IV Curso Avanzado WHO GSS 2006 Buenos Aires 15 al 24 de mayo de 2006 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN EL DIAGNOSTICO DE Campylobacter jejuni/coli Viernes 19 de mayo María Rosa Viñas Servicio Bacteriología Sanitaria Departamento Bacteriología INEI ANLIS Carlos G. Malbrán
PRUEBAS BIOQUIMICAS PCR Métodos tradicionales de cultivo para Campylobacter spp. lentos y con requerimientos especiales (aproximadamente 5 días). Dificultad en la definición de especie por la prueba de hipurato - existencia de cepas de C. jejuni hipurato negativo - cepas de C. jejuni con baja producción de hipuricasa Bajo espectro de pruebas bioquímicas para caracterización fenotípica a nivel de las especies más frecuentemente implicados como agentes de transmisión alimentaria: Campylobacter jejuni/coli NECESIDAD DE UNA HERRAMIENTA DIAGNOSTICA RAPIDA APLICABLE A VIGILANCIA DE ALIMENTOS
OBJETIVOS IMPLEMENTACION Y ESTANDARIZACION DE LA REACCION DE PCR PARA LA IDENTIFICACION DE Campylobacter jejuni/coli, COMO UNA HERRAMIENTA DE CARACTERIZACION GENOTIPICA Y DIAGNOSTICA DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DEL ENSAYO DE PCR A PARTIR DE MUESTRAS DE ALIMENTOS INOCULADAS EXPERIMENTALMENTE CON Campylobacter jejuni/coli.
ACTIVIDADES DESARROLLADAS i- Puesta a punto de la técnica de PCR (protocolo OMS 2003) ii- Prueba de especifidad de la reacción. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 773 pb C. jejuni 364 pb C. coli Fig.1: Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR- Simple y Multiplex específica de especie Campylobacter jejuni /Campylobacter coli. Calle M: marcador de peso molecular DNA 100 pb, calle: 1 : aislamiento de Salmonella spp.; calle 2: aislamiento de Pseudomona aeruginosa, calle 3 : aislamiento de Enterococo spp., calle 4 : aislamiento de Escherichia coli, calle 5 : aislamiento de Klebsiella spp., calle 6: aislamiento de Staphylococcus spp, calle 7: cepa control Campylobacter jejuni, calle 8: cepa control Campylobacter coli, calle 9: cepas controles Campylobacter jejuni / coli, calle 10: mezcla de reacción sin templado.
Reactivos H 2 O calidad molecular Buffer 50 mm Tris-HCl 10X Cl 2 Mg 50mM 10 mg/ml BSA dntp (mix) 2.5 mm 10M primer Jun 3 10uM primer Jun 4 10uM primer coli 1 10uM primer coli 2 taq DNA polimerasa 5U/µl DNA Vol Final REACCION DE PCR Tabla 1. PCR para detección del gen especifico especie C. jejuni y C. coli Volumen ( µl ) 3,75 2,5 1 0,5 2 2,5 2,5 2,5 2,5 0,25 5 25 Concentración en la reacción 1 X 2,0 mm 0,02g% (5 ug/25 ul) 0.2mM 1,0 µm 1,0 µm 1,0 µm 1,0 µm 1,25U/ensayo aproxim. 100 ng En cada ensayo, procesar las cepas controles de Campylobacter jejuni/coli y como control del sistema la mezcla de reacción sin templado. (Control positivo y negativo) La utilización de BSA en la reacción es necesaria cuando se procesan muestras de alimentos.
MUESTRA DE HAMBURGUESA DE POLLO INOCULADA EXPERIMENTALMENTE CON Campylobacter jejuni /coli( Josefsen et al, 2004) * Previa determinación de UFC por siembra en agar sangre de Campylobacter jejuni/coli (colecc. cultivo Inst. C.G.Malbrán ) 18 ml de Caldo Preston con suplem. FBP / Caldo Bolton sin sangre 2 ml de solución de lavado de 25 g de hamburguesa de pollo / 250 ml SF fueron Inoculadas con 1ml C. jejuni/coli 0 UFC 1ml C. jejuni/coli 1-10 UFC 1ml C. jejuni/coli 10-100 UFC 1ml C. jejuni/coli 100-1000 UFC 18 hs, 42ºC. atmósfera de microaerofilia El crecimiento de Campylobacter jejuni/coli (100 ul) fue controlado sobre agar-skirrow. 1 ml de caldo de enriquecimiento fue procesado para la amplificación por PCR por el método de extracción del hervido / con resina Chelex 100.
