MELANOMA, FACTORES DE RIESGO HISTOLÓGICOS DE IMPORTANCIA PRONÓSTICA

MELANOMA, FACTORES DE RIESGO HISTOLÓGICOS DE IMPORTANCIA PRONÓSTICA García Zanoguera, Carlos Tutor: Alegre de Miquel, Víctor TRABAJO DE FÍN DE GRADO FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA UNIVERSIDAD DE VALENCIA VALENCIA 26 de enero de 2018

0. ÍNDICE 1. RESUMEN / PALABRAS CLAVE... 4 2. ABSTRACT / KEY WORDS... 5 3. CASO CLÍNICO... 6 4. DISCUSIÓN... 11 4.1 ANÁLISIS CRÍTICO... 11 4.2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA... 14 5. BIBLIOGRAFÍA... 36 3

1. RESUMEN / PALABRAS CLAVE Resumen: El melanoma es una enfermedad que, aunque generalmente se desarrolla en la piel, puede aparecer en cualquier parte del organismo (1). Su incidencia ha aumentado de forma constante en las últimas décadas y es la primera causa de muerte por lesiones cutáneas malignas (2). Se han descrito un conjunto de factores de riesgo pronósticos que ayudan a predecir el comportamiento del melanoma y estimar la supervivencia del paciente a partir del estadiaje tumoral. Este trabajo se ha dividido en dos partes: en primer lugar, se describe un caso clínico característico de melanoma donde se identifican los factores pronósticos más importantes; a continuación, se realiza una revisión bibliográfica que pone en conjunto los factores pronósticos existentes hasta la fecha y cita los avances más representativos que podrían modificar en el futuro la manera de pronosticar el melanoma. A pesar de los numerosos factores pronósticos identificados, todavía no hay un sistema que permita ponerlos en común para predecir el comportamiento del melanoma. El actual sistema de estadiaje de melanoma de la American Joint Committee on Cancer (AJCC) presenta una serie de limitaciones que interfieren en la precisión del pronóstico. Los nuevos avances en el estudio del melanoma sugieren focalizar la atención en nuevos factores de riesgo clinicopatológicos y biomarcadores de origen genético y de biología molecular. La integración de todos estos factores en el sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC podría aumentar la precisión en el pronóstico, mejorar la estimación de la supervivencia, así como facilitar la toma de decisiones para obtener una respuesta óptima al tratamiento. Palabras clave: melanoma, factor pronóstico, supervivencia, estadiaje 4

2. ABSTRACT / KEY WORDS Abstract: Although melanoma is generally developed in the skin, it can grow up anywhere in the body (1). Its incidence has increased steadily during the last decade and it is still the leading cause of death due to malignant skin lesions (2). A set of prognostic risk factors have been described which help predict the behaviour of melanoma and estimate patient survival from tumour staging. This work has been divided into two parts: first, a melanoma clinical case is described where the most important prognostic factors are identified; then, a bibliographic review is made that puts together the prognostic factors existing to date and cited the most representative advances that could modify in the future how to predict melanoma. Despite the substantial independent prognostic factors identified, there is still no system that allows the physician to pool all of them to predict the behaviour of melanoma. The current melanoma staging system of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) has a series of limitations that make the prognosis inaccurate. New advances in melanoma suggest focusing attention on new clinicopathological risk factors and genetic and molecular biology biomarkers. The integration of all these factors in the melanoma staging system of the AJCC could increase the accuracy in the prognosis, improve the survival estimation, as well as facilitate the decision making to obtain an optimal response to the treatment. Key words: melanoma, prognostic factor, survival, staging 5

3. CASO CLÍNICO DESCRIPCIÓN DEL CASO Mujer de 57 años que acude a la consulta de Dermatología remitida por su médico de atención primaria por presentar una lesión sospechosa de malignidad de un mes de evolución en la axila derecha. ANAMNESIS Motivo de consulta: Mujer de 57 años que refiere una lesión nodular de coloración oscura de nueva aparición y de un mes de evolución en la axila derecha. Antecedentes personales: No alergias medicamentosas conocidas. No hábitos tóxicos. No toma ningún medicamento. Trabaja como secretaria en una clínica dental. IABVD. Buen apoyo social. Antecedentes familiares: No hay casos de melanoma ni lesiones precursoras en la familia. Antecedentes patológicos: No DM, DLP ni HTA. Refiere haberse quemado la piel varias veces tomando el sol durante la infancia-adolescencia (no recuerda cuántas). 6

