5 Análisis Cuantitativo de la población Linfoide T en la Espondilitis Anquilosante C. F. García, J. Escobar, C. Hanabergh, F. Chalem El objetivo de esta investigación fue realizar el análisis cuantitativo de la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anquilosante. Fueron cuantificadas la población linfoide T total y las subpoblaciones ayudadora/ inductora y citotóxica/supresora en un grupo de 11 pacientes con espondilitis anquilosante, que fue comparado con un grupo control de 20 individuos normales y con un grupo de 11 pacientes con artritis reumatoidea. Los grupos de estudio fueron caracterizados mediante las pruebas de tipificación de HLA-B27 y factor reumatoideo. Se estableció la existencia de una tendencia al aumento en el porcentaje promedio de linfocitos T CD8+ y a la disminución en la relación CD4/CD8 en el grupo espondilitis anquilosante comparado con el grupo control. Este aumento puede obedecer a la activación de clonos con función citotóxica dirigida contra componentes del tejido conectivo de las articulaciones sacroilíacas y vertebrales. Los resultados obtenidos sugieren la participación de la citotoxicidad mediada por células en la patogénesis de la espondilitis anquilosante. INTRODUCCION La espondilitis anquilosante es una forma inflamatoria, crónica y progresiva de artritis seronegativa de las articulaciones sacroilíacas, vertebrales Dr. Carlos F. García R.: Departamento de Patología y Laboratorios, Fundación Santa Fe de Bogotá; Sr. Jaime Escobar L.:Estudiante Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia; Sta. Cecilia Hanabergh A,: Bacterióloga, Universidad Javeriana; Dr. Fernando Chalem: Profesor Asociado de Medicina y Reumatologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia; Jefe Departamento de Medicina Interna, Fundación Santa Fe de Bogotá. Solictud de separatas al Dr. García. y periféricas (1). Compromete el cartílago articular y el tejido conectivo de la cápsula articular, el anillo fibroso discal y los tejidos de inserción osteoligamentosa y el periostio. Existe una marcada correlación entre el desarrollo de la espondilitis anquilosante y la expresión del aloantígeno de histocompatibilidad HLA- B27: 95% de los paciente con espondilitis anquilosante posee el alelo HLA-B27 que sólo existe en el 7% de los individuos normales (2-4). La espondilitis anquilosante se asocia con un determinante antigénico común a todos los subtipos del antígeno HLA-B27 y no con un determinante antigénico específico de un subtipo particular (5). La patogénesis de la espondilitis anquilosante ha sido relacionada con la infección entérica por Klebsiella pneumoniae (6). Ha sido propuesta la existencia de una reactividad cruzada entre antígenos de Klebsiella pneumoniae y el antígeno HLA-B27, o una modificación del antígeno HLA- B27 inducida por un factor soluble derivado del microorganismo (6-10). Los resultados en relación con las alteraciones cuantitativas y funcionales de la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anquilosante son contradictorios. Se ha informado una disminución en el porcentaje de linfocitos (11), células linfoides T (11), células T CD4+ (ayudadoras/inductoras) (11, 12), células T CD8+ (citotóxicas/supresoras) (11) y en la relación CD4/CD8 (12). Existe disminución de la respuesta proliferativa (11) y de la actividad supresora (13) de células T inducida por Concanavalina A y en la respuesta proliferativa de la técnica de cultivo mixto de linfocitos autólogos (Mixed Lymphocyte Reaction) estimulada por la fracción enriquecida para monocitos o para linfocitos B (11). Acta Médica Colombiana Vol 14 N 1 - Enero-Febrero 1989
6 C.F. García y Cols. Nuestro objetivo fue realizar un estudio cuantitativo de la población linfoide T de sangre periférica en pacientes con espondilitis anquilosante. MATERIAL Y METODOS Pacientes y Controles: El análisis cuantitativo de la población linfoide T (CD5+) y las subpoblaciones ayudadora/inductora (CD5+ CD4+) y citotóxica/supresora (CD5+ CD8+) fue realizado en un grupo de 11 pacientes con diagnóstico confirmado de espondilitis anquilosante (fase activa o inactiva), constituido por nueve hombres y dos mujeres cuyas edades oscilaban entre 20 y 59 años (promedio 34 años), que fue comparado con un grupo de 21 individuos sin evidencia clínica de enfermedad articular inflamatoria, constituido por 16 hombres y cinco mujeres cuyas edades oscilaban entre 23 y 58 años (promedio 37 años), y con un grupo de 11 pacientes con diagnóstico confirmado de artritis reumatoidea constituido por ocho hombres y tres mujeres cuyas edades oscilaban entre 22 y 60 años (promedio 