La metabolómica predice la recurrencia de ictus después de un ataque isquémico transitorio

ARTÍCULOS La metabolómica predice la recurrencia de ictus después de un ataque isquémico transitorio Mariona Jové, PhD* Gerard Mauri-Capdevila, MD* Idalmis Suárez Serafi Cambray, PhD Jordi Sanahuja, MD Alejandro Quílez, MD Joan Farré, MD Ikram Benabdelhak Reinald Pamplona, MD, PhD Manuel Portero-Otín, MD, PhD Francisco Purroy, MD, PhD Dirección para correspondencia a: fpurroygarcia@gmail.com RESUMEN Objetivo: Descubrir, mediante el uso de la metabolómica, nuevos biomarcadores para la recurrencia de ictus (RI) con una potencia de predicción superior a las actuales. Métodos: El análisis metabolómico se realizó por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en muestras de plasma de una cohorte inicial de 131 pacientes con AIT reclutados < 24 horas después del inicio de los síntomas. El análisis de patrones y de perfiles metabolómicos, realizados por método estadístico multivariado, reveló biomarcadores específicos para RI y aterosclerosis de grandes arterias (AGA). El uso de estos métodos en una cohorte independiente (162 sujetos) confirmaron los resultados obtenidos en la primera cohorte. Resultados: Los análisis metabolómicos podrían predecir el RI usando métodos de reconocimiento de patrones. Las bajas concentraciones de una lisofosfatidilcolina específica (LysoPC [16 : 0]) se asociaron significativamente con RI. Por otra parte, LysoPC (20 : 4) también surgió como un potencial biomarcador de RI, aumentando el poder de predicción de la edad, la presión arterial, las características clínicas, la duración de los síntomas, la escala de diabetes (ABCD2) y la patología de grandes arterias. Los individuos que presentan recurrencia temprana (< 3 meses) tienen un patrón metabolómico específico, a diferencia de los pacientes sin RI y RI tardío. Por último, un potencial biomarcador de AGA, LysoPC (22 : 6) también se ha descripto. Conclusiones: El uso de la metabolómica en la investigación de biomarcadores de RI mejora el poder predictivo de predictores convencionales como ABCD2 y AGA. Además, los métodos de reconocimiento de patrones nos permiten discriminar no sólo a los pacientes con RI sino también casos tempranos y tardíos de RI. Neurology 2015;84:36-45. GLOSARIO ABCD2 = edad, presión arterial, características clínicas, duración de los síntomas y la escala de diabetes (age, blood pressure, clinical features, duration of symptoms and diabetes scale); AGA= aterosclerosis de grandes arterias; COR = característica operativa del receptor; Lp-FLA = lipoproteína asociada a fosfolipasa A; LysoPC = lisofosfatidilcolina; MDI = mejora de discriminación integrada; MNR = mejora neta reclasificada; PLS-DA = análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales; RI = recurrencia de ictus; SM/SM = espectrometría de masas en tándem; TS = transportador de solutos. El ictus es la principal causa de discapacidad neurológica adquirida 1. En casi el 20% de los casos, el ictus es precedido por el AIT, proporcionando una gran oportunidad para su prevención. 2 Por ende, el riesgo de ictus es particularmente alto durante los pocos días posteriores a la aparición de los síntomas de AIT. Sin embargo, los pacientes con AIT constituyen un grupo heterogéneo en cuanto a los síntomas, factores de riesgo, la patología subyacente y el pronóstico temprano. 3 Hasta ahora, la presencia de ateroesclerosis de gran arteria (AGA) es el principal predictor establecido de ictus posterior, 4-6 sin embargo, no se ha definido una herramienta de pronóstico definitiva para la recurrencia de ictus (RI). Recientemente, en la investigación del ictus, ha habido un interés significativo en el desarrollo de biomarcadores para la predicción de RI. Enfoques candidatos han dejado pocos biomarcadores útiles en el pronóstico de los pacientes con AIT, tales como proteína C reactiva, 7 copeptina 8 y la lipoproteína asociada a la fosfolipasa A (Lp-PLA), 9 pero la validez de los biomarcadores propuestos es controversial. 10 Respecto al descubrimiento de biomarcadores para la clasificación de la etiología, sólo la actividad de Lp-PLA2 ha demostrado ser eficaz para el detección de AGA, 9,11 y hace muy poco los niveles del péptido natriurético proencefálico han sido asociados con el diagnóstico de la fibrilación atrial. 