EXPLORACIÓN CLÍNICA Estado general: Buen estado general, normocoloreada y normohidratada. Constantes vitales: FC 62lpm, TA 100/67mmHg, Tª 36,3ºC, SpO2 98%, FR 16rpm. Exploración neurológica: Consciente y orientada en las tres esferas. Conversación coherente y fluida. No alteración de los pares craneales. No pérdida de fuerza ni alteración de la sensibilidad en extremidades. Auscultación cardiopulmonar: Murmullo vesicular conservado sin ruidos sobreañadidos. Tonos cardiacos rítmicos sin soplos. Exploración abdominal: Abdomen blando y depresible, ruidos peristálticos presentes, quejas de dolor a la palpación de hipocondrio derecho, no se palpan masas ni megalias. Exploración de piel y faneras: Lesión nodular, asimétrica, bordes bien definidos, no irregulares, coloración uniforme azul oscura, no ulcerada, 2cm de diámetro, localizada en área axilar derecha (Figura 1). 7

DIAGNÓSTICO Biopsia excisional: La lesión cutánea hallada en esta paciente sugiere la presencia de un melanoma de tipo nodular. Para confirmarlo se realiza la excisión completa de la lesión y se estudia histológicamente (2). El estudio anatomopatológico informa además de una serie de parámetros con importancia pronóstica (1,2). Subtipo histológico Melanoma nodular Fase de crecimiento Aparecen células atípicas epiteloides con escaso crecimiento radial, pero con invasión vertical de la dermis. Nivel de Clark El componente invasor del melanoma rellena y expande la dermis papilar. Espesor de Breslow 2mm. Medido desde la base de la úlcera hasta el componente tumoral más profundo. Mitosis 1/mm 2 Ulceración Sí (Figura 2) Regresión Invasión linfovascular Invasión perineural Satelitosis microscópica Lesión melanocítica asociada Citología predominante Mágenes No Peritumoral e intraturmoral discontinuo y denso No No No Epitelioide Libres Biopsia selectiva del ganglio centinela (BSGC): El hallazgo de un espesor de Breslow > 0,8mm o un estadio ³ pt1b aumenta la probabilidad de que el melanoma haya metastatizado a la cadena ganglionar linfática donde drena (2). Por ello, se estudia histológicamente el primer ganglio que recibe el drenaje desde el tumor primario. El resultado permite decidir si se realiza una linfadenectomía (BSGC+) o se preserva la cadena ganglionar (BSGC-). Esta técnica se recomienda realizarla en el momento de la ampliación de los márgenes del tumor primario. La paciente presenta un melanoma con un espesor de Breslow de 2mm y por tanto se procede a realizar la BSGC. Resultado: No se observan células tumorales. 8

Estudio de extensión: A todos los sujetos diagnosticados de melanoma invasivo se les realiza un conjunto de exploraciones para determinar la presencia de enfermedad metastásica a distancia (analítica general que incluya hemograma, bioquímica con FA, GGT y LDH, y otros marcadores; Rx simple de tórax PA y lateral; electrocardiograma). En algunos centros se recomienda practicar en los estadios IB y IIA una ecografía abdominal. En cualquier caso, ante la sospecha clínica de metástasis se solicitarán exploraciones complementarias (TC, RMN, PET, etc.). Dado que la paciente presenta un melanoma invasivo y características clínicas que hacen sospechar que se hayan producido metástasis a distancia se realizaron los siguientes estudios: TAC: Tumoración nodular de 17mm Æ parietal superior izquierda, discretamente hiperdensa con edema perilesional que no ejerce efecto masa (Figura 3). PET-TAC: Lesión hipermetabólica cerebral y otra a nivel axilar derecho. A pesar de que la BSGC fue negativa, encontrar una lesión hipermetabólica axilar hace sospechar de una posible metástasis de melanoma ganglionar; se debe realizar un vaciamiento axilar y estudiar el material obtenido histológicamente en búsqueda de componente tumoral. Vaciamiento axilar derecho: 12 adenopatías con histiocitosis sinusal, macrófagos intraganglionares y en partes blandas fibroadiposas. No se observan células tumorales. Se realiza inmunohistoquímica que tiñe células histiocitarias con marcador CD68 y algunas células reticulares dendríticas con S-100. HMB-45 no muestra celularidad positiva. Juicio diagnóstico: Melanoma en estadio IV: pt2b, pn0, M1d. 9

