REVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGÍA/115 Fusarium mexicanum Agente Causal de la Malfrmación del Mang en Jalisc, Méxic Fusarium mexicanum Causal Agent f Mang Malfrmatin in Jalisc, Mexic Isaí Betancurt Resendes, Labratri de Patlgía Vegetal (LabPV), Universidad Michacana de San Niclás de Hidalg (UMSNH), IIAF, km 9.5 Carr. Mrelia-Zinapécuar, Tarímbar, Michacán, CP 58880, Méxic; Jsé Jaquín Velázquez Mnreal, Camp Experimental Tecmán, Institut Nacinal de Investigacines Frestales, Agríclas y Pecuarias, Km. 35 Carr. Clima-Manzanill, Tecmán, Clima, CP 28100, Méxic; Juan Carls Mnter Castr, Facultad de Bilgía, UMSNH, Cd. Universitaria, Mrelia, Michacán, CP 58060, Méxic; Sylvia Patricia Fernández Pavía, LabPV, UMSNH; Héctr Lzya Saldaña, Departament de Fittecnia, Universidad Autónma Chaping, km. 38.5 Carr. Méxic-Texcc, Chaping, Ed. de Méxic, CP 56230, Méxic; Gerard Rdríguez Alvarad, LabPV, UMSNH. Crrespndencia: gra.labpv@gmail.cm (Recibid: Febrer 08, 2012 Aceptad: May 25, 2012) Betancurt Resendes, I., Velázquez Mnreal, J. J., Mnter Castr, J. C., Fernández Pavía, S. P., Lzya Saldaña, H. y Rdríguez Alvarad, G. 2012. Fusarium mexicanum Agente Causal de la Malfrmación del Mang en Jalisc, Méxic. Revista Mexicana de Fitpatlgía 30:115-127. Resumen. La malfrmación es una de las enfermedades más imprtantes del mang en el ámbit mundial. Varias especies de Fusarium han sid identificadas cm agentes causales de esta enfermedad. Recientemente, una nueva especie,, fue descrita causand malfrmación en huertas de mang de la región centr ccidente de Méxic; sin embarg, esta especie n ha sid detectada en áreas prductras del Glf de Méxic. Durante ls últims añs, se ha presentad un increment en las huertas de mang que presentan malfrmación en Jalisc, un estad lcalizad al nrte del área dnde ha sid detectad. El bjetiv de este trabaj fue identificar el patógen causante de la malfrmación flral y vegetativa en Jalisc. Análisis mrflógic y genétic de ls genes ß tubulina, EF-1á, e histna H3, mstró que tds ls aislads estudiads fuern. Se cnfirmó que este patógen es la especie principal causante de la malfrmación del mang en ls estads lcalizads en la región del Pacífic central. Análisis filgenétics mstrarn que pudiera estar presente cm pblacines clnales cuya dispersión pud haber currid pr medi de la cmercialización de plantas de viver cntaminadas. F. mangiferae, F. sterilihyphsum y tip F. subglutinans, especies causantes de la malfrmación en trs países, n fuern detectadas en este estudi. Palabras clave adicinales: cultivs trpicales, Abstract. Malfrmatin is ne f the mst imprtant diseases f mang wrldwide. Several Fusarium species have been identified as causal agents f this disease. Recently, a new species,, was described causing malfrmatin in mang rchards lcated in the central western regin f Mexic; hwever, it was nt detected in prducing areas alng the Gulf f Mexic. During the last years, there has been an increase in mang rchards presenting malfrmatin in Jalisc, a state lcated nrth f the area where has been detected. The bjective f this wrk was t identify the pathgen causing flral and vegetative malfrmatin in Jalisc. Mrphlgical and genetic analyses f the genes ß tubulin, EF-1á, and histne H3, indicated that all the islates studied were. This pathgen is cnfirmed as the main species causing mang malfrmatin in thse states lcated alng the central Pacific regin. Phylgenetic analysis shwed that may be present as clnal ppulatins whse dispersal culd have ccurred thrugh cmmercializatin f cntaminated plants frm nurseries. F. mangiferae, F. sterilihyphsum and F. subglutinans type, species causing malfrmatin in ther cuntries, were nt detected in this study. Additinal Keywrds: fruit crps, fungal diseases, Mang (Mangifera indica L.) is ne f the main fruit crps in Mexic. The prductin in 2011 was 1,536,654.28 t f fruit. In Mexic, Guerrer was the majr prducer in 2011, with 329,939 t. The states f Chiapas, Michacan, Nayarit, Oaxaca, Sinala and Veracruz, btain each mre than 100,000 t per year. The mang cultivated surface in Jalisc is 6,165 ha, which generated 56,552 t during 2011 (SIAP,
116/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 enfermedades fungsas,. El mang (Mangifera indica L.) es un de ls principales cultivs frutíclas en Méxic. La prducción en 2011 fue de 1,536,654.28 t de fruta. En Méxic, Guerrer fue el mayr prductr en el 2011, cn 329,939 t. Ls estads de Chiapas, Michacán, Nayarit, Oaxaca, Sinala y Veracruz, btienen cada un más de 100,000 t pr añ. La superficie cultivada de mang en Jalisc es de 6,165 ha, las cuales generarn 56,552 t durante el 2011 (SIAP, 2013). La enfermedad malfrmación curre en la mayría de las áreas prductras de mang y es cnsiderada cm la enfermedad más imprtante de este cultiv en el ámbit mundial (Kumar y Beniwal, 1992; Pletz, 2007). Ls síntmas característics de la enfermedad incluyen la malfrmación de tejid flral y vegetativ. Ls brtes malfrmads de las yemas apical y laterales presentan entrenuds acrtads, y hjas pequeñas, quebradizas y angstas. Las inflrescencias malfrmadas presentan ejes primaris y secundaris muy ramificads, acrtads y engrsads. El númer de flres se incrementa dramáticamente, y sn más grandes de l nrmal. La malfrmación flral incrementa el númer de flres masculinas, y las flres hermafrditas sn estériles, si sn fertilizadas, psterirmente sn abrtadas (Pletz, 2003). Investigadres en India llevarn a cab ls pstulads de Kch hace más de cuarenta añs, demstrand que un hng causaba la malfrmación del mang. El patógen causante de ambas frmas de malfrmación, flral y vegetativa, fue inicialmente identificad cm F. mnilifrme (Sin. F. verticilliides) Sheld. (Summanwar et al., 1966; Varma et al., 1974), psterirmente se le denminó F. mnilifrme Sheldn var. subglutinans Wllenweb. y Reinking; y finalmente F. subglutinans (Wllwnweb. y Reinking) Nelsn, Tussun and Marasas (Pletz y Freeman, 2009). Estudis en tras regines prductras de mang cnfirmarn a un tip de F. subglutinans cm el agente causal de la malfrmación en Egipt (Ibrahim et al., 1975), E.E.U.U. (Pletz y Gregry, 1993), Israel (Freeman et al., 1999) y África del Sur (Manicm, 1989). Britz et al. (2002) analizarn la mrflgía de cepas de Fusarium de árbles malfrmads en varias áreas prductras en el mund, y determinarn la existencia de tres grups diferentes. Infrmación adicinal de las secuencias de ls genes histna H3 y ß-tubulina para ds de ess grups, indicarn que eran filgenéticamente distints (Steenkamp et al., 2000). En base a ls dats de mrflgía y filgenia, Britz et al. (2002) estableciern ds especies nuevas para ls aislads de Fusarium asciads cn la malfrmación del mang. La especie de 29 cepas de Egipt, Flrida, Israel, Malasia y África del Sur crrespndía a F. mangiferae Britz, Wingfield y Marasas. Este grup de cepas es cnspecífic cn aislads que habían demstrad