12 *Estos autores contribuyeron igualitariamente en este trabajo. De NUTREN Centro de Nutrigenómica (Nutrigenomics Center) (M.J., M.P.-O.), Departamento de medicina experimental (R.P.), ParcCientífic i Tecnològic Agroalimentari de Lleida Universitat de Lleida IRBLleida, Lleida; Unidad de Ictus (G.M.-C., I.S., S.C., J.S., A.Q., I.B., F.P.), Departamento de Neurología, Universitat de Lleida, Hospital Universitari Arnau de Vilanova de Lleida, IRBLleida; y Laboratori Clinic (J.F.), Universitari Arnau de Vilanova de Lleida, IRB Lleida, España. Ir a Neurology.org para declaraciones de intereses completas. La información sobre fondos y aquellas declaraciones relevantes para los autores, si existiesen, se encuentran al final del artículo. Neurology 84 Enero 2015 1

Nuevas técnicas como la metabolómica proporcionan la oportunidad de identificar nuevos biomarcadores. 13 Esto se ha aplicado a la investigación en patología cerebrovascular, 14,15 pero no hay descripciones de RI después de la recuperación precoz, como la que ocurre en pacientes con AIT. El objetivo del presente estudio fue realizar un análisis metabolómico en plasma de una cohorte de los pacientes con AIT con el fin de encontrar (1) nuevos biomarcadores candidatos asociados con RI, (2) patrones de recurrencia temporal y (3) el potencial impacto de la AGA en el perfil metabolómico plasmático. Los resultados fueron posteriormente validados en una cohorte independiente, asegurando así la robustez del biomarcador candidato resultante. MÉTODOS Aprobaciones de protocolo habituales, registros y consentimientos de pacientes. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario Arnau de Vilanova. Se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes donantes. Sujetos. Prospectivamente reclutamos pacientes consecutivos con déficit neurológicos transitorios que fueron evaluados por un neurólogo en el departamento de emergencias durante las primeras 24 horas después del inicio de síntomas (registro REGITELL). 16 Estos pacientes fueron divididos de forma aleatoria en 2 cohortes. AIT se definió como la aparición aguda de síntomas cerebrales focales o monoculares que duran < 24 horas atribuibles a la isquemia cerebral. El número de pacientes con AIT atendidos en nuestro hospital durante el período del estudio (enero 2008 a enero 2012) determinó el tamaño de la muestra. Se registraron perfil de factores de riesgo; características clínicas; edad, presión arterial, manifestaciones clínicas, duración de los síntomas y escala de la diabetes (ABCD2, age, blood pressure, clinical features, duration of symptoms and diabetes scale) 17 ; ultrasonido y los protocolos de neuroimágenes. Seguimiento y medidas de resultados. La medida de resultado fue RI. Un médico vascular realizó visitas clínicas durante el seguimiento a los 7días, 3 meses y cada 6 meses. Se requirieron datos de imágenes para confirmar isquemia cerebral en todos los pacientes en los que se consideró RI. La recurrencia de un AIT no fue considerada una medida de resultado. Análisis de la metabolómica. Para el análisis de la metabolómica no dirigida, los metabolitos fueron extraídos de muestras de plasma y analizados utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Análisis estadístico. Los cálculos estadísticos se realizaron con software SPSS para Macintosh, versión 20 (SPSS, Chicago, IL), R software, o Stata 11 (StataCorp, CollegeStation, TX). RESULTADOS Características clínicas de la población estudiada. La tabla 1 muestra las características basales de ambos grupos, que comprende 293 pacientes. Como factores de confusión para el análisis metabolómico, se excluyeron diferencias significativas en las características de los factores de riesgo vascular, síntomas clínicos, score en ABCD2, subtipos etiológicos o tratamientos al alta entre las 2 cohortes. La anticoagulación previa tendió a ser más frecuente entre los pacientes de la primera cohorte. Las cohortes no difirieron significativamente en términos de RI. Un total de 35 pacientes tenían RI. Dos pacientes murieron debido a la isquemia recurrente. En el análisis univariado (tabla 2), sólo AGA y el score ABCD2 se asociaron con RI. El clopidogrel y la anticoagulación al alta se asociaron con RI. El riesgo de accidente cerebrovascular posterior exhibe un perfil metabolómico