NOVAS CONTRIBUIÇOES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO DAS LEUCEMIAS AGUDAS E CRÓNICAS. II Forum de citometria,

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1 NOVAS CONTRIBUIÇOES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO DAS LEUCEMIAS AGUDAS E CRÓNICAS II Forum de citometria, Coimbra, 24 de Janeiro de 2009

2 INMUNOFENOTIPAJE DE HEMOPATÍAS MALIGNAS /1994: Del desarrollo técnico y tecnológico a las clasificaciones de la OMS de las hemopatías malignas /2008: La identificación específica de células leucémicas: del fenotipo normal a los perfiles fenotípicos aberrantes /-: Contribuciones recientes del inmunofenotipaje de hemopatías: apuntando al futuro

3 CONTRIBUCIONES RECIENTES DEL INMUNOFENOTIPAJE EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS HEMOPATÍAS MALIGNAS - Estandarización de los análisis inmunofenotípicos - Diagnóstico de LMA con displasia multilineal - Identificación rápida de grupos citogenéticos relevantes de leucemias agudas - Caracterización ontogénica de los SLPC

5 ESFUERZOS DE ESTANDARIZACIÓN DE LOS ANÁLISIS IMUNOFENOTÍPICOS - CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute): - Stetler-Stevenson et al.: Clinical flow cytometric analysis of neoplastic hematolymphoid cells; Approved guideline. CLSI document H43-A2. CLSI, CCS (Clinical Cytometry Society): - Davis et al: 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasias. Clin Cytometry, 72B, ESCCA (European Society for Clinical Cell Analysis: - European Leukemia Net ( - Consenso Latinoamericano (Clin Cytometry, 1998 y 2006)

6 IMUNOFENOTIPAJE POR CITOMETRIA DE FLUJO Muestra Análisis tradicional Preparación y marcaje de múltiples alícuotas de la muestra Adquisición de información sobre cada alícuota Análisis de datos de cada alícuota/fichero de datos Nueva aproximación Fusionar ficheros de datos Calcular los datos no medidos Identificación, selección y caracterización por un experto de las poblaciones celulares de interés Interpretación guiada de los resultados Aprender los patrones normales Análisis automático de datos de cada paciente

7 NUEVAS ESTRATEGIAS ANALÍTICAS: Toda la información disponible simultáneamente para todas las células analizadas Visualización simultánea de todo el fenotipo de cada población celular identificada

8 SLPC-B: IDENTIFICACIÓN AUTOMÁTICA DE FENOTIPOS ABERANTES AL DIAGNÓSTICO (Sólo se muestran las células B CD19+) Caso 51 A Case 52 C Case 53 E MUESTRAS DE SP AL DIAGNÓSTICO Información sobre los parámetros con > poder discriminante: (Paneles de seguimiento de EMR más informativos) Pedreira et al, CytometryA 2008 (Published online)

9 SLPC-B: IDENTIFICACIÓN AUTOMÁTICA DE EMR (Sólo se muestran las células B CD19+) Caso 51 A Case 52 C Case 53 E MUESTRAS DE SP AL DIAGNÓSTICO B D F MUESTRAS DE SP TRAS TRATAMIENTO Células B neoplásicas clasificadas correctamente: 99,1%. Caso 51 Células neoplásicas clasificadas correctamente: 97,4% Case 52 Células B neoplásicas clasificadas correctamente: 92% Case 53 Pedreira et al, CytometryA 2008 (Published online)

10 CONSTRUCCIÓN DE UN POOL DE MUESTRAS DE REFERENCIA PARA DIAGNÓSTICO LLC-B típica L.Folicular L.C.Manto Información sobre los parámetros con > poder discriminante: (las combinaciones de Ac Mo más informativas para diagnóstico)

11 Añadir datos de un nuevo SLPC-B para su clasificación automática LLC-B típica LFol LCM Immunophenotipo similar a LLC-B típica

12 Añadir datos de un nuevo SLPC-B para su clasificación automática LLC-B típica LF LF LCM Immunophenotipo similar a LLC-B típica Immunophenotype different from all three goups