39 años). En el grupo de espondilitis anquilosante ninguno de los pacientes recibía tratamiento con glucocorticoides. Métodos: Los grupos de pacientes e individuos control fueron caracterizados mediante la tipificación del aloantígeno de histocompatibilidad HLA- B27 (prueba de microlinfocitotoxicidad por exclusión con azul de tripan al 0.3%); prueba cualitativa y cuantitativa para factor reumatoideo (método de Singer-Plotz, Látex RA-Laboratorios Achebe, y ORTHO RA Test, Ortho Diagnostic Systems); prueba cualitativa (método de aglutinación de partículas de látex) y cuantitativa (técnica de inmunonefelometría, sistema ICS Beckman Inc.) para proteína C reactiva; y evaluación de la velocidad de sedimentación globular (método de Wintrobe-una hora). Para cada grupo se realizó el recuento total y diferencial de leucocitos de sangre periférica y la cuantificación de células de la población linfoide T (porcentaje relativo y cantidad absoluta obtenida a partir del recuento total de leucocitos) y células de las subpoblaciones ayudadora/inductora y citotóxica/supresora. La cuantificación de células linfoides T de sangre periférica fue realizada sobre una fracción de células mononucleares enriquecida para células linfoides. Una muestra de sangre venosa heparinizada (16 ml) fue incubada por 30 minutos a 37 C con 100 mg de hierro carbonilo (para eliminar células fagocíticas) y centrifugada a través de un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (densidad 1,077 g/dl) a 2000 r.p.m. por 15 minutos. Las células de la interfase fueron separadas, lavadas 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) enriquecida con suero fetal bovino (SFB) al 10%, resuspendidas en un volumen final de 1 ml y sometidas a recuento total (azul de tripan) y diferencial (violeta de cresilo). Esta fracción estuvo constituida por 96% de células linfoides, 3% de células monocitoides y 1% de leucocitos polimorfonucleares. La fracción de células mononucleares enriquecida para células linfoides fue resuspendida a una concentración de 200.000-300.000 células en 5 microlitros de PBS-SFB-10%-azida de sodio 0.01%. Esta suspensión celular fue incubada por 30 minutos a 4 C con 50 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-cd5 (Leu 1), anti-cd4 (Leu 3ab) o anti-cd8 (Leu 2a) (Beckton Dickinson Inc) a la dilución de trabajo, lavada 3 veces con PBS- SFB-10%-azida de sodio 0.01% e incubada por 30 minutos a 4 C con anticuerpo anti-ig murina conjugado con isotiocianato de fluoresceína (GAM-FITC Coulter Clone), lavada cuatro veces con PBS-SFB-10%-azida de sodio 0.01% y resuspendida en 2 microlitros de glicerina al 80%. El porcentaje de células reactivas con los anticuerpos monoclonales fue establecido por recuento de células fluorescentes y no fluorescentes con un microscopio de luz ultravioleta (leitz Dialux 20 EB). Fueron contadas 240 células en promedio en cada placa. Los resultados fueron analizados utilizando la prueba "t" de Student de significancia estadística para muestras apareadas (programa Statistical Package for Social Sciences). RESULTADOS En el grupo espondilitis anquilosante (Tablas 1 y 4) 73% (8/11) fue positivo para la prueba de tipificación de HLA-B27, 82% (9/11) fue positivo
Linfocitos T en espondilitis anquilosante 7 para la prueba de proteína C-reactiva (concentración promedio 31.8 mg/l) y el 100% de los pacientes presentó un aumento en la velocidad de sedimentación globular (>20 mm/h). Un paciente fue positivo para la prueba de factor reumatoideo (concentración 64 Ul/ml). En el grupo artritis reumatoidea (Tablas 2 y 4) 64% (7/11) fue positivo para la prueba de factor reumatoideo, 64% (7/11) fue positivo para la prueba de proteína C-reactiva (concentración promedio 53.66 mg/l) y 54% (6/11) presentó un aumento en la velocidad de sedimentación globular (>20 mm/h). Ningún paciente fue positivo para la prueba de tipificación de HLA-B27. En el grupo control (Tablas 3 y 4) 4.8% (1/21) fue positivo para la prueba de tipificación de HLA- B27; 4.8% (1/21) fue positivo para la prueba de proteína C-reactiva (concentración 15.90 mg/l) y ninguno de los pacientes fue positivo para la prueba de factor reumatoideo. La velocidad de sedimentación globular fue inferior a 20 mm/h en todos los individuos. Existe una diferencia estadísticamente significativa en el resultado de la prueba de tipificación del aloantígeno HLA-B27 (p < 0.001), prueba para proteína C-reactiva (p < 0.001) y velocidad de Acta Med Colomb Vol 14 N 1-1989