ETIOLOGÍA La etiología del melanoma cutáneo es desconocida. Los estudios epidemiológicos realizados hasta el momento muestran la existencia de predisposición genética y el impacto negativo de la exposición solar en el desarrollo de melanoma (3). La paciente no tiene historia familiar conocida de melanoma o lesiones precursoras. Probablemente la exposición solar a lo largo de su vida y los antecedentes de quemaduras solares jueguen un papel importante en la etiología de su enfermedad. TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO En el momento actual, la paciente no presenta ninguna lesión de melanoma conocida, salvo la tumoración cerebral. Aproximadamente el 40% de los pacientes con melanoma avanzado tiene metástasis cerebrales (4). Las opciones de tratamiento para las metástasis cerebrales en esta paciente incluyen: radiocirugía, resección quirúrgica, radioterapia holocraneal o terapia sistémica dirigida. Dada la localización accesible de la lesión tumoral y la ausencia de lesiones de melanoma a otros niveles, se propone a la paciente su resección quirúrgica con intención curativa. Se inicia seguimiento. Tres meses más tarde se le realiza craneotomía y exéresis de la lesión cerebral. El estudio anatomopatológico confirma que se trata de una metástasis de melanoma. Seis meses más tarde se le realiza un TAC de control donde se evidencian lesiones nodulares en ambos pulmones (Figura 4, 5), lesiones ocupantes de espacio hepáticas difusas (Figura 6, 7) y múltiples lesiones focales milimétricas de características osteoblásticas a nivel de pelvis (Figura 8). Ante un melanoma avanzado metastásico se decide iniciar tratamiento con ipilimumab (5). Actualmente está en seguimiento en CCEE de Oncología médica. 10

4. DISCUSIÓN 4.1 ANÁLISIS CRÍTICO Los distintos estudios revisados indican que la incidencia de melanoma se mantiene en aumento y continúa siendo la primera causa de muerte por lesiones cutáneas malignas (2). Los avances en el pronóstico de la enfermedad permiten disponer de un conjunto de parámetros histológicos capaces de proveer al médico información importante para predecir el comportamiento del melanoma y estimar la supervivencia del paciente. En el caso clínico descrito, nos encontramos histológicamente ante un paciente de mal pronóstico. El melanoma nodular se caracteriza por encontrarse en fase vertical desde su aparición y su crecimiento es muy rápido (3). El nivel de Clark III nos indica que el melanoma invade y rellena la dermis papilar y está próximo a infiltrar la dermis reticular. El índice mitótico es de 1 mitosis por mm 2, lo que indica que el tumor tiene actividad. Aparentemente, la exploración clínica inicial muestra una lesión nodular no ulcerada (Figura 1). Sin embargo, durante el examen microscópico, el patólogo observa algunos cortes donde existe presencia de un adelgazamiento muy marcado de la epidermis junto con cambios inflamatorios en la unión dermoepidérmica, compatible con ulceración (Figura 2); este hallazgo implica una menor supervivencia (6). Por otro lado, el grosor del tumor en profundidad (espesor de Breslow) es de 2mm. Este dato junto a la ulceración, la ausencia de metástasis ganglionares y la presencia de metástasis a distancia en el SNC, hace clasificar a la paciente como pt2b, pn0, M1(d), estadio IV. No todos los datos histológicos son de mal pronóstico: la ausencia de células tumorales en la superficie de los nervios contenidos en el tumor sugiere un menor riesgo de recurrencia local tras la excisión completa (7); la existencia de linfocitos infiltrando el tumor se relaciona con una menor frecuencia de metástasis en el ganglio centinela (8). 11