causar la malfrmación del mang (Steenkamp et al., 2000). La especie F. sterilihyphsum Britz, Marasas y Wingfield fue establecida inicialmente para ls aislads asciads cn la malfrmación del mang en África del Sur. Psterirmente, se demstró que F. sterilihyphsum estaba presente en Brasil 2013). The disease malfrmatin ccurs in mst mang prducing areas and it is cnsidered the mst imprtant disease f this crp wrldwide (Kumar and Beniwal, 1992; Pletz, 2007). Characteristic symptms f the disease include malfrmatin n vegetative and flral tissues. Malfrmed shts frm apical r lateral buds present shrtened interndes, brittle, dwarfed and narrw leaves. Malfrmed inflrescences present highly branched, shrtened and thickened primary and secndary axes. The number f flwers increases dramatically, and they are larger than nrmal. Flral malfrmatin increases the number f male flwers, and the hermaphrdite flwers are either sterile r, if fertilized, eventually abrted (Pletz, 2003). Researchers in India carried ut Kch's pstulates mre than frty years ag shwing that a fungus caused malfrmatin in mang. The pathgen causing bth frms f malfrmatin, flral and vegetative, was initially identified as F. mnilifrme (Syn. F. verticilliides) Sheld. (Summanwar et al., 1966; Varma et al., 1974), later as F. mnilifrme Sheldn var. subglutinans Wllenweb. and Reinking; and F. subglutinans (Wllwnweb. and Reinking) Nelsn, Tussun and Marasas (Pletz and Freeman, 2009). Studies in ther mang grwing regins cnfirmed F. subglutinans type as the causal agent f malfrmatin in Egypt (Ibrahim et al., 1975), USA (Pletz and Gregry, 1993), Israel (Freeman et al., 1999), and Suth Africa (Manicm, 1989). Britz et al. (2002) analyzed the mrphlgy f Fusarium strains frm malfrmed mang trees in several prducing areas in the wrld, and determined the existence f three different grups. Additinal infrmatin n the histne H3 and ß-tubulin gene sequences fr tw f thse grups indicated that they were phylgenetically distinct (Steenkamp et al., 2000). Based n mrphlgical and phylgenetic data, Britz et al. (2002) established tw new species fr Fusarium islates assciated with mang malfrmatin. The species F. mangiferae Britz, Wingfield and Marasas crrespnded t 29 strains frm Egypt, Flrida, Israel, Malaysia, and Suth Africa. This grup f strains is cnspecific with islates that had been prven t cause malfrmatin in mang (Steenkamp et al., 2000). The species F. sterilihyphsum Britz, Marasas and Wingfield was established initially fr islates assciated with mang malfrmatin in Suth Africa. Later, it was shwn that F. sterilihyphsum was present in (Zheng and Pletz, 2002). An additinal mrphlgically different grup was present in Malaysia; hwever, there is n phylgenetic and pathgenicity infrmatin fr this grup (Britz et al., 2002). In China, F. prliferatum has been detected causing mang malfrmatin (Zhan et al., 2010). Lately, F. mangiferae has als been reprted in China (Zhan et al., 2012) and Spain (Cresp et al., 2012). Additinally, a new linage f islates named F. tupiense has been reprted causing mang malfrmatin in and Senegal (Lima et al., 2009, 2012; Senghr et al., 2012). Genetic analysis using AFLPs and vegetative cmpatibility grups f islates btained in several mang grwing areas in, detected the
REVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGÍA/117 (Zheng y Pletz, 2002). Un grup adicinal mrflógicamente diferente estaba presente en Malasia; sin embarg, n hay infrmación filgenética ni de patgenicidad para este grup (Britz et al., 2002). En China, F. prliferatum ha sid detectad causand malfrmación del mang (Zhan et al., 2010). Últimamente, F. mangiferae también ha sid reprtad en China (Zhan et al., 2012) y España (Cresp et al., 2012). Adicinalmente, un linaje llamad F. tupiense ha sid reprtad causand malfrmación del mang en Brasil y Senegal (Lima et al., 2009, 2012; Senghr et al., 2012). Análisis genétic usand AFLPs y grups de cmpatibilidad vegetativa de ls aislads btenids en varias áreas prductras de mang en Brasil, detectarn la presencia de seis grups genétics, indicand una pblación diversa, genéticamente y gegráficamente, la cual pdría estarse reprduciend clnalmente (Lima et al., 2009). Aunque hay numerss estudis sbre esta enfermedad, aun se carece de infrmación sbre la mrflgía, cmpatibilidad sexual, patgenicidad y txigenicidad de las especies de Fusarium asciadas cn la malfrmación del mang (Marasas et al., 2006). La malfrmación del mang también es un prblema en huertas de mang en Méxic; sin embarg, en ls estads de Guerrer y Michacán causa ls dañs más severs (Nriega, 1996; Nriega-Cantú et al., 1999; Vega-Piña y Miranda-Salced, 1993; Mra-Aguilera et al., 2003). En Méxic, F. xysprum ha sid reprtad cm el agente causal de la malfrmación de mang en Michacán y Mrels, y F. subglutinans en Guerrer y Michacán (Díaz y Rmer-Cva, 1980; Vega-Piña y Miranda-Salced, 1993; Nriega, 1996; Nriega-Cantú et al., 1999). Recientemente, un taxón nuev de Fusarium causand malfrmación del mang fue detectad en Clima, Guerrer, Michacán y Mrels, Méxic (Rdríguez- Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010). Este taxón es similar mrflógicamente a F. sterilihyphsum; sin embarg, es filgenéticamente distint de cualquier tr taxón de Fusarium descrit previamente causand la malfrmación del mang. El nmbre de Aki, Freeman, Oter-Clina, Rdríguez-Alvarad, Fernández- Pavía, Pletz y O'Dnnell, sp. nv., ha sid asignad a este taxón nuev (Oter-Clina et al., 2010; Rdríguez- Alvarad et al., 2013). Aun cuand se han realizad estudis sbre manej integrad de esta enfermedad en Méxic (Vega-Piña et al., 2004), cntinúa causand pérdidas ecnómicas en las diferentes áreas prductivas del país. En añs recientes, ha habid un increment en el númer de árbles de mang afectads pr esta enfermedad en varias áreas prductras en Jalisc. Determinar si tiene una distribución más amplia en Méxic que l reprtad previamente (Oter-Clina et al., 2010), y si trs taxnes de Fusarium están invlucrads cn la malfrmación del mang en más áreas prductras, es imprtante para entender mejr a ests patógens y ls mecanisms pr ls cuales sn diseminads. Pr l tant, el bjetiv de esta investigación fue identificar las especies de Fusarium causand malfrmación del mang en huerts cmerciales en Jalisc, un estad ubicad en la región presence f six genetic grups, indicating a diverse ppulatin, genetically and gegraphically, which culd be reprducing clnally (Lima et al., 2009). Althugh, there have been numerus studies n this disease, there is still lack f infrmatin n mrphlgy, sexual cmpatibility, pathgenicity and txigenicity f the Fusarium species assciated with mang malfrmatin (Marasas et al., 2006). Mang malfrmatin is als a prblem in mang rchards thrughut Mexic; hwever, in the states f Guerrer and Michacan causes the mst severe damage (Nriega, 1996; Nriega-Cantú et al., 1999; Vega-Piña