8 C.F. García y Cols. Tabla 4. Caracterización de pacientes y controles. sedimentación globular (p < 0.001) entre el grupo espondilitis anquilosante y el grupo control. Existe una diferencia estadísticamente significativa en el resultado de la prueba de factor reumatoideo (p < 0.001), prueba para proteína C-reactiva (p < 0.05) y velocidad de sedimentación globular (p < 0.05) entre el grupo artritis reumatoidea y el grupo control. En el grupo espondilitis anquilosante (Tabla 5) se encontró disminución en el porcentaje promedio de linfocitos (p < 0.05), aumento en el porcentaje promedio de polimorfonucleares neutrófilos (p<0.05), tendencia al aumento en el porcentaje promedio de células T CD8+ (p = 0.116) y a la disminución en la relación CD4/CD8 (p = 0.117) comparados con el grupo control (Tabla 6). No existe diferencia estadísticamente significativa en la cantidad absoluta promedio de linfocitos entre los grupos espondilitis anquilosante y control. Existe disminución en el porcentaje promedio de linfocitos, aumento en el porcentaje promedio de polimorfonucleares neutrófilos, y disminución en el porcentaje promedio de células linfoides T totales en el grupo artritis reumatoidea (Tabla 7) comparado con el grupo control (Tabla 6). Cuando el grupo espondilitis anquilosante se compara con el grupo artritis reumatoidea se observa que existe un aumento en el porcentaje relativo promedio de células linfoides T totales (p < 0.05) y de células T CD8 (P<0.05) y una tenden-
Linfocitos T en espondilitis anquilosante 9 cia a la disminución en la relación CD4/CD8 (p = 0.121) en el grupo espondilitis anquilosante. DISCUSION Las pruebas de tipificación de HLA-B27, factor reumatoideo, proteína C-reactiva y velocidad de sedimentación globular definen claramente los tres grupos estudiados. Se confirma la prevalencia en la expresión del aloantígeno HLA-B27, y la seronegatividad para el factor reumatoideo en la espondilitis anquilosante, así como la existencia de factor reumatoideo sérico en un alto porcentaje de los pacientes con artritis reumatoidea. Se establece también la existencia de un aumento en la velocidad de sedimentación globular en el estado de inflamación característico de la espondilitis anquilosante y de la artritis reumatoidea. En el grupo control un individuo (4.8%) fue positivo para la prueba de tipificación HLA-B27; este porcentaje es semejante a la prevalencia (7%) reportada para el aloantígeno de histocompatibilidad en la población normal (2). En el grupo espondilitis anquilosante un paciente fue positivo para la prueba cualitativa de factor reumatoideo presentando, sin embargo, una baja concentración (64 Ul/ml, correspondiente a una dilución 1/80). Estudios previos han establecido la existencia de alteraciones cuantitativas en la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anquilosante. Ha sido informada una disminución en el porcentaje de células linfoides (11), de linfocitos T (11), de linfocitos T CD4 (11-12) y CD8 (11) y en la relación CD4/CD8 (12). Nuestros resultados establecen la existencia de disminución en el porcentaje relativo promedio de linfocitos, con aumento en el porcentaje relativo promedio de polimorfonucleares neutrófilos en los pacientes con espondilitis anquilosante y artritis reumatoidea. Esta neutrofilia relativa, cuya causa posible es el estado de inflamación característico de estas entidades, da lugar a una linfopenia relativa. Encontramos una tendencia al aumento en el porcentaje promedio de células T CD8+ y a la disminución en la relación CD4/CD8. Esta tendencia podría hacerse estadísticamente significativa al estudiar una muestra más amplia, en la cual los pacientes sean clasificados de acuerdo con la fase de actividad de la enfermedad. Ya ha sido reportado un aumento en el porcentaje relativo de células linfoides T CD8+ durante la fase activa de la enfermedad en la espondilitis anquilosante (14); este hallazgo apoya nuestros resultados. Los resultados obtenidos sugieren que un aumento en la subpoblación citotóxica/supresora traduce el estado de activación de clonos con función citotóxica contra componentes del tejido conectivo periarticular. Esta activación podría ser consecuencia de una modificación antigénica de estos componentes estableciendo una alteración en el proceso de síntesis y renovación del colágeno. Esta posibilidad es apoyada por el hallazgo reciente de que linfocitos T citotóxicos específicos, inducidos por estimulación de células mononucleares de sangre periférica de individuos normales HLA-B27+ con células mononucleares de sangre periférica de pacientes con espondilitis anquilosante HLA-B27+, lisan células mononucleares de sangre periférica de pacientes con espondilitis anquilosante HLA-B27+, pero no células mononucleares de sangre periférica de individuos normales HLA-B27+ ó HLA-B27- o de Acta Med Colomb Vol 14 N 1-1989
