 5000 ng/g. En cuanto a la sensibilidad es posible detectar la cocaína en concentraciones desde 0,625 ng/g y considerando que existe evidencia de acumulación de tóxicos en larvas de moscas (Byrd y Castner, 2001), el método podría determinar, indirectamente, la presencia de cocaína en cadáveres aún y cuando la concentración en el cuerpo humano fuese inferior o no pudiera determinarse en el debido al estado de descomposición. Aún y cuando no se pudo determinar la concentración de cocaína, si se estableció su presencia en las larvas de C. macellaria colectadas de partes de extremidades humanas (Figura 3), el propósito del método se cumplió al ser utilizado para considerar el consumo de cocaína ante-mortem en el cadáver y de esta forma inferir que cualquiera que fuese las circunstancias del deceso, la cocaína fue obtenida en una actividad delictiva. Literatura Citada Gennard, D. E. 2007. Forensic Entomology, An Introduction. John Wiley & Sons Ltd, England. 29-41 pp. Byrd, J. H. and Castner, J. L. 2001. Forensic entomology: The utility of arthropods in legal investigations. CRC Press. Florida. 331-340 pp. Campobasso, C. P., Gherardi M., Caligara M., Sironi L. and Introna F. 2004. Drugs analysis in blowfly larvae and in human tissues: a comparative study. International Journal of Legal Medicine. 118: 210-214. Wood, M., Laloup M., Samyn N., Ramírez-Fernández M., de Bruijn E., Robert M. and Boeck De G. 2006. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in forensic science. Journal of Chromatography A. 1130: 3-15. Introna, F., Campobasso C.P. and Goff. M.L. 2001. Entomotoxicology. Forensic Science International. 120: 42-47. Food and Drug Administration. 2001. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation. 2-4 pp. Thompson, M., Ellison S. L. R. Wood R. 2002. Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis, Pure Appl. Chem., 74: 835 855. 852