y Miranda-Salced, 1993; Mra-Aguilera et al., 2003). In Mexic, F. xysprum has been reprted as the causal agent f mang malfrmatin in Michacan and Mrels, and F. subglutinans in Guerrer and Michacan (Díaz and Rmer-Cva, 1980; Vega-Piña y Miranda-Salced, 1993; Nriega, 1996; Nriega-Cantú et al., 1999). Recently, a new taxn f Fusarium causing mang malfrmatin was detected in Clima, Guerrer, Michacan and Mrels, Mexic (Rdríguez-Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010). This taxn is mrphlgically similar t F. sterilihyphsum; hwever, it is phylgenetically distinct frm any ther Fusarium taxn described previusly causing mang malfrmatin. The name Aki, Freeman, Oter-Clina, Rdríguez-Alvarad, Fernández-Pavía, Pletz and O'Dnnell, sp. nv. has been assigned t this new taxn (Oter-Clina et al., 2010; Rdríguez-Alvarad et al., 2013). Althugh studies n integrated management have been carried ut n this disease in Mexic (Vega-Piña et al., 2004), it cntinues t cause ecnmic lsses in the several prductive regins f the cuntry. In recent years, there has been an increase in the number f mang trees affected by this disease in several prducing areas in Jalisc. Determining if has a wider distributin in Mexic than that previusly reprted (Oter-Clina et al., 2010), and if ther fusaria taxa are invlved with mang malfrmatin in mre prducing areas, is imprtant t understand better these pathgens and the manners in which they are disseminated. Therefre, the bjective f this research was t identify the species f Fusarium causing mang malfrmatin in cmmercial rchards in Jalisc, a state lcated in the central western mang prducing area in Mexic. MATERIALS AND METHODS Fusarium islates. Fifteen samples f flral and vegetative malfrmed tissue frm five mang cv. Tmmy Atkins trees, were cllected in an rchard lcated in La Huerta Cunty, Jalisc, during May f 2007 (19.485, - 104.643333 ). Three different malfrmed panicles were sampled per each tree. The disease incidence in the rchard was apprximately 10 %. The samples were placed in paper bags in a styrfam bx and were sent vernight t the Plant Pathlgy Labratry (UMSNH) in Mrelia, Michacan. In the labratry, plant samples were washed with detergent and rinsed with tap water t remve sil and insects. Small sectins f malfrmed tissue were cut, surface disinfected in 10 % sdium hypchlrite (Clrx U.S.A.) fr 5 min, rinsed three times with sterile distilled water. Excess water was
118/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 prductra de mang del centr ccidente en Méxic. MATERIALES Y METODOS Aislads de Fusarium. Quince muestras de tejid malfrmad flral y vegetativ de cinc árbles de mang del cultivar Tmmy Atkins, fuern clectads en una huerta lcalizada en el municipi de La Huerta, Jalisc, durante may del 2007 (19.485, -104.643333 ). Tres panículas malfrmadas fuern muestreadas pr cada árbl. La incidencia de la enfermedad en la huerta fue aprximadamente del 10 %. Las muestras fuern clcadas en blsas de papel en una hielera de unicel y fuern enviadas durante la nche al Labratri de Patlgía Vegetal (UMSNH) en Mrelia, Michacán. En el labratri, las muestras vegetales fuern lavadas cn detergente y enjuagadas cn agua de la llave para remver insects y suel. Seccines pequeñas de tejid malfrmad fuern crtadas, desinfectadas superficialemente cn hipclrit de sdi al 10 % (Clrx, E.E.U.U.) pr 5 min y enjuagadas tres veces cn agua destilada estéril. El exces de agua fue remvid cn tallas de papel estéril. Diez explants de tejid pr muestra fuern sembrads en cajas cn PDA fresc a la mitad de la cncentración (20 g agar, y 10 g dextrsa, disuelts en el líquid btenid de la ccción de 125 g de papas blancas, y afrad a un litr cn agua destilada) e incubads a 25 C. El medi PDA cntenía Ampicilina 0.27 g/l y Rifampicina 0.01 g/l. Puntas de hifas que emergiern de ls explants y creciern en el medi, fuern transferidas a cajas que cntenían medi Spezieller Nährstffarmer Agar (SNA) y ds pedazs de papel filtr 2 estéril, de 0.5 cm (Whatman, E.E.U.U.) para inducir la esprulación (Leslie y Summerell, 2006). Cultivs mnspórics y su preservación. Se btuviern cultivs mnspórics para tds ls aislads 2 que creciern en medi SNA. Ds discs de 0.5 mm de medi y miceli de cada un de ls aislads fuern clcads en tubs de vidri de 10 ml que cntenían 3 ml de agua destilada estéril. Ls tubs fuern agitads brevemente para separar ls cnidis del miceli, se tmarn 30 µl de una suspensión de cnidis y se dispersó en cajas que cntenían agar agua al 2 %. Las cajas fuern incubadas a 25 C en la scuridad pr 20 h. Ls cnidis germinads fuern bservads cn un micrscpi esterescópic, y se transfiriern individualmente a cajas cn SNA y papel estéril, e incubadas baj luz flurescente fría y blanca cn perids de 12 h luz y scuridad a 25 C. Una vez que ls cultivs cubriern la mayr parte del medi en la caja, se agregarn 3 ml de glicerl estéril al 25 % para remver ls cnidis del miceli. Un ml de la suspensión de cnidis se transfirió a cada un de tres tubs crigénics de 2 ml y se almacenarn a -70 C. Tds ls experiments se empezarn usand alícutas de las suspensines de cnidis almacenads en glicerl de cada aislad. Ls cultivs fuern depsitads en la Clección de Hngs del Labratri de Patlgía Vegetal, UMSNH. Caracterización cultural y mrflógica. Ls aislads fuern incubads en cajas cn PDA fresc (20 g agar y 20 g dextrsa, disuelts en el líquid btenid de la ccción de 125 g de papas blancas, afrad a un litr cn remved by bltting with sterile paper twels. Ten tissue explants per sample were then plated n fresh half strength PDA (20 g agar, 10 g dextrse and the brth frm 125 g white ptates made up t 1 L with distilled water) plates and incubated at 25 C vernight. PDA medium cntained als Ampicillin 0.27 g/l and Rifampicin 0.01 g/l. Tip hyphae emerging frm the explants and grwing n the medium were transferred t plates cntaining Spezieller 2 Nährstffarmer Agar (SNA) media and tw sterile, 0.5 cm pieces f filter paper (Whatman, USA) t prduce spres (Leslie and Summerell, 2006). Mnspric cultures and preservatin. Mnspric cultures were btained frm all f the islates 2 grwing n SNA. Tw 0.5 mm blcks f media and mycelium frm each islate were placed in 10 ml glass tubes cntaining 3 ml f sterile distilled water. Tubes were briefly shaken t disldge cnidia frm the mycelia, 30 µl f a suspensin f cnidia was taken and spread n plates cntaining 2 % water agar. Plates were incubated at 25 C in the dark fr 20 h. Germinated cnidia were bserved with a sterescpic micrscpe, transferred individually t plates with SNA plus sterile paper and incubated under flurescent cl-white and black lights with alternating 12 h perids f light and darkness at 25 C. Once the cultures cvered mst f the plate medium, 3 ml f 25 % sterile glycerl were added t the plate and used t wash ff cnidia frm the mycelia. One ml f cnidia suspensin was transferred t each f