En el tratamiento de la paciente, cuando se le diagnostica la metástasis cerebral, se descarta la radioterapia holocraneal, porque no aumenta la supervivencia en pacientes con una a tres metástasis (4). La terapia sistémica tampoco se contempla inicialmente, dado que la mayor parte de los agentes no atraviesa adecuadamente la barrera hematoencefálica (4). Entre radiocirugía y resección quirúrgica, se decide ésta última por existir buena accesibilidad a la lesión. Al detectarse un mes más tarde metástasis en varios puntos del organismo, se decide tratarle con ipilimumab, ya que ha demostrado un aumento en la supervivencia de los pacientes con metástasis de melanoma previamente tratados con otras terapias (9). Ipilimumab es un anticuerpo monoclonal frente al antígeno de superficie CTLA-4, presente en la superficie de los linfocitos T citotóxicos. Este antígeno es un regulador negativo de la activación de los linfocitos T citotóxicos. Ipilimumab, al bloquear la señal inhibidora de CTLA-4, estimula la proliferación y activación de los linfocitos T citotóxicos, facilitando la destrucción de las células tumorales (5). Desde un punto de vista clínico, este caso nos sugiere como conclusión principal la importancia de incluir y describir de forma minuciosa el mayor número de factores pronósticos posible a partir de la biopsia de melanoma, con el fin de predecir de forma precisa la evolución del paciente, facilitando al médico la toma de decisiones adecuada para optimizar la supervivencia. Figura 1 Melanoma nodular Figura 2 Ulceración microscópica 12

Figura 3 Metástasis cerebral Figura 4 Metástasis pulmonares Figura 5 Metástasis pulmonares Figura 6 Metástasis hepáticas Figura 7 Metástasis hepáticas Figura 8 Metástasis pélvicas 13

4.2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA INTRODUCCIÓN El melanoma es un tipo de cáncer que generalmente tiene su comienzo en unas células presentes en la piel llamadas melanocitos. Sin embargo, esta neoplasia puede formarse en cualquier parte del organismo (p.ej., senos paranasales, cavidad oral, ano, vulva, vagina, tracto gastrointestinal, úvea, e incluso, aunque de forma infrecuente, en órganos internos) (1). Su incidencia se ha incrementado de forma constante en las últimas décadas y continúa siendo la primera causa de muerte entre las lesiones cutáneas malignas (2). Por todo esto, es importante el estudio de los factores de riesgo que determinan el pronóstico de los pacientes con melanoma, de forma que se pueda estimar cómo va a evolucionar la enfermedad y qué terapia puede ser más adecuada para obtener los resultados más óptimos. FACTORES DE RIESGO HISTOLÓGICOS DE IMPORTANCIA PRONÓSTICA El diagnóstico de melanoma debe ser minucioso y preciso e implica la determinación de una serie de parámetros histológicos significativamente importantes a la hora de realizar el estadiaje tumoral y establecer el pronóstico del paciente: subtipo histológico; espesor de Breslow; nivel de Clark; fase de crecimiento; tasa de mitosis; presencia de ulceración; invasión linfovascular; regresión tumoral; satelitosis microscópica, metástasis satélites y en tránsito; neurotropismo; linfocitos infiltrando el tumor; asociación de nevus melanocíticos; citología predominante; márgenes de resección; ganglio centinela; extensión extranodal; estadiaje TNM (2,6). Además, hay otros factores no histológicos que también intervienen en el pronóstico: niveles de LDH en suero (6). 14