específico. El análisis metabolómico no focalizado en la cohorte 1 identificó un biomarcador plasmático potencialmente indicador de un futuro RI. Las características moleculares detectadas (presentes en al menos el 50% de las muestras en el mismo grupo) se representan en el mapa de calor (figura 1B). Pacientes con AIT con RI tenían una firma metabolómica específica, como se muestra por el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA, partial least squares discriminant analysis) (figura 1C), y alcanzaron una precisión que oscila del 66% (en la ionización positiva, especificidad = 0,63; sensibilidad = 0,95) al 73% (en la ionización negativa, especificidad = 0,68; la sensibilidad = 1). Estadísticas univariadas revelaron que 94 iones diferenciaron pacientes con RI de pacientes sin RI (p < 0,05). Mediante el uso de enfoques ortogonales (masa exacta, la distribución isotópica, espectrometría de masas en tándem [SM/SM], base de datos de tiempo de retención), se identificaron 6 moléculas: 1-monopalmitin, ácido dodecanoico, mesoeritritol, treonato y lisofosfatidilcolina (LysoPC [16 : 0]) reducida y miristoil-etanolamina elevada (p < 0,05) en pacientes RI. Posterior al análisis de la vía, estas moléculas convergían en el metabolismo de ácidos grasos libres, metabolismo energético y transportador de solutos (TS) mediado por las vías de transporte transmembrana. Los patrones temporales de recurrencia de ictus definen perfiles metabolómicos específicos. Los resultados (figura 1D) muestran que el PLS-DA de perfiles metabolómicos tiene una alta precisión para diferenciar grupos de RI temprano y de RI tardío. Un total de 325 iones diferenciaron los grupos por análisis de la varianza (p < 0,05). Estas moléculas (14 metabolitos identificados entre todos los iones diferenciales) indicando recurrencia temprana, se agruparon en diferentes vías metabólicas con 13 en común entre recurrencia y patrones temporales de recurrencia, incluyendo el metabolismo de ácidos grasos (biosíntesis, transporte y receptores) y la regulación de la secreción de insulina. Los pacientes con AGA tienen un patrón metabolómico específico. Nos centramos en la etiología AGA por su importancia como predictor de RI. 4-6 Evaluamos perfiles metabolómicos de los pacientes con estenosis carotídea sintomática o estenosis intracraneana de al menos 50%. Los resultados (figura 1E) revelaron que los perfiles metabolómicos son capaces de ofrecer una alta precisión para predecir la presencia de la AGA (PLS-DA exactitud del 91%-98%, positivo: especificidad = 0,79; sensibilidad = 1; negativo: especificidad = 0,86; sensibilidad 2 2015 American Academy of Neurology

Tabla 1 Características comparativas, tratamientos y recurrencia de ACV Variable Cohorte 1 (n = 131) Cohorte 2 (n = 162) Total (n = 293) Factores de riesgo vascular Edad, (años), promedio (DE) 70.5 (11.4) 72.1 (11.2) 71.7 (10.8) Sexo masculino 85 (64,9) 94 (58,0) 179 (61,1) ACV previo 28 (21,4) 35 (21,6) 63 (21,5) Hipertensión 91 (69,5) 111 (68,5) 201 (68,8) Enfermedad coronaria 18 (13,7) 21 (13,0) 39 (13,3) Diabetes mellitus 41 (31,3) 47 (29,0) 88 (30,0) Tabaquismo 18 (13,7) 19 (11,7) 37 (12,6) Hipercolesterolemia 49 (37,4) 61 (37,7) 110 (37,5) Fibrilación atrial previa 17 (13,0) 17 (10,5) 34 (11,6) Tratamientos basales Aspirina 30 (22,9) 36 (22,4) 66 (22,6) Clopidogrel 9 (6,9) 18 (11,2) 27 (9,2) Anticoagulación 19 (14,5) 12 (7,5) 31 (10,6) Estatinas 43 (32,8) 46 (28,6) 89 (30,6) Bloqueantes sistema renina angiotensina 65 (49,6) 78 (48,1) 144 (49,1) Síntomas clínicos Duración < 10 min 12 (9,3) 17 (10,8) 29 (9,9) 10-59 min 50 (38,2) 61 (37,7) 111 (37,9) 1 h 69 (52,7) 84 (51,9) 153 (52,2) AIT agrupado 36 (27,5) 33 (20,4) 65 (22,2) Debilidad 70 (53,4) 85 (52,4) 155 (52,9) Síntomas sensitivos aislados 12 (9,2) 13 (8,0) 25 (8,5) Trastorno del habla 78 (59,5) 103 (64,0) 181 (62,0) Vertebrobasilar 10 (7,6) 12 (7,5) 22 (7,5) ABCD2 5,2 (4,0-6,0) 5,1 (4,0-6,0) 5,1 (4,0-6,0) Subtipos etiológicos Arterioesclerosis de grandes arterias 33 (25,2) 32 (19,9) 65 (22,3) Cardioembolismo 23 (17,6) 37 (23,0) 60 (20,5) Pequeños vasos 28 (21,4) 30 (18,6) 58 (19,9) Causa indeterminada 47 (35,9) 62 (38,5) 109 (37,3) DWI (n = 251) 59 (45,7) 56 (36,8) 115 (40,9) Punto de corte temporales Recurrencia ACV a los 7 días de seguimiento 6 (4,6) 5 (3,1) 11 (3,8) Recurrencia