CITOMETRIA DE FLUJO Y LMA José Ángel Díaz D Arias C.H.U.S.
INTRODUCCIÓN Qu Qué es la citometría a de flujo (CMF)? Es una tecnología a para caracterización n y el análisis de células c que mide y analiza simultáneamente múltiples características físicas f de partículas que se mueven en un fluido a traves de un haz de luz Un citómetro tiene 3 partes fundamentales: Fluídica Óptica Electrónica
INTRODUCCIÓN Puede analizar partículas de 0.2 a 50 micras Nos indica el tamaño o relativo, complejidad interna (granularidad) e intensidad de fluorescencia De forma general un número n conocido de células c (generalmente 2 x 10e6) se incuba con los monoclonales elegidos tras lo cual se somete a un proceso de lisado de hematies y posterior lavado
INTRODUCCIÓN Para que sirve la CMF? Se ha convertido en una herramienta indispensable para el diagnostico, clasificación, estadiaje y monitorización n de neoplasias hematológicas Identifica células c de diferentes líneas, l así como su maduración Detecta células c anormales anormales Nos indica el fenotipo de las células c anormales anormales,, sobre lo que podemos emitir una diagnostico/sospecha diagnostica Identificación n pronostica
Existe una población at atípica pica? Una vez recibida una muestra con sospecha de LA se realiza un panel de screening para: Determinar si existen células c at atípicas picas Saber si estas células c son inmaduras Identificar la línea l celular (mieloide, linfoide, bifenotipica, ( bilineal
MARCADORES A ESTUDIAR EGIL: Screening y posterior panel orientado Marcadores en screening: CD34, CD33, CD13, CD10, CD19, CD45, CD7, CD14, MPOcito, CD3cito, CD3s, HLA DR Posteriormente para serie mieloide, monocitica,megacariocítica y eritroide: CD15, CD11b, CD16, CD10, CD33, CD13, CD56, CD64, CD65, CD117, CD19, Tdt, CD2, CD7, CD3, CD4, CD14, CD61, CD41a, CD42b, CD71, CD36, Glicoforina A, CD45 Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11) Woods. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:S14 S22 (2007) Sumeet Gujral Indian J Pathol Microbiol 2008
J.J.M. van Dongen. Euroflow consortium
SERIE GRANULOCÍTICA MONOCITOS LINFOCITOS + ERITROBLASTOS
CD45
Como sabemos que es mieloide? EGIL EGIL, Catovsky et al
Definición n de línea l Se precisa una puntuación n >2 en esa línea l según EGIL. Para definir una L.A. Bifenotípica (BAL) se precisan más m s de 2 puntos en 2 lineas diferente. Esto es útil para diferenciar las aberrancias de línea y no confundirlas con BAL
Definición n de línea l En la nueva clasificación n OMS las BAL se han renombrado renombrado y se ha hecho una definición n más m estricta: Leucemias agudas de fenotipo mixto Linea mieloide: MPO, o en diferenciación n monocítica al menos dos de los siguientes CD11c, CD14, CD64, lisozima, o bien esterasas inespecificas (citología) ( a Línea linfoide T: CD3 citoplásmico o de superficie (más s ( raro Línea linfoide B: requiere de varios marcadores. Si CD19 es fuerte uno de los siguientes CD79a, CD22, CD10 Si CD19 es débil d se precisan 2 de los anteriormente mencionados
Loken MR. Et al Leukemia Research 32 (2008) 5 17 MADURACIÓN
MADURACIÓN Kussick SJ Arch Pathol Lab Med 127, 2003
Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
CFM FAB FAB Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)
GENOTIPO FENOTIPO Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)
GENOTIPO FENOTIPO
( t(15;17 M3
M4/M5 MLL
EMR La detección n de EMR por CMF presenta algunas dificultadas debido a la heterogeneidad de los fenotipos leucémicos. Para su detección n se precisa la localización n previa de LAP (fenotipos asociados a leucemia) en los blastos al diagnóstico stico. Estos LAP sólo s se pueden detectar en un 50 80% de las LAM y se basan en: Asincronismos antigénicos nicos Infidelidad de línea l Sobreexpresión n de antígenos Ausencia de antígenos específicos de línea l Alteraciones evidentes en FSC/SSC La sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10e 3 3 / 10e 4 4 y hasta 10 6
EMR Diversos estudios han mostrado que la detección n de EMR, así como su cuantía a se asocia a distintos riesgos de recaída San Miguel et al Post inducción n 0.5% (recaida 67% vs 20%), Postintensificación n 0.2% (69% vs ( 32% Venditti et al Postconsolidación n 0.035% (77% vs ( 17% Al Mawali et al 0.15% postinducción San Miguel et al 2001 4 categorias: 1)Muy bajo riesgo recaida: <10 4 2)Bajo riesgo 10 4 4 a 10 3 3)Riesgo intermedio 10 3 3 a 10 2 4)Alto Riesgo >10 2
FENOTIPOS LEUCEMICOS ( LAP ) Al Mawali et al Am J Clin Pathol 2009;131:16 26
San Miguel et al 2002 Best Practice & Research Clinical Hematology 105 118 Vol 15 No 1
CITOMETRIA DE FLUJO Y LMA José Ángel Díaz D Arias C.H.U.S.
POBLACIONES NORMALES