three crygenic 2 ml tubes and stred at -70 C. All experiments were started using aliquts f stred glycerl suspensins f cnidia frm each islate. Cultures were depsited at the Fungal Cllectin, Plant Pathlgy Labratry, UMSNH. Cultural and mrphlgical characterizatin. Islates were incubated n fresh PDA (20 g agar, 20 g dextrse and the brth frm 250 g white ptates made up t 1 L with distilled water) and CLA (carnatin leaf agar) (Leslie and Summerell, 2006) plates t stimulate culture and cnidial develpment. Cultures were incubated under light cnditins as mentined abve. After 10 t 14 d f incubatin the fllwing mrphlgical characters were analyzed: clr, type f mycelia and shape, size, and number f septa f macrcnidia and micrcnidia, presence f mn and/r plyphialides, presence f chlamydspres and sterile ciled hyphae. Twenty five measurements were made f macrcnidia and micrcnidia mrphlgical characters range and mean values were calculated (Leslie and Summerell, 2006). Pathgenicity test. Islates MXJAL-2, MXJAL-8 and MXJAL-11 were grwn n CLA plates under white and black light at 25 C fr 15 d. Cnidia were harvested with 7 sterile water and diluted t 2 x 10 cnidia per ml. The cnidial suspensin was used t inculate apical and lateral drmant buds f tw year grafted mang plants cv. Haden kept in pts f 50 cm f diameter, in a shade huse. Inculatins f cnidial suspensins were carried ut accrding t Freeman et al. (1999). DNA islatin. DNA was islated using a slvent free extractin methd develped by Mahuku (2004) with
REVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGÍA/119 agua destilada) y en medi CLA (hjas de clave en agar agua al 2 %) (Leslie and Summerell, 2006) para estimular el desarrll de ls cultivs y ls cnidis. Ls cultivs fuern incubads baj las cndicines de luz mencinadas anterirmente. Después de 10 a 14 d de incubación ls siguientes caracteres mrflógics fuern analizads: clr, tip de miceli, frma y tamañ, y númer de septs de ls macrcnidis y micrcnidis, presencia de mn y/ plifialides, presencia de clamidspras e hifas enrlladas estériles. Se tmarn medicines de ls caracteres mrflógics de 25 macrcnidis y 25 micrcnidis, calculand rangs y valres de medias (Leslie and Summerell, 2006). Pruebas de patgenicidad. Ls aislads MXJAL-2, MXJAL-8 y MXJAL-11 fuern crecids en cajas cn CLA baj luz blanca y negra a 25 C pr 15 d. Ls cnidis fuern 7 clectads cn agua estéril y diluids a 2 x 10 cnidis pr ml. La suspensión cnidial fue usada para incular yemas apicales y laterales en drmancia, de plantas de mang injertadas de ds añs de edad, cultivar Haden, mantenidas en macetas de 50 cm de diámetr, en una área smbreada. Las inculacines de las suspensines de cnidis se llevarn a cab de acuerd a Freeman et al. (1999). Obtención de ADN. ADN fue btenid usand un métd de extracción sin usar slventes desarrllad pr Mahuku (2004), cn mdificacines. Quince µl de una suspensión de cnidis en glicerl al 25 %, fuern inculads en un matraz de 250 ml que cntenía 100 ml de medi mínim (Leslie and Summerell, 2006). Ls cultivs fuern incubads a 25 C pr 10 d para btener miceli. Ls cultivs fuern filtrads a través de tela Miraclth (Calbichem, E.E.U.U.) estéril, el miceli se enjuagó cn 200 ml de agua destilada estéril, se drenó y dejó secar tda la nche a 4 C. El miceli sec se mlió en un mrter estéril cn nitrógen líquid y se transfirió a tubs de 1.7 ml, se almacenó a -20 C hasta que se prcesó. Quinients µl de buffer de extracción TES (Tris-HCl 0.2 M [ph 8], EDTA 10 mm [ph 8], NaCl 0.5 M, SDS 1 %) y 1.25 µl de Prteinasa K (200 mg/ml) (Sigma, E.E.U.U.) se agregarn a cada tub, se agitarn en un Vrtex pr 30 seg y se incubarn en un bañ de agua a 65 C pr 30 min. Para precipitar las prteínas se agregarn 250 µl de acetat de amni a cada tub, se incubarn en hiel pr 10 min, y se centrifugarn en una micrcentrífuga (Eppendrf, E.E.U.U.) a velcidad máxima, a 4 C pr 15 min. El sbrenadante fue transferid a un tub nuev, ls ácids nucleics fuern precipitads agregand un vlumen de isprpanl e incubads tda la nche a -20 C. Ls tubs fuern centrifugads cm se mencinó, las pastillas fuern lavadas cn 800 µl de etanl frí al 70 % y se secarn. Para remver ls plisacárids presentes en las muestras, el ADN fue eluid ds veces cn extraccines repetidas usand 250 µl de TE (Tris-HCl 10 mm [ph 8], EDTA1 mm), cada vez se centrifugó a la velcidad máxima pr 15 min para evitar ls plisacárids que estaban en el fnd del tub. La slución de ADN fue transferida a un tub nuev que se mantuv en hiel. Cinc µl de RNasa A (20 mg/ml) (Sigma, E.E.U.U.) se agregarn a la slución de ADN y se incubó a 37 C pr 60 min. El ADN se recuperó cm se describió usand acetat de amni e mdificatins. Fifteen µl f a cnidial suspensin in 25 % glycerl, was inculated int 250 ml flask cntaining 100 ml f minimal media (Leslie and Summerell, 2006). Cultures were incubated at 25 C fr 10 d t btain a mycelial mat. Cultures were filtered thrugh sterile Miraclth (USA), rinsed with 200 ml f sterile distilled water, drained and let dry vernight at 4 C. Dried mycelia was grund in a sterile mrtar with liquid nitrgen, transferred t 1.7 ml tubes, and stred at -20 C until prcessed. Five hundred µl f TES extractin buffer (0.2 M Tris-HCl [ph 8], 10 mm EDTA [ph 8], 0.5 M NaCl, 1 % SDS) and 1.25 µl f Prteinase K (200 mg/ml) (Sigma, USA) were added t each tube, Vrtex fr 30 sec, and incubated in a 65 C water bath fr 30 min. T precipitate prteins 250 µl f 7.5 M ammnium acetate were added t each tube incubated n ice fr 10 min, and spin in a micrcentrifuge (Eppendrf, USA) at maximum speed, 4 C fr 15 min. Supernatant was transferred t a new tube, and nucleic acids were precipitated by adding ne vlume f isprpanl and incubated vernight at -20 C. Tubes were centrifuged as befre, pellets were rinsed with 800 µl f 70 % cld ethanl and dried ut. In rder t remve plysaccharides present in the samples, DNA was eluted twice with repeated extractins using 250 µl f TE (10 mm Tris-HCl [ph 8], 1 mm EDTA), each time centrifuging at max speed fr 15 min t avid cllecting pelleted plysaccharides. DNA slutin was transferred t a new tube and kept n ice. Five µl f RNase A (20 mg/ml) (Sigma, USA) were added t the DNA slutin and incubated at 37 C fr 60 min. DNA was recvered as described abve using ammnium acetate and isprpanl. DNA pellets were suspended with 50 µl TE and kept at -20 C. PCR and DNA sequencing. Prtins f the nuclear genes translatin elngatin factr (EF-1á, 15 islates), ß- tubulin (6 islates), and histne H3 (5 islates) were PCRamplified and sequenced fr the Fusarium islates as described previusly (O'Dnnell et al., 1998). Sequence f primers fr the elngatin factr alpha 1 gene were EF-1 ( AT G G G TA A G G A R G A C A A G A C ) a n d E F - 2 (GGARGTACCAGTG/CATCATGTT) (O'Dnnell et al., 1 9 9 8 ) ; f r t h e ß - t u b u l i n w e r e T 1 ( A A C AT G C G T G A G AT T G TA A G T ) a n d T 2 2 (TCTGGATGTTGTTGGAATCC) (O'Dnnell et al., 2000a); and fr the histne H3 gene were H3-1a (ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG) and H3-1b (GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT) (Glass and Dnaldsn, 1995). The nucletide sequences determined in this wrk were depsited in GenBank under accessin numbers frm JN176078 t JN176092 fr the EF-1á gen, frm JN603664 t JN603669 fr the histne H3 gen, and frm JN650539 t JN650543, and KC517069 fr the ß- tubulin gen. Each PCR reactin cntained 12.5 µl f PCR Master Mix (Prmega, USA), 5 µm f each frward and reverse primers, 5 µl f template DNA (10 % dilutin) and deinized water t 25 µl f final vlume. PCR cnditins in the Thermcylcler (Eppendrf, Mastercycler Gradient, USA) were an initial denaturatin cycle at 95 C fr 4 min fllwed by 35 cycles f 95 C fr 1 min, 55 C fr 1 min and 72 C fr 2 min. A final elngatin step at 72 C fr 10 min