ACV a los 90 días de seguimiento 8 (6,1) 7 (4,3) 15 (5,1) Recurrencia ACV al año de seguimiento 13 (9,9) 10 (7,2) 23 (8,5) Recurrencia ACV durante seguimiento 20 (15,3) 15 (9,3) 35 (11,9) Abreviaturas: ABCD2 = edad, presión arterial, características clínicas, duración de los síntomas y escala de diabetes; dwi = imagen ponderada en difusión (diffusion weighted imaging). = 1). Un total de 73 metabolitos fueron significativamente diferentes (t de Student) entre AGA y no AGA, con las resultantes moléculas identificadas después del análisis SM/SM siendo androsterona, ácido esteárico, ácido ascórbico y LysoPC (22 : 6) todos elevados en pacientes con AGA (p < 0,05). Resultados de validación utilizando una cohorte independiente. El análisis multivariado de una cohorte independiente (cohorte 2) confirmó (1) la firma metabolómica de RI; (2) patrones temporales de RI basados en la diferenciación metabolómica; y (3) las diferencias entre AGA y no AGA. Las vías comunes Neurology 84 Enero 2015 3

Tabla 2 Variables asociadas con la recurrencia de accidentes cerebrovasculares en ambas cohortes de pacientes Recurrencia ACV a los 7 días Recurrencia ACV 90 días Recurrencia ACV al 1ño Recurrencia durante seguimiento Variable No (n = 282) Sí (n = 11) p No (n = 278) Sí (n = 15) p No (n = 247) Sí (n = 23) p No (n = 258) Sí (n = 35) p Factores riesgo vascular Edad (años), media (DE) 71.6 (10.9) 75.5 (8.6) 0,247 71.6 (10.9) 74.5 (8.2) 0,318 71.3 (11.01) 75.6 (7.5) 0,073 a 71.7 (11.6) 76.1 (6.5) 0,148 Masculino 175 (62,1) 4 (36,4) 0,115 172 (61,9) 7 (46,7) 0,239 152 (61,5) 11 (47,8) 0,198 157 (60,9) 22 (62,9) 0,819 ACV previo 63 (22,4) 1 (9,1) 0,295 63 (1) 1 (6,7) 0,204 51 (20,7) 6 (26,1) 0,548 55 (21,4) 9 (25,7) 0,627 Hipertensión 193 (68,4) 9 (81,8) 0,347 191 (68,7) 11 (73,3) 0,706 165 (66,8) 19 (82,6) 0,120 174 (67,7) 28 (80,0) 0,307 Enfermedad coronaria 39 (13,8) 0 (0) 0,370 39 (14,0) 0 (0) 0,234 30 (12,1) 4 (17,4) 0,468 30 (11,7) 8 (22,8) 0,403 Diabetes mellitus 83 (29,4) 5 (45,5) 0,255 81 (29,1) 7 (46,7) 0,158 71 (28,7) 9 (39,1) 0,341 69 (26,8) 19 (54,3) 0,103 Tabaquismo 37 (13,1) 0 (0) 0,370 37 (13,3) 0 (0) 0,231 35 (0) 0 (0) 0,053 a 35 (13,6) 2 (5,7) 0,220 Hipercolesterolemia 105 (37,2) 5 (45,5) 0,752 105 (37,8) 5 (33,3) 0,792 88 (35,6) 10 (43,5) 0,500 97 (37,7) 13 (37,1) 0,859 Fibrilación auricular previa a 32 (11,3) 2 (18,2) 0,487 32 (11,5) 2 (13,3) 0,688 25 (6(10,1) 6 (26,1) 0,034 a 25 (9,7) 9 (25,7) 0,211 Tratamiento basal Aspirina 63 (22,4) 3 (27,3) 0,706 63 (22,7) 3 (20,0) 1 52 (21,1) 6 (26,1) 0,581 57 (22,2) 9 (25,7) 0,637 Clopidogrel 27 (9,6) 0 (0) 0,607 27 (9,7) 0 (0) 0,376 19 (7,7) 4 (17,4) 0,119 23 (8,.9) 4 (11,4) 0,635 Anticoagulación 29 (10,3) 2 (18,2) 31 (10,6) 29 (10,5) 2 (13,3) 0,726 24 (9,8) 6 (26,1) 0,030 22 (8,5) 9 (25,7) 0,016 Estatinas 84 (30,0) 5 (45,5) 0,321 84 (30,4) 5 (33,3) 0,164 72 (29,4) 10 (43,5) 0,161 77 (30,0) 12 (34,3 0,637 Bloqueantes renina-angiotensina 134 (48,0) 9 (81,8) 0,033 132 (48,0) 11 (73,3) 0,066 116 (47,5) 14 (60,9) 0,221 121 (46,9) 22 (62,9) 0,105 Síntomas clínicos Duración < 10 minutos 29 (10,2) 0 (0) 0,482 30 (10,8) 0,175 23 (9,3) 0 (0) 0,297 28 (10,9) 1 (2,9) 0,913 10-59 minutos 107 (37,9) 4 (36,4) 107 (38,4) 0 (0) 93 (37,7) 10 (43,5) 100 (38,9) 11 (31,4) 1 h 146 (51,9) 7 (63,6) 141 (50,7) 4 (26,7) 131 (53,0) 13 (56,5) 126 (49,0) 27 (77,1) AIT agrupado 60 (21,3) 5 (45,5) 0,071 60 (21,6) 5 (33,3) 0,336 55 (22,3) 5 (21,7) 0,954 60 (23,3) 5 (14,3) 0,738 Debilidad 147 (52,1) 8 (72,7) 0,227 145 (52,2) 10 (66,7) 0,302 145 (52,2) 10 (66,7) 0,907 132 (51,4) 23 (65,7) 0,290 Síntomas sensitivos aislados 25 (8,9) 0 (0) 0,607 23 (8,3) 2 (13,3) 0,372 23 (9,3) 2 (8,7) 0,922 22 (62,9) 3 (8,6) 0,834 Trastorno del habla 171 (60,9) 10 (90,9) 0,057 169 (6,0) 12 (80,0) 0,140 148 (60,2) 17 (73,9) 0,264 155 (60,3) 26 (74,3) 0,138 Vertebrobasilar 21 (7,5) 1 (9,1) 0,842 21 (7,6) 1 (6,7) 0,896 18 (7,3) 1 (4,3) 1 21 (7,6) 1 (0,0) 0,954 4 2015 American Academy of Neurology