13 SLPC-B: Clasificación automática de datos Caso de LLC-B comparado con datos fenotípicos de 3 grupos de diferentes SLPC-B: LLC-B vs LCM LLC-B LLC-B vs LF LF LCM LLC-B LCM vs LF LCM LF

14 CLASIFICACIÓN FENOTÍPICA DE SLPC-B MEDIANTE PROCEDIMIENTOS DE ANÁLISIS AUTOMÁTICO DE DATOS Subgrupos diagnósticos LLC-B típica LLC-B atípica LCM LF Otros Subgrupos fenotípicos definidos mediante análisis de componentes principales LLC-B LCM LF Otros 22/22 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 7/7 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) / (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1/9 (11%) 8/9 (89%) 0 (0%) 0 (0%) 1/8 (12%)* 0 (0%) 7/8 (88%) Caso que correspondia a un linfoma MALT. * Panel de marcadores: CD5, CD11c, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD43, CD79b, CD3, FMC7

16 CLASIFICACIÓN OMS ( ) LMA con translocaciones citogenéticas recurrentes" LMA con displasia multilineal LMA secundaria Otras LMA (clasificación morfológica/fenotípica)

17 LMA DE NOVO : FENOTIPOS ABERRANTES EN CÉLULAS GRANULOMONOCÍTICAS DE MO Línea celular Fenotipos aberrantes (%) Neutrófilos Células monocíticas Total 12/18 (67%) 5/18 (27%) 13/18 (72%)

18 LMA: MADURACIÓN ALTERADA A GRANULOCITO NEUTROFILO Blastos Neutrófilos en maduración CD34 APC (Approaching) AP C C AP C D 4-4- C D 1 3 CD13-PE MSSA CD CD13-PE Neutrófilos en maduración 3 P E P E CD11b FI TC CD11b-FITC MSSA MO NORMAL CD11b FI TC CD11b-FITC MSSA MO DE LMA CD 3 Precursores CD34+

19 ANÁLISIS DE CLONALIDAD (TEST HUMARA) EN LMA de novo #21: neutrophils / HpaII digested #21: neutrophils / -- Control cell population (Lymphocytes)/HpaII digested Control cell population (Lymphocytes) / --

20 LMA DE NOVO : FENOTIPOS ABERRANTES Y CLONALIDAD EN MO Línea celular % Fenotipos aberrantes Casos policlonales Casos clonales Neutrófilos 1/6 (17%) Monocitos 0/6 (0%) Total 1/6 (17%) 11/12 (92%) 5/12 (42%) 12/12 (0%)

22 L.A.: ASOCIACIONES GENOTIPO-FENOTIPO Diagnóstico BCP-ALL AML Lesión genética Fenotipo aberrante Sensibilidad/ Especificidad t(9;22)* CD34hi,CD+, CD38lo,CD13lo 0%/90% t(12;21) CD34het,CD+, CD20-,CD13lo 86%/0% 11q23 CD34+,CD-, 7.1+,CD15+ 95%/85% t(15;17) CD34-/+,CD15-/lo, HLADR-, CD13het 0%/99% Inv(16) MPOhi,CD2-/lo, monocitos aberrantes ND t(8;21) CD19+,CD56+ ND CD56+,7.1-/+, CD19-/lo,CD2-/+ ND 11q23 *Leukemia 15:406, 2001 Am J Clin Pathol 111:467, 1998 Leukemia 14:1225, 2000

23 CAMBIOS FENOTÍPICOS ASOCIADOS A LA MADURACIÓN NORMAL A GRANULOCITO NEUTRÓFILO MIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO CAYADO/ NEUTRÓFILO CD15 CD13 CD13 CD64 MPO 3 CD65 CD33 CD35 CD11b 2 CD16 1 CD34 HLA-DR CD117 CD54 CD

24 FENOTIPOS ABERRANTES: EL MODELO DE LA t(15;17) METAMYELOCYTE CD15 CD64 CD13 BAND/ NEUTROPHIL CD13-PE CD15 MYELOCYTE CD13-PE PROMIELOCITO MPO CD13 CD65 CD CD11b FITC -> CD11b-FITC CD35 CD 11b FITC -> CD11b-FITC CD11b HLA-DR CD117 Orfao et al, Haematologica, 1999 T-SSC T-SSC CD11b CD CD CD15 FITC -> CD15-FITC M3 CD15+ PROMIELOS 4 CD 0 1 CD 15 FITC -> CD15-FITC