Subtipo histológico: Si bien el melanoma se ha clasificado principalmente en cuatro subtipos histológicos (melanoma extensivo superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno y melanoma lentiginoso acral), Frishberg DP et al (6) refieren que hay descritos otros subtipos menos frecuentes que igualmente hay que considerar: melanoma lentiginoso de mucosas, melanoma desmoplásico/neurotropo, melanoma derivado de un nevus azul, melanoma en la infancia, melanoma nevoide, melanoma persistente y melanoma no clasificable. Cada subtipo histológico define un patrón de crecimiento de las células tumorales del melanoma. La fase de crecimiento radial es aquella en la que el tumor está confinado a la epidermis sin potencial metastásico, mientras que la fase de crecimiento vertical es aquella en la que las células tumorales infiltran la dermis. Esta última fase es un factor pronóstico adverso, ya que las células tumorales presentan potencial metastásico. Asimismo, algunos subtipos se relacionan con una mayor recurrencia local (p.ej., melanoma fusiforme y melanoma desmoplásico) al ser más propensos al neurotropismo (7). También se ha documentado que, el melanoma desmoplásico puro, es decir, aquel cuyo componente desmoplásico es superior al 90% del total, tiene una baja incidencia de metástasis a nivel de los ganglios linfáticos y que se puede usar como criterio para desaconsejar realizar la biopsia selectiva del ganglio centinela (2). A pesar de la información que se puede obtener de la clasificación del melanoma en un subtipo histológico, cabe destacar que cada vez hay mayor consenso en que esta clasificación en sí no tiene relevancia en el pronóstico (2). 15

Espesor de Breslow: El espesor de Breslow es la medida del espesor del melanoma en profundidad. Hasta la actualidad, el espesor de Breslow ha demostrado ser el factor pronóstico que mejor predice el comportamiento clínico de los pacientes con melanoma (2,6). Al mismo tiempo, se ha determinado que el espesor de Breslow es el parámetro con menor variabilidad interobservador (2). Para evaluar de forma adecuada el espesor de Breslow, algunos autores (2) aconsejan la utilización de un micrómetro ocular bien calibrado para evaluar las lesiones que tienen un espesor inferior a 2mm, siendo opcional para lesiones superiores a 2mm, en las que se podrá medir utilizando una regla sobre la preparación. La medida se toma desde la superficie de la capa granular de la epidermis hasta el melanocito más profundo del componente invasor del melanoma (el margen más profundo de la masa tumoral o de un grupo aislado de células malignas separadas de la masa primaria). Existe controversia con respecto a si los folículos pilosos y los anejos cutáneos se deben incluir o no en la medición del espesor de Breslow (2). Sin embargo, cuando el componente invasor del melanoma solo se identifica en la vecindad de estas estructuras, el espesor de Breslow se debe medir desde el centro del folículo o anejo cutáneo involucrado hasta el componente tumoral más profundo. Si el tumor tiene ulceración, la medida se debe realizar desde la base de la úlcera hasta la célula tumoral más profunda. Si el componente invasivo se localiza en el margen profundo de la muestra o margen de resección, se debe recoger en el informe indicando que el espesor de Breslow podría ser mayor a la medida realizada. 16

Nivel de Clark: El nivel de Clark es el nivel anatómico más profundo que es invadido por las células tumorales del melanoma. Existen los siguientes niveles de Clark: Nivel I: melanoma in situ (está confinado a la epidermis). Nivel II: invasión de la dermis papilar sin rellenarla ni expandirla. Nivel III: invasión de la dermis papilar rellenándola y expandiéndola. Nivel IV: invasión de la dermis reticular. Nivel V: invasión del tejido celular subcutáneo. Tradicionalmente, los niveles de Clark se correlacionaban con la supervivencia de los pacientes con melanoma y se incluían dentro del sistema de estadiaje de melanoma de la American Joint committee on Cancer (AJCC). Sin embargo, análisis multivariantes han concluido que no es un factor pronóstico independiente cuando se analiza junto a la tasa de mitosis y que, por tanto, no se debe utilizar como criterio para estadiar el tumor (2). De hecho, la 7ª edición del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC sustituía el nivel de Clark por la tasa de mitosis dentro de los requisitos primarios para subclasificar las lesiones pt1. En la actualidad, la edición 8 del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC ha eliminado definitivamente el uso de este parámetro ya que, aunque el nivel de Clark es significativo en análisis univariados, numerosas publicaciones han mostrado que el nivel de invasión es menos reproducible entre patólogos y no refleja el pronóstico de forma tan precisa como lo hace el espesor de Breslow (8). Sin embargo, debe seguir siendo recogido en los informes como característica primaria del tumor. 17