Tabla 2 Continuación Recurrencia ACV a los 7 días Recurrencia ACV 90 días Recurrencia ACV al 1ño Recurrencia durante seguimiento Variable No (n = 282) Sí (n = 11) p No (n = 278) Sí (n = 15) p No (n = 247) Sí (n = 23) p No (n = 258) Sí (n = 35) p ABCD2 5,0 (4,0-6,0) 6,0 (4,0-7,0) 0,058 a 5,0 (4,0-6,0) 6,0 (4,0 7,0) 0,056 a 5,0 (4,0 6,0) 6,0 (4,0 7,0) 0,335 5,0 (4,0 6,0) 6,0 (4,0 7,0) 0,005 Etiología Arterioesclerosis grandes vasos 57 (20,3) 87 (72,7) 0,002 56 (20,2) 9 (60,0) 0,007 a 47 (19,1) 12 (52,2) 0,002 49 (19,1) 16 (45,7) 0,008 Cardioembolismo 59 (21,0) 1 (9,1) 59 (21,3) 1 (6,7) 47 (19,1) 6 (26,1) 52 (20,2) 8 (22,9) Enfermedad pequeños vasos 57 (20,3) 1 (9,1) 55 (19,9) 3 (20,0) 51 (20,7) 3 (13,0) 53 (20,6) 5 (14,3) Causa indeterminada 96 (34,2) 1 (9,1) 95 (34,3) 2 (13,3) 89 (36,2) 2 (8,7) 103 (40,1) 6 (17,1) Anormalidades en DWI 113 (41,4) 2 (25,0) 0,478 110 (40,9) 5 (41,7) 0,957 101 (42,3) 10 (50,0) 0,502 99 (39,8) 16 (50,0) 0,267 LysoPC 20:4 < 1,14,000 (veces EM) 135 (48,0) 7 (63,6) 0,310 132 (47,7) 10 (66,7) 0,189 118 (47,8) 15 (65,2) 0,109 116 (45,1) 26 (74,3 0,001 LysoPC 16:0 > 0.710 (veces EM) 206 (72,0) 10 (90,1) 0,57 202 (72,7) 14 (93,3) 0,172 175 (70,9) 20 (87,0) 0,313 183 (70,9) 32 (91,4) 0,107 Abreviaturas: ABCD2 = edad, presión arterial, características clínicas, duración de los síntomas y escala de diabetes; DWI = imagen ponderada en difusión; EM = espectrometría de masas; LysoPC = lisofosfatidilcolina. a No significativo después del ajuste de Bonferroni. afectadas por los patrones temporales de recurrencia entre las 2 cohortes independientes incluyen la biosíntesis de los ácidos grasos insaturados y las vías relacionadas al transportador de solutos. En ambas cohortes, LysoPC (16 : 0) se redujo significativamente en los pacientes RI temprano (figura 2, A y B), mientras que LysoPC (22 : 6) se encontró elevado en pacientes con AGA (figura 2, C y D). Potencial predictivo de los biomarcadores RI descriptos. A fin de definir la capacidad de estos potenciales biomarcadores, se realizaron curvas de característica operativa del receptor (COR) utilizando metabolitos presentes en al menos 70% de las muestras en el mismo grupo (RI y no RI), agrupando ambas cohortes, debido al bajo número de RI. Los resultados (figura 2E, tabla 3) apoyan el rol de LysoPC (20 : 4) plasmático como un potencial biomarcador, aumentando significativamente el poder predictivo del score ABCD2 o AGA desde 64%-67% a 71%, según los test de la mejora neta reclasificada (MNR) o la mejora de discriminación integrada (MDI). La prueba de Hosmer-Lemeshow para la calibración de modelos de predicción de riesgo muestra que mientras que el modelo ABCD2 estaba bien calibrado (χ 2 7,05; p < 0,069), el modelo ABCD2 + AGA no lo estaba (χ 2 13,79; p = 0,003). El modelo ABCD2 + AGA + LysoPC (20 : 4) mostró la más alta calibración (χ 2 3,58; p < 0,309), mientras que el modelo ABCD2 + AGA + LysoPC (16 : 0) mostró los valores más bajos de calibración (χ 2 17,33; p = 6e-04). Cuando se consideró solo RI temprana, un metabolito no identificado surgió como un potencial biomarcador, aumentando además la capacidad de predicción del score ABCD2 o el score de AGA (de 62%-67% a 71%). DISCUSIÓN Los resultados demuestran la viabilidad y la utilidad del enfoque metabolómico para revelar potenciales biomarcadores para RI después de AIT, y para su predictor independiente más frecuente, AGA. Identificamos biomarcadores candidatos tanto para la predicción de RI como para detección AGA, ambos pertenecientes a la familia LysoPC. Estos biomarcadores surgieron tras el análisis en 2 cohortes independientes (n = 131; n = 162), reforzando el potencial de generalización del estudio. Inicialmente se identificó que un pequeño grupo de metabolitos eran diferentes entre pacientes con RI y no RI. Tomando este pequeño grupo de metabolitos, se llegó a una precisión > 60% para segregar estas 2 poblaciones, lo que sugiere que una combinación de un número relativamente bajo de metabolitos es, al menos, tan buena como las variables clínicas, imagenológicas y etiológicas en la predicción de RI. Trabajos a futuro dedicados a identificar estos y nuevos metabolitos ayudarán a aumentar la exactitud de este test y, en última instancia, desarrollar una herramienta más cuantificable para pacientes a fin de evaluar su riesgo de RI. Bajos niveles de LysoPC (16 : 0) parecen ser un potencial predictor de recurrencia, especialmente en pacientes con RI temprano. Este compuesto es Neurology 84 Enero 2015 5