25 DETECCIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE TRANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS POR CMF Patentes: US 6,6,498 B1 (26 de agosto de 2003) US 6,686,165 B2 (3 de febrero de 2004) beads coated with anti-a antibody bead fusion gene gene B 3' bead transcription A A B A B B A A B A B B B A B FITC-conjugated anti-b antibody bead A B B translation A cell lysate A 5' gene A

26 EVALUACIÓN DEL KIT BCR-ABL RUO POR EL GRUPO EuroFlow (n=144) n=61 n=41 n=12 n=17 n=13

27 KIT BCR-ABL RUO: CONCLUSIONES PRELIMINARES.- Elevada sensibilidad y especificidad: - Concordancia absoluta con los resultados de PCR: 12/41 LLA-pB (todos adultos) 12/12 LMC 0/29 LMA y LLA-T.- Cantidad de proteína bcr/abl: - Patrón heterogéneo con dos grupos de casos positivos: Expresión elevada: IMF Expresión relativamente baja: IMF 500 y < IMF de las muestras negativas < Diferente patrón de expresión en LLA-pB y LMC: LLA-pB: 83% (/12) mostraron expresión elevada LMC: 75% (9/12) mostraron expresión baja/intermedia* * Expresión baja o activitad residual de proteasas?)

28 PANEL DE TUBOS DE ESFERAS PARA LA CLASIFICACIÓN DE LEUCEMIAS AGUDAS Precursor-B-ALL AML MLL T-ALL BCR-ABL PML-RARA MLL-AF4 CALM-AF TEL-AML1 AML1-ETO MLL-AF9 LMO2 E2A-PBX1 CBFB-MYH11 MLL-AF HOX11L2 MLL-ENL TAL1 ( MLL-AF4) MLL-AF6

29 DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN BCR-ABL Y E2A-PBX 0% K562 % 697/K562 R2 = green = BCR beads R3 = pink = E2A beads 0% 697 % K562/697

31 LGL-T CD4+: REPERTORIO TCRVβ Família TCRVβ Nºcasos (%) Família TCRVβ Nºcasos (%) -Vβ 1 -Vβ 2.1 -Vβ 3.1 -Vβ 4 -Vβ 5.1 -Vβ 5.2 -Vβ 5.3 -Vβ 6.1 -Vβ 6.7 -Vβ 7.1 -Vβ 7.2 -Vβ Vβ 9.1 0/34 3/34 2/34 0/34 0/34 0/34 0/34 0/34 0/34 1/34 0/34 0/34 1/34 (0%) (9%) (6%) (0%) (0%) (0%) (0%) (0%) (0%) (3%) (0%) (0%) (3%) -Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ Vβ /34 (0%) 0/34 (0%) 12/34(35%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 2/34 (6%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) 0/34 (0%) Lima et al, Am J Pathol, 2003

32 Secuencias de aa de VDJ de TCRVβ de LGL-T TCRαβ+/CD4+ Case N. V-J usage CDR2 3`end of Vβ13.1 CDR3 (N-Dβ1-N) 5`end of Jβ 1 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS KQGV TEAFFG 2 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS KQGA TEAFFG 3 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CAS RKQGA TEAFFG 4 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS YQGA TEAFFG 5 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS SQGT TEAFFG 6 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CAS RHQGS TEAFFG 7 Vβ13S1-J1.2 SVGAGI CASS HQGA NGYTFG 8 Vβ13S1-J1.5 SVGAGI CASS YQGA QPQHFG 9 Vβ13S1-J1.5 SVGAGI CASS YQGS QPQHFG Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CAS RRQGY TEAFFG 12 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS YQGA TEAFFG 13 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CAS RRQGA TEAFFG 14 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CAS NLQGS TEAFFG 15 Vβ13S1-J1.1 SVGAGI CASS YQGSA EAFFG