Fase de crecimiento: La fase de crecimiento tumoral hace referencia a la dirección que sigue el componente invasor del tumor. Existen dos fases de crecimiento tumoral: la fase radial y la fase vertical. La fase radial típicamente se ha descrito como un crecimiento celular limitado a la epidermis. Según Frishberg DP et al (6) cuando las células tumorales invaden la dermis, aún pueden tener un crecimiento radial, definiendo el crecimiento vertical cuando los nidos celulares de la dermis son más grandes que los nidos de la epidermis o cuando se identifica el componente mitótico en los melanocitos de la dermis. El tipo de crecimiento de las células del tumor puede predecir el potencial metastásico del melanoma. Como se ha explicado previamente, la fase de crecimiento vertical se considera un factor pronóstico adverso debido a que el componente invasor del tumor tiene potencial metastásico. Por otro lado, la fase vertical se correlaciona con el volumen tumoral (2), por consiguiente, cuantas más células tumorales confluyan en la dermis, mayor será el potencial metastásico del melanoma. Tasa de mitosis: La tasa de mitosis es un factor pronóstico independiente para melanoma cutáneo. En la edición 7 del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC, la tasa de mitosis sustituía al nivel de Clark para subclasificar las lesiones pt1. La demostración de tan solo una sola mitosis en el melanoma implicaba clasificar un tumor pt1a como pt1b pasando de un estadio IA a un estadio IB, con impacto en las tasas de supervivencia (10). Sin embargo, en la última edición del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC (8ª edición) se elimina este parámetro al demostrarse que, utilizar como punto de corte 0,8mm, tiene una asociación más potente con los resultados clínicos (8). No obstante, este parámetro debe seguir recogiéndose en los informes, ya que su presencia sigue siendo un factor pronóstico adverso en melanomas con cualquier espesor. 18

La correcta evaluación de la tasa de mitosis se basa en localizar en la dermis los denominados hot spots, que son puntos calientes donde se concentra el mayor número de células tumorales melanocíticas en mitosis. Se deben contar las mitosis de un punto caliente y a continuación contar las mitosis de los campos microscópicos adyacentes hasta cubrir el área correspondiente a 1mm 2. En el caso de que no se encuentren puntos calientes se debe seleccionar una mitosis representativa y empezar a contar en ese campo extendiéndolo igualmente a campos adyacentes hasta cubrir un área de 1mm 2. El resultado se emite como número de mitosis por mm 2. Cuando el componente invasivo del tumor ocupa un área inferior a 1mm 2, el número de mitosis debe ser representado como ³1 mitosis/mm 2 cuando están presentes, o como 0 mitosis/mm 2 cuando están ausentes (6). Ulceración: Un melanoma ulcerado implica una menor tasa de supervivencia con respecto a los melanomas no ulcerados, aun cuando tienen el mismo espesor de Breslow. Así pues, la presencia de ulceración es un factor pronóstico independiente. La ulceración debe ser estudiada mediante microscopía óptica. La ulceración debida al traumatismo quirúrgico no se tiene en cuenta como factor pronóstico y debe ser diferenciada por el patólogo de aquella debida al tumor. Los hallazgos que se van a encontrar son: pérdida del espesor de la epidermis (incluyendo membrana basal y estrato córneo), evidencia de cambios reactivos (p.ej., depósitos de fibrina, neutrófilos, etc.) y variaciones de la epidermis adyacente que pueden ir desde hipoplasia hasta hiperplasia reactiva. Estudios recientes han sugerido que la ulceración es menos significativa para predecir el pronóstico cuando se tiene en cuenta la tasa de mitosis (6). 19