Figura 1 Diseño del estudio y perfil metabolómico de los pacientes con AIT A Pacientes seleccionables de la cohorte original N = 144 Pacientes excluidos: n = 13 Hiponatremia (1) Patología psicosomática (2) Migraña (3) Epilepsia (2) Tumor cerebral (2) Angiopatía amiloidea (1) Hematoma subdural (1) Amnesia global transitoria (1) Cohorte original n = 131 B Análisis metabolómico Biomarcadores propuestos Cohorte validada n = 162 Pacientes elegibles para la cohorte validada n = 179 Pacientes excluidos: n = 17 Hipoglucemia (2) Patología psicosomática (3) Migraña (2) Epilepsia (3) Tumor cerebral (1) Hematoma subdural (1) Amnesia global transitoria (2) Meningitis reumática (1) Mielopatía cervical (2) no RI RI (A). Diagrama de flujo del diseño experimental. Perfil metabolómico de recurrencia de ictus (RI) y aterosclerosis de grandes arterias (AGA) en pacientes con AIT en la cohorte 1. (B). Representación del mapa de calor de la agrupación jerárquica de las características moleculares que se encuentran en cada muestra. Cada línea del gráfico representa la masa exacta ordenada por el tiempo de retención, coloreada por su intensidad y referenciada con una línea de base de la mediana/media a través de las muestras. La escala de -10 azul (abundancia baja) a +10 rojo (abundancia alta) representa la abundancia normalizada en unidades arbitrarias. Los gráficos de análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) demuestran que RI ([C] puntos azules representan las muestras de plasma de RI; los rojos representan muestras de plasma de no-ri) y los patrones de recurrencia temporal de AIT ([D] recurrencia temprana [< 90 días] está representado en puntos azules, medio [> 0,90 días y < 1] en rojo, y tarde [> 1 año] en marrón) determinan un metaboloma plasmático. (E).Gráficos tridimensionales de PLS-DA muestran diferencias entre los pacientes con AGA. Puntos azules representan las muestras de plasma AGA y los rojos no AGA. 6 2015 American Academy of Neurology

Figura 2 Lisofosfatidilcolinas como biomarcadores de recurrencia de AIT (A) Lisofosfatidilcolina (LysoPC) (16 : 0) surgió como un potencial biomarcador sanguíneo de recurrencia de ictus([a] cohorte 1; [B] cohorte 2). ** Indica diferencias significativas (p < 0,0001) por análisis de varianza con el test de comparaciones múltiples de Tukey. LysoPC (22 : 6) como un biomarcador en sangre de aterosclerosis de grandes arterias (AGA) ([C] cohorte 1; [D] cohorte 2). * Indica diferencias significativas por t de Student (al menos p < 0,05). (E) La inclusión de los niveles de LysoPC (20 : 4) a edad, presión arterial, características clínicas, duración de los síntomas y escala de diabetes (ABCD2 ) y el score AGA a la curva característica del receptor operante aumenta el poder predictivo de recurrencia de ictus (áreas : ABCD2 = 0,646; p = 0,005; ABCD2 + AGA = 0,678, p = 0,001; ABCD2 + LAA + LysoPC (20 : 4) = 0,711; p < 0,001; prueba de mejora de discriminación integrada (MDI) para la comparación de modelos de predicción: p < 0,0001). (F) Estimaciones de Kaplan- Meier de la proporción de pacientes que quedan libres de cualquier evento cerebral isquémico. La línea roja indica Lyso PC (20 : 4) < 1,14,000 cuentas de EM; línea negra indica LysoPC (20 : 4 )> 1,14,000 cuentas EM. EM = espectrometría de masas. uno de los productos de Lp-PLA2, cuyos niveles incrementados han demostrado estar en relación con un pronóstico adverso después de stroke. 11,18. Por otra parte, los niveles altos de Lp-PLA2 y LysoPC (16 : 0) están asociados con placas carotídeas sintomáticas. 19 LysoPC (16 : 0) por sí mismo aumenta en el cerebro después el ACV 20,21 donde media en el reclutamiento de fagocitos 22 que pueden contribuir al daño isquémico cerebral 23 y también produce efectos neuroinflamatorios cuando es aplicado en el SNC. 24 Todos estos resultados podrían señalar un efecto beneficioso de la reducción de los niveles de LysoPC (16 : 0) e ir en contra de nuestra afirma- ción de que condiciona un riesgo de RI temprano, pero a pesar de que los altos niveles de LysoPC (16 : 0) plaquetarios se correlacionan con altos niveles plasmáticos y plaquetarios de Lp-PLA2, los niveles plasmáticos de LysoPC (16 : 0) no lo están. 25 Se ha demostrado que LysoPC (16 : 0) plasmático puede inhibir la actividad de Lp-PLA2 tanto in vitro como in vivo 26 suprimiendo de este modo sus propiedades neuroinflamatorias. 27 Además de la supresión de la actividad de Lp-PLA2, LysoPC (16 : 0) plasmático es neuroprotector en modelos de isquemia cerebral, 28 principalmente a través de la activación de los canales de potasio TREK-1. 29 Por último, se Neurology 84 Enero 2015 7