120/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 isprpanl. Las pastillas de ADN fuern resuspendidas cn 50 µl de TE y se almacenarn a -20 C. PCR y secuenciación del ADN. Prcines de ls genes nucleares factr de elngación de la traducción (EF- 1á, 15 aislads), ß-tubulina (6 aislads), e histna H3 (5 aislads), fuern amplificads pr PCR y secuenciads, para ls aislads de Fusarium cm se describió previamente (O'Dnnell et al., 1998). Las secuencias de ls lignucleótids del gen factr de elngación 1 alfa fuern EF-1 (ATGGGTAAGGARGACAAGAC) y EF-2 (GGARGTACCAGTG/CATCATGTT) (O'Dnnell et al., 1 9 9 8 ) ; p a r a ß - t u b u l i n a f u e r n T 1 ( A A C AT G C G T G A G AT T G TA A G T ) y T 2 2 (TCTGGATGTTGTTGGAATCC) (O'Dnnell et al., 2000a); y para el gen histna H3 fuern H3-1a ( A C TA A G C A G A C C G C C C G C A G G ) y H 3-1 b (GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT) (Glass and Dnaldsn, 1995). Las secuencias de nucleótids que se btuviern en este trabaj fuern depsitadas en GenBank cn ls númers de accesión de JN176078 a JN176092 para el gen EF-1á, de JN603664 a JN603669 para el gen histna H3, y de JN650539 a JN650543, y KC517069 para el gen ß- tubulina. Cada reacción de PCR cntenía 12.5 µl de PCR Master Mix (Prmega, E.E.U.U.), 5 µm de cada un de ls lignucleótids, 5 µl de ADN (dilución al 10 %) y agua desinizada a un vlumen final de 25 µl. Las cndicines de PCR en el termcicladr (Eppendrf, Mastercycler Gradient, E.E.U.U.) fuern un cicl inicial de desnaturalización a 95 C pr 4 min seguid pr 35 cicls de 95 C pr 1 min, 55 C pr 1 min y 72 C pr 2 min. Un pas final de elngación a 72 C pr 10 min finalizó las reaccines. El ADN amplificad en las reaccines de PCR fue purificad usand un kit cmercial (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Prmega, E.E.U.U.). Ls prducts de las amplificacines fuern analizads en geles de agarsa al 1.5 % a 50 Vlts pr 90 min, teñids cn brmur de etidi 0.5 µg/ml y ftgrafiads cn un sistema Kdak DAS 290 (Eastman Kdak, E.E.U.U.). Las secuencias del ADN amplificad fuern btenidas a través de una cmpañía cmercial (Macrgen, Seúl, Crea del Sur). Blast y análisis filgenétic. Las secuencias cnsens para tdas las regines amplificadas de cada aislad fuern btenidas usand Pregap y Gap (Staden Package, 2002). Las secuencias fuern editadas manualmente en Gap y alineadas cn tras secuencias de Fusarium usand el prgrama Mega 5.0 (Tamura et al., 2011), y psterirmente usadas en el prgrama BLASTN 2.2.25+ (Zhang et al., 2000) para determinar la identidad de ls taxnes en base a la similitud entre las secuencias, expresad cm prcentaje de identidad de las secuencias. Para cnfirmar ls resultads del análisis Blast, se llevó a cab un estudi filgenétic usand las secuencias de ls genes EF-1á y ß-tubulina. Slamente se utilizarn secuencias de ess genes para este estudi prque ls dats preliminares mstrarn una estructura filgenética adecuada para el bjetiv de esta investigación (Cuadr 1). Además, las pcas secuencias de histna btenidas mstrarn baj plimrfism l cual n habría prducid un cambi sustancial en ls resultads presentads en este ended the reactins. DNA amplified in PCR reactins was purified using a cmmercial kit (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Prmega, USA). DNA amplificatin prducts were analyzed in 1.5 % agarse gels at 50 Vlts fr 90 min, stained with 0.5 µg /ml ethidium brmide and dcumented with a Kdak DAS 290 (Eastman Kdak, USA) system. Sequences f the amplified DNA were btained thrugh a cmmercial cmpany (Macrgen, Seul, Krea). Blast and phylgenetic analysis. Cnsensus sequences fr all amplified regins frm each islate were btained using Pregap and Gap (Staden Package, 2002). Sequences were edited manually in Gap and align with ther Fusarium sequences using the Mega 5.0 prgram (Tamura et al., 2011), and then used in the BLASTN 2.2.25+ prgram (Zhang et al., 2000) t determine taxn identitiy based n similarity between sequences expressed as percent sequence identity. In rder t cnfirm the results f the Blast analysis, a phylgenetic study was carried ut using EF-1á and ß- tubulin gene sequences. Only sequences fr these genes were used fr this study because preliminary data shwed an adequate phylgenetic structure fr the bjective f this research (Table 1). Furthermre, the few btained histne sequences shwed lw plymrphism which wuld have had n substantial change in the results presented in this study. Sequences f ther fusaria used in several studies were included as utgrup (Table 1). Sequences alignments were btained with BIOEDIT (Hall, 2011). Regins were assembled int ne matrix and then analyzed with maximum parsimny, btstrap (PAUP versin 4.0b; Swffrd, 2002) and Bayesian phylgenetic analysis (MrBayes 3.2; Rnquist et al., 2012). Maximum parsimny analysis was carried ut with three thusand randm additin replicates. Clade stability was assessed by nnparametric btstrap, with 500 replicates using the heuristic. jmdeltest 2 (Darriba et al., 2012) was emplyed t select amng alternative mdels f evlutin. Bayesian phylgenetic analysis was perfrmed with seven millin generatins. The branch lengths were calculated as the average rates f change at each branch f the largest psterir prbability trees. RESULTS AND DISCUSSION Cultural and mrphlgical analysis. Three types f fungal clnies were bserved grwing frm the explants n the culture plates tw days after planting. One type presented clnies grwing n tp f the explants which typically crrespnded t cntaminant fungus such as Aspergillus and Penicillium. A secnd type crrespnded t a fast grwing fungus with white mycelium and absent reprductive structures. The third type f clnies presented lng hyphae with aerial cnidiphres r sprdchia. These hyphae prduced abundant macrcnidia and micrnidia n shrt phialides typical f the genus Fusarium. This is an imprtant characteristic t distinguish Fusarium strains assciated with mang malfrmatin during islatin prcedures (Rdriguez-Alvarad et al., 2008).
REVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGÍA/121 Cuadr 1. Secuencias adicinales btenidas del GenBank (NCBI) usadas para el análisis filgenétic. Table 1. Sequences btained frm GenBank (NCBI) used fr the phylgenetic analysis. Fusarium Hst Origin Strain Elngatin ß-Tubulin factr F. xysprum F. denticulatum F. magniferae F. sterilihyphsum F. sterilihyphsum F. sterilihyphsum Pseudtsuga menziesii Ipmea batatas Mangifera indica Ipmea batatas Ornamental grass Sequences fr these islates were nt btained. U.S.A. U.S.A. India Suth Africa Peru Suth Africa Michacan Michacan Michacan Michacan Michacan Michacan Michacan Michacan Guerrer Mrels Clima Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc Jalisc NRRL 22902 NRRL 25302 NRRL 25226 CML 283 NRRL 25623 MRC 2802 NRRL 53989 CML 280 CML 345 CML 389 NRRL 53986 NRRL 53995 CML 386 NRRL 53996 CML 262 NRRL 53990 CML 281 NRRL 53992 CML 350 NRRL 53993 CML 383 NRRL 25346 NRRL 26756 MRC 6747 NRRL 53147 NRRL 53143 NRRL 53140 NRRL 47473 NRRL 47478 NRRL 47485 NRRL 47493 NRRL 53580 NRRL 53571 NRRL 53575 NRRL 53150 MXJAL-1 MXJAL-2 MXJAL-3 MXJAL-4 MXJAL-5 MXJAL-6 MXJAL-7 MXJAL-8 MXJAL-10 MXJAL-11 MXJAL-13 MXJAL-14 MXJAL-17 MXJAL-18 MXJAL-19 AF160312 AF160269 AF160281 DQ452858 AF160300 GU737267 DQ452861 DQ452860 GU737410 GU737411 GU737412 DQ452859 GU737402 GU737403 GU737408 AF160296 AF160307 Gu737282 GU737278 GU737275 GU737416 GU737417 GU737418 GU737419 GU737421 GU737420 GU737286 GU737284 JN176078 JN176079 JN176080 JN176081 JN176082 JN176083 JN176084 JN176085 JN176086 JN176087 JN176088 JN176089 JN176090 JN176091 JN176092 U34424 U61550 U61561 DQ445780 AF160316 AF160344 GU737479 DQ445783 DQ445782 GU737302 GU737303 GU737304 DQ445781 GU737294 GU737295 GU737300 U61564 AF160322 GU737494 GU737490 GU737487 GU737308 GU737309 GU737310 Gu737311 GU737313 GU737312 GU737498 GU737536 Jn650539 JN859935 JN650540 JN650541 JN650542 JN650543
122/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 estudi. Cm grups externs se incluyern secuencias de Fusarium de trs estudis (Cuadr 1). El alineamient de secuencias se realizó cn BIOEDIT (Hall, 2011). Las secuencias de diferentes regines fuern fusinadas en una única matriz y de esa frma evaluada cn análisis filgenétics de parsimnia, btstrap (PAUP versión 4.0b; Swffrd, 2002) y bayesians (MrBayes 3.2; Rnquist et al., 2012). El análisis de parsimnia máxima se realizó cn 3,000 repeticines de adición al azar. El análisis btstrap para estimar la estabilidad de ls clads fue del tip n paramétric, usand una búsqueda heurística de 500 réplicas. Para seleccinar el mdel de evlución mlecular se empleó jmdeltest 2 (Darriba et al., 2012). El análisis bayesian se realizó cn 7,000,000 generacines. El larg de las ramas se calculó cm el prmedi de las tasas de cambi de cada braz de ls árbles cn mayres prbabilidades psterires. RESULTADOS Y DISCUSION Análisis cultural y mrflógic. Tres tips de clnias de hngs fuern bservadas creciend de ls explants en las cajas de cultiv ds días después de sembrarlas. Un tip presentaba clnias creciend sbre ls explants el cual crrespndía típicamente a hngs cntaminantes tales cm Aspergillus y Penicillium. Un segund tip crrespndía a un hng de crecimient rápid cn miceli blanc y ausencia de estructuras reprductivas. El tercer tip de clnias presentaba hifas largas cn esprdquis cnidiófrs aéres. Esas hifas prducían abundantes macrcnidis y micrnidis en fiálides crtas típicas del géner Fusarium. Esta es una característica imprtante para distinguir cepas de Fusarium asciadas cn la malfrmación del mang durante ls prcedimients de aislamient (Rdríguez-Alvarad et al., 2008). Aprximadamente el 90 % de las clnias btenidas de ls diez explants de cada muestra fuern del tercer tip. Un aislad de cada muestra fue seleccinad para su psterir caracterización. Cultivs mnspórics de ess aislads prdujern miceli aére densamente flcs, blanc, rsad blanc a vileta blanc en PDA. Las clnias prdujern pigmentación en el medi parcialmente scura a vileta scur. Las clamidspras n fuern bservadas en ls medis utilizads. En CLA ls macrcnidis presentarn de tres a cinc células, eran fusifrmes, rects a ligeramente curvs y mstrarn una lngitud prmedi de 46.0 µm y un rang de 35.4-57.8 µm. Ls micrcnidis estaban en falsas cabezas en mn y plifialides, la mayría sin septs y clavads a elipsidales, mstrarn una lngitud prmedi de 10.5 µm y un rang de f 7.9-14 µm. Las características culturales y mrflógicas cncuerdan cn las bservadas para, un nuev taxón descrit causand malfrmación del mang en Michacán (Rdríguez-Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010). La variación detectada en cn respect al tamañ del macrcnidi (21.5-62 x 1.5-5 µm) dependía si el cnidi era frmad en cnidiófrs aéres en esprdquis (Oter-Clina et al., 2010). F. xysprum tips de F. subglutinans n fuern detectads entre ls Apprximately 90 % f the clnies btained frm the ten explants frm each sample were f the third type. One islate frm each sample was then selected fr further characterizatin. Mnspric cultures frm these islates prduced aerial mycelia densely flccse, white, pinkish white t vilet white n PDA. Clnies prduced partly dark t dark vilet pigmentatin in the reverse. Chlamydspres were absent in all tested media. On CLA macrcnidia were three t five celled, fusifrm, straight r curved and shwed an average length f 46.0 µm and a range f 35.4-57.8 µm. Micrcnidia were n false-heads n mn and plyphialides, mstly withut septa and clavate t ellipsidal, shwed an average length f 10.5 µm and a range f 7.9-14 µm. The cultural and mrphlgical characteristics were accrding t thse bserved fr F. mexicanum, a new taxn described causing mang malfrmatin in Michacan (Rdríguez-Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010). The variatin detected in F. mexicanum regarding the size f macrcnidia (21.5-62 x 1.5-5 µm) depended if the cnidia were frmed n aerial cnidiphres r in sprdchia (Oter-Clina et al., 2010). F. xysprum r F. subglutinans type were nt detected amng the islates btained. Cils f sterile hyphae are prduced by sme f the Fusarium species causing mang malfrmatin, including F. sterilihyphsum (Britz et al., 2002), frm Michacan (Rdríguez-Alvarad et al., 2008) and frm (Lima et al., 2009). Hwever, cils f sterile hyphae were nt detected in sme f the islates f analyzed previusly (Oter-Clina et al., 2010). The frmatin f this mrphlgical characteristic is als shwn by F. circinatum Nirenberg and O'Dnnell emend. Britz, Cutinh, Wingfield and Marasas and F. pseudcircinatum O'Dnnell and Nirenberg (Leslie and Summerell, 2006). The fifteen islates analyzed in this study did nt shw the presence f ciled hyphae n CLA. The pssibility that ciled hyphae culd be prduced by these islates in anther media exists. Culture cnditins such as light and