Invasión linfovascular: La invasión linfovascular es la extensión de las células tumorales a los vasos linfáticos, sanguíneos o ambos. En cualquier caso, se considera un factor pronóstico adverso (8). La demostración de células tumorales en los vasos linfáticos es asociada por diversos autores (11,12) con un riesgo aumentado de recaídas y metástasis, tanto regionales como a distancia, con impacto en la supervivencia. Sin embargo, otros autores (13) han mostrado que esta característica no es un factor pronóstico independiente en pacientes con melanoma. Ivan D y Prieto VG (2) mostraron que la detección inmunohistoquímica de invasión linfovascular con anticuerpos monoclonales anti-d2-40 (podoplanina), en melanomas con un espesor superior a 1mm, se correlaciona con el estado del ganglio centinela y la supervivencia. Por consiguiente, se recomienda incorporarlo a la rutina diagnóstica. Regresión: Su relación con el pronóstico era controvertida. Mientras que algunos estudios mostraraban que la tasa de metástasis era mayor en melanomas con poco espesor y regresión extensa (³75%), muchos otros no encontraban correlación con el pronóstico del paciente (2,6). Sin embargo, en un meta análisis reciente se ha concluido que la presencia de áreas de regresión es un factor pronóstico favorable. Por otro lado, se concluye que no hay ningún criterio que indique la biopsia selectiva del ganglio centinela en tumores con un espesor de Breslow inferior a 1mm (14). Los hallazgos histológicos de la regresión tumoral son: fibrosis y proliferación vascular de localización dérmica junto a un infiltrado inflamatorio con predominio linfocítico, la presencia de melanófagos y la destrucción de las células tumorales. 20

Satelitosis microscópica, metástasis satélites y en tránsito: Estas lesiones se consideran metástasis que han ocurrido como consecuencia de la extensión intralinfática de las células tumorales. Se habla de microsatelitosis para describir nidos de células tumorales separadas del tumor primario por tejido sano. La presencia de tejido cicatricial o inflamación entre los nidos de células tumorales y el tumor primario no se incluye en la definición de microsatélite. Actualmente ya no hay una distancia mínima de separación con respecto al tumor primario para definir microsatelitosis. Cuando se localiza una zona susceptible de ser un microsatélite se deben examinar distintos cortes histológicos para comprobar que no hay continuidad con el tumor primario ya que se podría sobrediagnosticar microsatelitosis (8). Las metástasis satélites se definen como metástasis cutáneas visibles y/o metástasis subcutáneas a menos de 2cm del melanoma primario (8). Las metástasis en tránsito son lesiones cutáneas o subcutáneas localizadas con una distancia superior a 2cm con respecto al melanoma primario, entre el melanoma primario y el ganglio linfático regional al que drena (10). Neurotropismo: El neurotropismo se define como la presencia de células de melanoma sobre las envolturas de un nervio (invasión perineural) o en su interior (invasión intraneural). Esta característica se identifica mejor en la periferia del tumor. Los subtipos histológicos que tienen mayor propensión a este tipo de invasión son los melanomas desmoplásicos o los de células fusiformes. Su identificación se correlaciona con un aumento del riesgo de recurrencia local (6,7,8). 21

Linfocitos infiltrando el tumor: La presencia de linfocitos infiltrando el tumor (TILs: tumor infiltrating lymphocytes) se considera un factor pronóstico independiente (2). Para considerar que hay TILs, los linfocitos deben rodear e interrumpir el crecimiento de las células tumorales en fase vertical. Se pueden obtener tres resultados: TILs no identificados (no hay linfocitos infiltrando el tumor); TILs de forma no intensa (los linfocitos infiltran el tumor solo de forma focal); TILs de forma intensa (hay linfocitos infiltrando el tumor de forma difusa). La presencia de un escaso componente linfocitario infiltrando el tumor confiere al paciente mal pronóstico con peor supervivencia. Al contrario, un gran componente linfocitario se correlaciona con una mejor supervivencia y una menor frecuencia de metástasis en el ganglio centinela (8). Nevus melanocítico asociado: Ivan D y Prieto VG (2) sugieren que este hallazgo podría tener utilidad para realizar estudios epidemiológicos en el futuro y determinar si hay algún tipo de asociación con la supervivencia. Asimismo, también podría ser de utilidad en caso de realizar una reexcisión, para conocer qué tipo de lesión residual existía, lo cual puede resultar complicado en melanomas derivados de nevus azules o nevus con gran invasión. Citología predominante: Su determinación tiene aplicabilidad práctica cuando se evalúan biopsias rexcisionales o posibles ganglios linfáticos infiltrados por células tumorales. Se ha visto sobre todo su rentabilidad en melanomas de células pequeñas o carcinomas nevoides en los cuales podría ser difícil estudiar si hay metástasis en ganglios linfoides pequeños. Por ejemplo, si el tumor primario tiene histología de células fusiformes, además de determinar HMB45, anti-mart1 y anti-tirosinasa, también se deberá determinar anti-s100 en el ganglio centinela para descartar metástasis, ya que se ha visto que los melanomas con células fusiformes no se tiñen con HMB45 o MART1 (2). 22