10 C.F. García y Cols. pacientes con espondilitis anquilosante HLA-B27- (15). Se pueden producir linfocitos T citotóxicos con una especificidad similar, activando in vitro células de individuos normales HLA-B27+ con células autólogas modificadas por antígenos de reactividad cruzada derivados de cepas bacterianas (15). La modificación del antígeno HLA-B27 por interacción con estos antígenos podría dar lugar en individuos genéticamente susceptibles, a la activación de linfocitos T citotóxicos que podrían lisar células blanco que portan el antígeno HLA- B27. La destrucción de células del tejido conectivo por estos linfocitos T citotóxicos podría provocar una reacción inflamatoria de las articulaciones sacroilíacas y vertebrales. Cuando el grupo espondilitis anquilosante se compara con el grupo artritis reumatoidea se observa un aumento en el porcentaje relativo promedio de células T CD8, y una tendencia a la disminución en la relación CD4/CD8 en el grupo espondilitis anquilosante; este resultado permite concluir que no existe un mecanismo inmunopatogénico común para estas formas de artritis, puesto que las alteraciones por nosotros observadas comprometen variables diferentes en cada uno de los grupos. En resumen, los datos obtenidos a partir del análisis cuantitativo de la población linfoide T de sangre periférica en la espondilitis anquilosante indican la existencia de una tendencia al aumento en el porcentaje relativo promedio de células T CD8 (subpoblación citotóxica/supresora) en un grupo de 11 pacientes con espondilitis anquilosante comparado con un grupo de 21 individuos control y un grupo de 11 pacientes con artritis reumatoidea. Este resultado sugiere la posible participación de la citotoxicidad mediada por células T dirigida contra componentes celulares del tejido conectivo de las articulaciones sacroilíacas y vertebrales en la patogénesis de la espondilitis anquilosante. SUMMARY The purpose of this work was to quantify peripheral blood T lymphoid population in Ankylosing Spondylitis. Total T lymphocytes and subpopulations of helper/inducer and cytotoxic/suppressor T cells were quantified in a group of 11 patients with Ankylosing Spondylitis. The results were compared with that obtained in 21 normal controls and 11 patients with Rheumatoid Arthritis. The study groups were characterized through HLA typing and rheumatoid factor testing. A tendency towards an increase in the mean percentage of CD8+ T lymphocytes and towards a decrease in the CD4/CD8 ratio in the Ankylosing Spondylitis group compared with the control group was established. This increase could depend on the activation of clones with cytotoxic function directed against connective tissue components of the sacroiliac and vertebral joints. The results obtained suggest participation of cell mediated cytotoxicity in the pathogenesis of Ankylosing Spondylitis. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Dr. Edgar Rodríguez y al Sr. Rafael Morantes de la División de Salud Comunitaria de la Fundación Santa Fe de Bogotá, por su asesoría en el análisis estadístico de los resultados obtenidos. A la licenciada Leyla Mora, por su colaboración en la obtención de las muestras utilizadas. A la Licenciada Ana María Ordóñez, por su colaboración en la realización de la prueba cuantitativa de proteína C-reactiva. A la licenciada Gloria Pacheco por su colaboración en la realización de la prueba cuantitativa de factor reumatoideo. A los Laboratorios Roche por la donación de los reactivos para la realización de la prueba nefelométrica para proteína C-reactiva y a Hoechst de Colombia por la donación de los reactivos para la realización de las pruebas de proteína C-reactiva y factor reumatoideo. REFERENCIAS 1. Kidd B, Mulle M, Frank A, et al. Disease expression of ankylosing spondylitis in males and females. J Rheumatol 1988; 15: 1407-1409. 2. Sstrominger JL. Biology of the human histocompatibility leukocyte antigen (HLA) system and a hypothesis regarding the generation of autoimmune diseases. J. Clin. Invest 1986; 77:1411-1415. 3. Suárez-Almazor ME, Russel A, Lecler CQ. S. Ankylosing spondylitis in families with two distinct B27 haplotypes: a selective association. Arthritis rheum 1986; 29: 1510-1514. 4. Wagner P, Mau W, Zeidler H. et al. HLA-B27 and clinical aspects of ankylosing spondylitis: results of prospective studies. Immunol Rev 1985; 86: 93-100. 5. Breur-Vriesendorf P, Dekker-Saeys AJ, Ivenayi P. 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