Tabla 3 Exactitud predictiva de las variables clínicas y biomarcadores derivados del estudio de metabolómica para el ictus recurrente a los 7 días, 90 días, 1 año de seguimiento y durante todo el seguimiento Recurrencia ictus durante seguimiento Recurrencia ictus a 7dias Recurrencia ictus a 90 días Recurrencia ictus al año Biomarcador Cohorte ABC (IC 95%) p ABC (IC 95%) p ABC (IC 95%) p ABC (IC 95%) p ABCD2 Ambas cohortes 0,65 (0,47-0,84) 0,085 0,64 (0,47-0,80) 0,075 0,56 (0,42-0,69) 0,359 0,65 (0,54-0,76) 0,005 Cohorte de validación 0,70 (0,42-0,98) 0,126 0,68 (0,43-0,93) 0,110 0,55 (0,34-0,76) 0,608 0,68 (0,51-0,85) 0,023 ABCD2 + AGA Ambas cohortes 0,72 (0,55-0,89) 0,013 0,68 (0,52-0,84) 0,019 0,60 (0,46-0,74) 0,103 0,68 (0,57 0,79) < 0,001 Cohorte de validación 0,77 (0,53-1,00) 0,038 0,73 (0,49-0,97) 0,039 0,61 (0,39-0,83) 0,257 0,72 (0,55 0,89) 0,004 ABCD2 + AGA + LysoPC 20:4 < 1,14,000 Ambas cohortes 0,72 (0,54-0,89) 0,014 0,70 (0,54-0,85) 0,011 0,62 (0,49-0,75) 0,048 0,71 (0,60 0,82 < 0,001 Cohorte de validación 0,75 (0,49-1,00) 0,054 0,74 (0,51-0,96) 0,035 0,61 (0,40-0,83) 0,228 0,74 (0,57 0,91) 0,002 ABCD2 + AGA +LysoPC 16:0 0,710 Ambas cohortes 0,64 (0,45-0,82) 0,110 0,64 (0,45-0,81) 0,111 0,57 (0,43-0,72) 0,293 0,67 (0,56 0,79) 0,002 Cohorte de validación 0,72 (0,37-1,00) 0,192 0,67 (0,56-0,79) 0,002 0,56 (0,31-0,81) 0,590 0.72 (0.53 0.90) 0,010 Abreviaturas: ABCD2 = edad, presión arterial, características clínicas, duración de los síntomas y escala de diabetes; ABC= área bajo la curva ROC; AGA= aterosclerosis de grandes arterias; IC= intervalo de confianza; LysoPC= lisofosfatidilcolina. sabe que LysoPC (16 : 0) es un potente inductor de la producción de iones superóxido en células endoteliales 30 y niveles controlados de superóxido sirven como factores angiogénicos en la angiogénesis isquémica. 31 Debido a todas estas propiedades neuroprotectoras, la reducción de los niveles plasmáticos de LysoPC (16 : 0) podría contribuir a un riesgo temprano de RI. Sin embargo, cuando evaluamos los modelos de riesgo potenciales teniendo en cuenta LysoPC (16 : 0), éste no agregó un valor significativo por sobre los parámetros clínicos explicados por la presencia de ABCD2 y AGA. Esto concuerda con el hecho de que ABCD2 y AGA están estrechamente relacionados con los eventos fisiopatológicos invocados previamente en la homeostasis de LysoPC (16 : 0) (enumerados anteriormente). El rol potencial del metabolismo LysoPC en RI fue reforzado por el hallazgo de LysoPC (20 : 4) como un potencial biomarcador de RI basado en las curvas COR de cohortes agregadas. Curiosamente, después de que el uso de MDI, MNR y de la prueba Hosmer-Lemeshow, las estadísticas indican que LysoPC (20 : 4) mejora significativamente la capacidad de predicción de los scores ABCD2 y AGA combinados. Estos datos están en concordancia con otras especies LysoPC que contienen ácidos grasos de cadena 20C, reducidos en plasma en modelos experimentales de isquemia. 32 Esta molécula exhibe un potencial antiinflamatorio en modelos preclínicos, 33 reforzando el papel de la inflamación en la recurrencia isquémica o tolerancia. Curiosamente, al igual que con otros biomarcadores, 8,11 LysoPC exhiben el potencial de aumentar la exactitud pronóstica de las puntuaciones clínicas o AGA y podría ayudar a las decisiones de gestión, una hipótesis a ser validada con mayores estudios. Por último, hemos identificado LysoPC (22 : 6) como un potencial biomarcador de AGA. Hasta donde conocemos, no hay estudios previos que se hayan centrado en el papel de LysoPC (22 : 6) en la formación o la estabilidad de la placa carotídea, pero niveles aumentados en los pacientes sintomáticos con AGA podrían apuntar a un papel en estos procesos. Los ácidos grasos poliinsaturados N-3, como el ácido docosahexaenoico (22 : 6), son precursores de moléculas implicadas en la fase de resolución de la inflamación. Por lo tanto, niveles más altos de LysoPC (22 : 6) en AGA podría constituir un indicador de una respuesta reactiva a la inflamación asociada con el desarrollo de la placa de ateroma. Como limitaciones del presente trabajo, reconocemos la heterogeneidad y el pequeño tamaño de la muestra para RI en la población estudiada. El metaboloma, incluso en pacientes saludables fenotípicamente similares, exhibe una variación considerable a través del tiempo. 34-36 Además, las muestras fueron tomadas en la sala de emergencia sin controlar la ingesta previa de alimentos. Sin embargo, los resultados proporcionados se fortalecieron por el uso de 2 cohortes independientes. Además, no somos capaces de identificar un porcentaje importante de metabolitos presentes en las muestras, debido 8 2015 American Academy of Neurology