temperature can influence the frmatin and variatin in shape and size f mrphlgical structures (Leslie and Summerell, 2006). Pathgenicity tests. Flral mang malfrmatin symptms were prduced after five weeks n mang plants inculated separately with three islates f, MXJAL-2, MXJAL-8 and MXJAL-11 (Figure 1). Plants inculated with MXJAL-8 shwed vegetative malfrmatin eight weeks after inculatins (Figure 1). Inculated strains were re-islated frm malfrmed flral and vegetative tissues. Water-inculated cntrl plants did nt shw malfrmatin symptms and Fusarium was nt islated frm thse panicles (Figure 1). DNA analysis - Blast. The fifteen Jalisc islates were divided int tw grups based mainly n the sequences btained fr the EF-1á gen, presenting different bases in three psitins. The sequence frm each grup shwed 100 % similarities t sequences frm diverse islates btained in the states f Michacan and Mrels, Mexic (Oter-Clina et al., 2010). Gd quality sequences fr the â-tubulin presented 100 % similarity with sequences
REVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGÍA/123 Figura 1. Síntmas inducids en plantas de mang pr aislads de Fusarium btenids de árbles de mang malfrmads en Jalisc. A, B. Malfrmación flral, MXJAL-2; C. Malfrmación vegetativa; D. Malfrmación flral, MXJA-8; E. Malfrmación flral, MXJAL-11; F. Planta cntrl. Figure. 1. Symptms induced n mang plants by Fusarium islates btained frm malfrmed mang trees in Jalisc. A, B. Flral malfrmatin, MXJAL-2; C. Vegetative malfrmatin, MXJAL-8; D. Flral malfrmatin, MXJAL- 8; E. Flral malfrmatin, MXJAL-11; F. Cntrl plant. aislads btenids. Las hifas enrlladas estériles sn prducidas pr algunas de las especies de Fusarium que causan la malfrmación del mang, incluyend a F. sterilihyphsum (Britz et al., 2002), de Michacán (Rdríguez-Alvarad et al., 2008) y de Brasil (Lima et al., 2009). Sin embarg, las hifas enrlladas estériles n fuern detectadas en alguns de ls aislads de analizads previamente (Oter-Clina et al., 2010). La frmación de esta característica mrflógica también es presentada pr F. circinatum Nirenberg and O'Dnnell emend. Britz, Cutinh, Wingfield and Marasas y F. pseudcircinatum O'Dnnell and Nirenberg (Leslie and Summerell, 2006). Ls quince aislads analizads en este estudi n mstrarn la presencia de hifas enrlladas en CLA. Existe la psibilidad de que las hifas enrlladas pudieran ser prducidas pr ests aislads en tr medi. Las cndicines culturales tales cm luz y temperatura pueden influir en la frmación y variación en frma y tamañ de las estructuras mrflógicas (Leslie and Summerell, 2006). Pruebas de patgenicidad. Síntmas de malfrmación flral fuern prducids cinc semanas después de incular plantas de mang separadamente cn tres aislads de, MXJAL-2, MXJAL-8 and MXJAL-11 (Figura 1). Las plantas inculadas cn MXJAL- 8 mstrarn malfrmación vegetativa ch semanas después de las inculacines (Figura 1). Las cepas inculadas fuern re-aisladas de ls tejids malfrmads, flral y vegetativ. Las plantas cntrl inculadas cn agua f several islates btained in the states f Clima, Guerrer and Michacan (Oter-Clina et al., 2010). The sequences fr the histne H3 regin f the islates varied in ne psitin. Similarly t the results btained fr the elngatin factr gen, all the islates shwed 100 % similarities t sequences frm islates btained in the state f Michacan, Mexic (Oter- Clina et al., 2010). Phylgenetic analysis. The EF-1á alignment was 646 bp length with six infrmative gaps and ß-tubulin alignment was 513 psitins length with ne gap. The bestfit mdels f nucletide substitutin were GTR (Rdriguez et al., 1990) fr EF-1á and HKY (Hasegawa et al., 1985) fr ß -tubulin. The parsimny analysis f the cmbined data set prduced 46 mst-parsimnius trees, with cnsistency index f 90 and retentin index f 91. The parsimny strict cnsensus reslved 12 ndes, while the Bayesian analysis reslved tw additinal clades. Only thse clades reslved by bth tests are presented in Figure 2. All samples f fusaria islates frm Jalisc and were reslved as a mnphyletic grup (96 % btstrap, 100 % psterir prbability), shwing an additinal structure with tw clusters. Clsely related t Mexican clade is NRRL 25346 frm Peru and NRRL 26756 frm Suth Africa. Anther separate mnphyletic grup is cmprised f all frm and F. sterilihyphsum (100 % btstrap, 100 % psterir prbability), gruped each in their respective lineages. The grups described are united in a large clade (100 % btstrap, 100 % psterir prbability) that excludes F. mangiferae and ther utgrups (Figure 2). The cmbinatin f these sequences gives an acceptable reslutin f relatinships, as expected based n the results f ther studies (O'Dnnell et al., 2000b; Lima et al., 2009). The clse relatinship f fusaria islates frm Jalisc and that has been demnstrated in cultural and mrphlgical analysis in this study is cnfirmed btaining the clade that unites them with the high values f statistical supprt, prviding a slid evidence f their mnphyly. The additinal structure present in this clade des nt prduce exclusively clusters f fusaria islates frm Jalisc r, s n ne culd argue that they are tw separate species. This in turn, culd indicate that recent changes are ccurring in their genetic material and which eventually are spreading clnally. This study cnfirmed the prevalence f F. mexicanum in mang prducing states in central western Méxic. It had been previusly detected in Clima, Guerrer and Michacán (Rdriguez-Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010), states alng the Pacific castline, being Jalisc the next state up nrth. These findings suggest that is well established in this regin and it has prbably being disseminated thrugh cntaminated plant material frm nurseries in thse states, since this species has been fund n seedlings (data nt shwn). Mang malfrmatin is als cmmn in the Gulf f Mexic prducing areas; hwever, this species has nt been detected in mang rchards in that regin (Oter-Clina et al., 2010). As suggested abve, the gegraphic rigin f