33 CD69 FITC -> CD25 PE -> CD25 PE -> CD69 FITC -> Control CD69 FITC -> CD69 FITC -> 4 48h 2 CD25 PE -> 0 CD25 PE -> 4 CD25 PE -> 24h CD25 PE -> RESPUESTA LGL-T ANTI-hCMV: expresión de Ags de activación en células T clonales CD69 FITC -> EBV CD69 FITC -> CMV 4 Rodriguez-Caballero et al, Blood, 2008

34 Concentración de IFN-γ soluble (pg/ml) RESPUESTA DE LOS LGL-T CD4+ A LISADO VS PÉPTIDO MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK DE hcmv: SECRECIÓN DE IFN-γ Peptido Lisado de hcmv LGL-T CD4+ TCRVβ13.1+ (n=4) LGL-T CD4+ No-TCRVβ13.1+ (n=4) Rodriguez-Caballero et al, Blood, 2008

35 PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA (n=00) DE LGL-T CD4+ CLONALES (n=00) ESTIMULADOS CON hcmv CD69+. Células T CD4+ clonales (n=4 casos) Estimulados (hcmv) No estimulados CD69+ CD69. CD69- Células T-CD4+ clonales (n=4 casos) Estimulados (hcmv) No estimulados Células T CD4+ clonales (n=4 casos) No estimulados Estimulados con hcmv CD69+ CD69- MATRIZ DE CORRELACIÓN Rodriguez-Caballero et al, Blood, 2008 REPRESENTACIÓN MDS (distancias euclidianas)

36 Ontogenia de las LGL-CD4+ Respuesta inmune (expansión oligoclonal) Factores: hcmv HLA-II Factores: Transformación neoplásica Secuencia CDR3 Expansión (Mono)clonal Transformación maligna

37 AGRADECIMIENTOS I Alaejos, E Arroyo, A Brufau, M Corral, E Fernández, R García-Sanz, JM Hernández A López, I Martín, MV Mateos, J Pérez, A Rasillo, I Sánchez, JM Sayagües, L Vázquez, I Abuin, M Barbon, J Briones, E Conde, L Escribano, R Galindo, P Garrido, S Herrero, MA Montalban, J Nomdedeu, L Palomera, F Prosper, A Ruiz, B Suquia, MC Algueró, P Barcena, C. Bueno, MC del Cañizo, J Flores, D González, J Hernández, C López-Berges, L Martín, P Menéndez, JA Pérez Simón O Redondo, ML Sánchez, L Suárez, MB Vidriales, M Alvarez-Mon A Barez, MJ Calmuntia, MA Cuadrado, J Fdez-Calvo, JL Garcia, A Gascon, JJ Lahuerta, E Montserrat, R Nuñez, A Pandiella, F Ramos, F Ruiz-Cabello, JF Tomas, J Almeida, S Barrena, MD Caballero A Duran, M Fuentes, MT González, P Hernández, R Lopez-Perez, M Martín-Ayuso, MJ Nieto, M Pérez Andrés, A Ríos, F Sanguez-G. MD Tabernero, E Villaron ML Amigo J Bladé, M Carnero, B Diaz-Agustin, P Fisac, J Garcia-Conde, L Guerras, A León, JM Moraleda, E Ojeda, JA Portero, MJ Rodriguez, M Sanz, M Tormo, M Almeida, A Balanzategui, C Chillon, G Ercilla, MA García, M González, M Jara, A Macedo, S Matarranz, W Nieto, D Primo, R Rivas-Amoedo, JF San Miguel, C Teodósio, M Angulo, A Bortoluci J Ciudad, A Espinosa, A García, N Gutierrez, Q Lecrevisse, A Martínez G Mateo, B Paiva, S Quijano, A Rodríguez, M Santiago, JM Vaquero, F Arriba D Borrego, F Casanova, J Diaz-Mediav. L Florensa, J Garcia-Laraña, I Heras, A Martín, MJ Moro, F Ortega, A Prados, C Rozman, A Sempere A Urbano JL Arroyo, P Bravo, C Cerveró, A Durántez, J Galende, F Garrido, N Heras, M Martínez, JL Navarro, F Ortuño, A Prieto, M Rozman, D Subira, T Vallespi,

38 OBRIGADO