EXTRACCION DE ADN POST-ENRIQUECIMIENTO 1 ML CALDO BOLTON/PRESTON Por hervido: centrifugar 5 min., resuspender en 1 ml de SF, centrifugar y resuspender en 300 ul agua calidad molecular Con Resina: centrifugar 5min., resuspender en 300ul de Resina Chelex 100 a 56ºC, 20 min y agitar 10 s. Incubar a 100ºC, 15 min. Mantener a 4ºC, listo para ser usado como Templado de DNA en PCR
DETECCION POR PCR DE MUESTRA DE ALIMENTO INOCULADA CON Campylobacter jejuni ENRIQUECIDA EN CALDO PRESTON: extracción por hervido Ensayo de sensibilidad 1 2 3 4 5 6 7 8 M 773 pb específico C. jejuni Fig.2 : Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR a partir de muestras de alimentos inoculadas experimentalmente con Campylobacter jejuni Calle1-5 : caldo Preston inoculado con 1-10 UFC/20 ml.; 10-100 UFC/20 ml; 100-1000 UFC/ 20 ml; 10 4-10 5 UFC/ 20ml; 10 5-10 6 UFC/ 20ml; calle 6: cepa control Campylobacter jejuni, calle 7: cepa control Campylobacter jejuni. calle 8: control negativo. Calle M : marcador de peso molecular DNA 100 pb.
DETECCION POR PCR DE MUESTRA DE ALIMENTO INOCULADA CON Campylobacter jejuni ENRIQUECIDA EN CALDO PRESTON: extracción con resina Chelex 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 773pb específico C.jejuni Fig. 3. Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR a partir de muestras de alimentos inoculadas con Campylobacter jejuni Calle1-5 : caldo Preston inoculado con 1-10 UFC/20 ml.; 10-100 UFC/20 ml; 100-1000 UFC/ 20 ml; 104-105 UFC/ 20ml; 105-106 UFC/ 20ml; calle 6-10: cepas control negativas, calle 11: cepa control Campylobacter jejuni, calle 12: control negativo. Calle 13: mezcla de reactivos, Calle M : marcador de peso molecular DNA 100 pb.
DETECCION POR PCR DE MUESTRA DE ALIMENTO INOCULADA CON Campylobacter jejuni/coli ENRIQUECIDA EN CALDO BOLTON Ensayo de sensibilidad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M Fig.4. Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR a partir de muestras de alimentos inoculadas experimentalmente con Campylobacter jejuni /coli en caldo Bolton Calles1-4 : caldo Bolton inoculado con 1, 1-10.; 10-100; 100-1000 UFC/ 20 ml de la cepa control Campylobacter coli; calle 5, 6, 7 y 8 :caldo Bolton inoculado con 0, 1-10.; 10-100; 100-1000 UFC/ 20 ml de la cepa control Campylobacter jejuni. Calles 10, 12 y 13 : controles negativos; calle 9 y 15: cepa control Campylobacter coli, calle 11 y 14: cepa control Campylobacter jejuni. calle 16: control del sistema (mezcla de reacción sin templado). Calle M : marcador de peso molecular DNA 100 pb.
RESULTADOS La reacción de PCR fue puesta a punto según el protocolo de OMS 2003, con algunos ajustes de concentración de Cl 2 Mg y primers. Los aislamientos de C. jejuni / coli de la colección de cultivos del Inst. C.G. Malbrán resultaron positivos para el gen específico de especie. Las muestras de ADN de las cepas de los microorganismos ensayados en la prueba de especificidad resultaron negativos para los respectivos amplímeros. La implementación de la reacción de PCR en Multiplex permitió detectar en una misma reacción los genes que codifican tanto para C. jejuni como C.coli La aplicación de PCR permitió la detección de hasta 1 UFC de C. jejuni / coli inoculadas experimentalmente a una suspensión de lavado de hamburguesas de pollo en caldo de enriquecimiento.
RESULTADOS DE LA INTERACCION DEL MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO Y EXTRACCION DE ADN CON LA PCR La aplicación de PCR a muestras de alimento inoculadas y enriquecidas en caldo Bolton permitió la detección de aislamientos de C.coli susceptibles a la combinación de antibióticos en caldo Preston. El enriquecimiento en caldo Bolton favoreció el desarrollo de Campylobacter coli /jejuni en bajo inóculo ( 1-10 y 10-10 2 UFC). El enriquecimiento en caldo Bolton 18-24 hs aseguró un buen nivel de detección principalmente por aumento en el número de células target y dilución de sustancias inhibidoras derivadas del alimento. La extracción de ADN con resina mejoró la intensidad de la señal de PCR, aunque con la extracción por hervido se logró una buena sensibilidad en alimentos (hasta 1UFC de C. jejuni/coli en el caldo)
CONCLUSIONES La reacción de PCR- Multiplex para C. jejuni / coli permite simultáneamente confirmar la identidad a nivel de especie en forma rápida (24-48 hs) y específica. La implementación de la reacción de PCR permitirá resolver las dificultades que suelen presentarse en los ensayos fenotípicos (C. jejuni hipurato negativo ) PCR representa una herramienta de caracterización genotípica de Campylobacter jejuni/coli y herramienta diagnóstica factible de ser transferible a otros laboratorios. La implementación de PCR a partir de alimentos constituye una herramienta útil de ser aplicable al control de alimentos y vigilancia epidemiológica.
Muchas gracias!!!!!!!