124/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 n mstrarn síntmas de malfrmación y Fusarium n fueaislad de esas panículas (Figura 1). Análisis del ADN - Blast. Ls quince aislads de Jalisc fuern dividids en ds grups en base principalmente en las secuencias btenidas del gen EF-1á, al presentar bases diferentes en tres psicines. Las secuencias de cada grup mstró 100 % de similitud cn secuencias de diverss aislads de btenids en ls estads de Michacán y Mrels, Méxic (Oter-Clina et al., 2010). Las secuencias de buena calidad para el gen de â- tubulina presentarn 100 % de similitud cn secuencias de varis aislads de btenids en ls estads de Clima, Guerrer y Michacán (Oter-Clina et al., 2010). Las secuencias para la región de histna H3 de ls aislads varió en una psición. Similarmente a ls resultads btenids para el gen factr de elngación, tds ls aislads mstrarn 100 % de similitud cn secuencias de aislads de btenids en el estad de Michacán, Méxic (Oter-Clina et al., 2010). Análisis filgenétic. El alineamient de EF-1á fue de 646 psicines cn 6 gaps infrmativs, mientras que el de ß-tubulina fue de 513 psicines cn un gap. El mdel de sustitución nucletídica que mejr ajustó a EF-1á fue el GTR (Rdriguez et al., 1990), en cambi para la ß-tubulina ajustó mejr el HKY (Hasegawa et al., 1985). El análisis de parsimnia de ls dats cmbinads prduj 46 árbles de máxima parsimnia, cn índice de cnsistencia de 90 y de retención de 91. El cnsens estrict de ests árbles retiene 12 clads, en cambi el análisis bayesian cnserva 14 agrupamients. En la Figura 2 se presentan las agrupacines resueltas pr ambs análisis. Tdas las muestras de aislads de Jalisc y ls Fusarium mexicanum se encntrarn cm un grup mnfilétic (96 % btstrap, 100 % prbabilidad psterir), mstrand ds agrupamients interns adicinales. Cercanamente relacinads al clad Mexican están ls aislads de NRRL 25346 del Perú y el NRRL 26756 de África del Sur. Otr grup mnfilétic incluye a tds ls de Brasil y ls F. sterilihyphsum (100 % btstrap, 100 % prbabilidad psterir), a su vez agrupads en sus respectivs linajes. Ls grups antes mencinads cnfrman un gran clad que excluye a F. magiferae y demás grups externs (Figura 2). La cmbinación de las secuencias brinda una reslución aceptable de las relacines, cm se esperaba cn base en ls resultads de trs estudis (O'Dnnell et al., 2000b; Lima et al., 2009). Las relacines cercanas de ls aislads de Fusarium de Jalisc y de que ha sid demstrada en el análisis cultural y mrflógic en este estudi, es cnfirmada cn la btención del clad que ls unen cn alts valres de apy estadístic, prveyend evidencia sólida de su mnfilia. La estructura adicinal encntrada en esta agrupación n prduce agrupamients exclusivs de ls aislamients de Jalisc de, pr l que n se puede argumentar que sn especies diferentes. En cambi, est pdría indicar que están curriend cambis recientes en el material genétic, ls cuales se están expandiend de frma clnal. Este estudi cnfirmó la prevalencia de F. mexicanum en ls estads prductres de mang en la culd be lcated in the central western regin f Mexic. Other Fusarium species reprted as causal agents f mang malfrmatin in ther cuntries, F. mangiferae (Steenkamp et al., 2000) and F. sterilihyphsum (Zheng and Pletz, 2002; Lima et al., 2009) have nt been detected in Méxic. F. subglutinans (Vega-Piña and Miranda-Salced, 1993, Nriega-Cantú et al., 1999) has been reprted in the past in Mexic; hwever, it was nt detected in this wrk r in previus studies (Rdríguez-Alvarad et al., 2008, Oter- Clina et al., 2010). A mre thrugh implementatin f phytsanitary measures are needed t prevent farther disseminatin f this pathgen int mre mang grwing areas in Mexic. Due t the restrictive sampling these results may require additinal future studies that include ther regins, cultivars and phenlgic perids. CONCLUSIONS was identified as the causal agent f mang malfrmatin in Jalisc. Phylgenetic analysis shwed that may be present as clnal ppulatins in mang grwing areas in Mexic. Acknwledgment. We are thankful t Dr. Raúl Rdríguez Guerra (INIFAP, Celaya, Guanajuat) fr prviding sterile carnatin leaves fr CLA medium. This wrk was supprted by a Grant fr Basic Science Research frm CONACYT, Mexic thrugh Prject N. 84578 t G. Rdríguez-Alvarad. LITERATURE CITED Britz H, Steenkamp ET, Cutinh TA, Wingfield BD, Marasas WFO and Wingfield MJ. 2002. Tw new species f Fusarium sectin Lisela assciated with mang malfrmatin. Myclgia 94:722-730. Cresp M, Cazrla FM, Herms JM, Guirad E, Maymn M, Trés JA, Freeman S., and de Vicente A. 2012. First reprt f mang malfrmatin disease caused by Fusarium mangiferae in Spain. Plant Disease 96: 286-286. 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126/VOLUMEN 30, NÚMERO 2, 2012 región centr ccidente de Méxic. Previamente, había sid detectad en Clima, Guerrer y Michacán (Rdríguez- Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010), estads situads en la csta del Pacífic, siend Jalisc el siguiente estad hacia el nrte. Ests resultads sugieren que F. mexicanum está bien establecid en esta región y ha sid prbablemente diseminad a través de material vegetal cntaminad de vivers en ess estads, ya que esta especie ha sid detectada en plántulas (dats n mstrads). La malfrmación del mang es también cmún en las áreas prductras del Glf de Méxic; sin embarg, esta especie n ha sid detectada en huertas de mang en esa región (Oter-Clina et al., 2010). Cm se sugirió, el rigen gegráfic de pdría estar lcalizad en la región centr ccidente de Méxic. Otras especies de Fusarium reprtadas cm agentes causales de la malfrmación del mang en trs países, F. mangiferae (Steenkamp et al., 2000) y F. sterilihyphsum (Zheng and Pletz, 2002; Lima et al., 2009) n han sid detectads en Méxic. F. subglutinans (Vega-Piña y Miranda-Salced, 1993; Nriega-Cantú et al., 1999) ha sid reprtad en Méxic en el pasad; sin embarg, n fue detectad en este trabaj en estudis previs (Rdríguez-Alvarad et al., 2008; Oter-Clina et al., 2010). Una implementación más estricta de medidas fitsanitarias es necesaria para prevenir una mayr diseminación de este patógen en más áreas prductras de mang en Méxic. Debid a l restrictiv del muestre ests resultads pueden requerir estudis futurs que incluyan tras regines, variedades y etapas fenlógicas. CONCLUSIONES fue identificad cm el agente causal de la malfrmación del mang en Jalisc. El análisis filgenétic mstró que pudiera estar presente cm pblacines clnales en áreas prductras de mang en Méxic. Agradecimients. Agradecems al Dr. Raúl Rdríguez Guerra (INIFAP, Celaya, Guanajuat) el prveer hjas estériles de clavel para el medi CLA. Este trabaj fue financiad cn un apy para Investigación en Ciencia Básica de CONACYT, Méxic pr medi del Pryect N. 84578 a G. Rdríguez-Alvarad. 22:160-74. Ibrahim AN, Satur MM, El-Tbshy ZM and Abdel Sattar MA. 1975. Pathlgical and histlgical nte n mang malfrmatin in Egypt. Current Science 44:443-444. Kumar J and Beniwal SPS. 1992. Mang malfrmatin. Pp: 357-393. In: Kumar J, Chaube HS, Singh US and Mukhpadhyay AN (eds.). Plant Diseases f Internatinal Imprtance. Prentice Hall. New Yrk, USA. 544p. Leslie JF and Summerell BA. 2006. The Fusarium Labratry Manual. Blackwell Publishing. Ames, Iwa, USA. 388p. Lima CS, Pfenning LH, Csta SS, Camps MA and Leslie JF. 2009. A new Fusarium lineage within the Gibberella fujikuri species cmplex is the main causal agent f mang malfrmatin disease in. Plant Pathlgy 58:33-42. Lima, CS., Pfenning LH, Csta SS, Abreu LM, and Leslie JF. 2012. 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