al importante cuello de botella en metabolómica: la falta de base de datos de metabolitos. 37 Sin embargo, el uso de bases de datos con la masa exacta y tiempo de retención en sistemas cromatográficos reproducibles facilitarán la identificación futura de estos metabolitos. En el futuro, la metabolómica podría ser útil para detectar nuevos biomarcadores relacionados con otro interesante fenómeno relacionado con la isquemia transitoria, la tolerancia isquémica. Pacientes con ictus isquémico no lacunar con episodios recientes previos de AIT tienen un pronóstico favorable, lo que sugiere un efecto neuroprotector del AIT mediante la inducción de un fenómeno de isquemia precondicionada. 38 CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES Mariona Jové: diseño y conceptualización del estudio, análisis e interpretación de los datos, la redacción y revisión del contenido intelectual del manuscrito. Gerard Mauri-Capdevila: diseño y conceptualización del estudio, el análisis y la interpretación de los datos, redacción y revisión del contenido intelectual del manuscrito. Idalmis Suárez: análisis de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Serafí Cambray: diseño y conceptualización del estudio, la interpretación de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Jordi Sanahuja: análisis e interpretación de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Alejandro Quílez: análisis e interpretación de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Joan Farré: análisis e interpretación de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Ikram Benabdelhak: análisis e interpretación de los datos, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Reinald Pamplona: diseño y conceptualización del estudio, la revisión del contenido intelectual del manuscrito. Manuel Portero-Otín: diseño y conceptualización del estudio, análisis y la interpretación de los datos, la redacción y revisión del contenido intelectual del manuscrito. Francisco Purroy: diseño y conceptualización del estudio, el análisis y la interpretación de los datos, redacción y revisión del contenido intelectual del manuscrito. RECONOCIMIENTOS Los autores agradecen a los donantes de plasma por su apoyo y permiso. FONDOS PARA EL ESTUDIO Con el apoyo de la Generalitat de Catalunya (2009SGR 735), el Ministerio español de Sanidad ( FIS 11-02033), y la Marató Fundación de TV3 (95/C/2011). Los financiadores no participaron en el diseño, recolección y análisis de datos, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Las muestras se obtuvieron con el apoyo de IRBLleida biobanco y RETICS BIOBANCOS (RD09/0076/00059). DECLARACIÓN DE INTERESES Los autores declaran ningún conflicto de interés en relación con el manuscrito. Ir a Neurology.org para todos los detalles. Recibido el 23 de febrero de 2014. Aceptado en su formato final el 19 de agosto de 2014. BIBLIOGRAFÍA 1. Heuschmann PU, Di Carlo A, Bejot Y, et al. Incidence of stroke in Europe at the beginning of the 21st century. Stroke 2009;40:1557 1563. 2. Rothwell PM, Warlow CP. Timing of TIAs preceding stroke: time window for prevention is very short. Neurology 2005;64:817 820. 3. Merwick A, Kelly PJ. Transient ischaemic attack clinics and management of transient ischaemic attacks. Curr Opin Neurol 2011;24:50 58. 4. Purroy F, Montaner J, Molina CA, Delgado P, Ribo M, Alvarez-Sabín J. Patterns and predictors of early risk of recurrence after transient ischemic attack with respect to etiologic subtypes. Stroke 2007;38:3225 3229. 5. Ois A, Gomis M, Rodríguez-Campello A, et al. Factors associated with a high risk of recurrence in patients with transient ischemic attack or minor stroke. Stroke 2008;39:1717 1721. 6. Purroy F, Jiménez Caballero PE, Gorospe A, et al. 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