Márgenes de resección: Se debe recoger la presencia o ausencia de componente invasor tumoral en los márgenes laterales y profundos de las biopsias excisionales ya que podría existir satelitosis (6). Por tanto, si hay presencia de células tumorales en un margen, se debe valorar si el tumor está invadiendo los tejidos no incluidos en la biopsia. Ganglio centinela: Algunos estudios (15,16,17) han sugerido que la carga tumoral o el patrón de metástasis del ganglio centinela podría predecir qué pacientes tienen enfermedad en ganglios no centinelas y así ayudar a seleccionar aquellos pacientes que se beneficiarían de una linfadenectomía total. Paralelamente, algunos investigadores han indicado que la carga o patrón de enfermedad en el ganglio centinela también podría ser un factor pronóstico (18,19). El análisis del ganglio centinela se debe realizar en aquellos pacientes que presenten un melanoma cutáneo con un espesor superior o igual a 1mm. Sin embargo, estudios recientes indican que también podría estar justificado en tumores con un espesor inferior a 1mm (20). Para el estudio histológico del ganglio centinela, el patólogo requiere que se le envíe la totalidad del ganglio. No se recomienda su análisis mediante cortes por congelación (21). Se puede incrementar la sensibilidad en la detección de micrometástasis mediante el examen de preparaciones teñidas con hematoxilinaeosina a través de la sección seriada de los ganglios centinela. El uso de inmunohistoquímica (p.ej., HMB45 o MART1) incrementa la sensibilidad de detección de metástasis microscópicas de melanoma y se debe considerar en la evaluación del ganglio centinela (6). 23

Extensión extranodal: La extensión extranodal se define como la presencia de metástasis ganglionares linfáticas que se extienden a través de la cápsula a los tejidos adyacentes. Con frecuencia se produce en asociación a metástasis ganglionares que se detectan clínicamente por engrosamiento o masas ganglionares que se forman mediante la adherencia dos o más ganglios linfáticos. Con menos frecuencia se identifican en asociación con micrometástasis. La extensión extranodal es un factor pronóstico adverso en pacientes con melanoma (8). Estadiaje TNM: El estadiaje TNM consiste en un sistema de clasificación de tumores creado por la American Joint Committee on Cancer (AJCC) y la International Union Against Cancer (UICC), que es utilizado para describir la cantidad de cáncer presente en el organismo, así como su diseminación en un paciente mediante la utilización de las letras TNM. A partir de la determinación del estadio de un tumor en un paciente concreto, este sistema permite estimar la tasa de supervivencia. La primera edición del manual de estadiaje tumoral fue publicada en 1977 (10) y actualmente ya van por la 8ª edición, publicada en 2016 (21). Tumor primario (T) (Tabla 1): La letra T hace referencia a la extensión del tumor primario que no ha sido tratado. TX indica que el tumor no puede ser valorado, mientras que T0 significa que no hay evidencia de tumor primario. Tis describe al melanoma in situ. Finalmente, T1, T2, T3 y T4 representan melanomas invasivos, definidos por el espesor del tumor medido en milímetros (10). Como ya se ha indicado previamente, el espesor de Breslow es el factor pronóstico que más se relaciona con la supervivencia en pacientes con melanoma en estadios tempranos (2,6). Por otro lado, la presencia de ulceración define las categorías T1b-T4b, ya que actúa como un factor pronóstico independiente. 24

En la edición 7 del sistema de clasificación de tumores de la AJCC, la tasa de mitosis también se incluía para definir la categoría 1b reemplazando el nivel anatómico de Clark. Sin embargo, en la edición 8 se ha eliminado como criterio de estadiaje al demostrarse que, usar como punto de corte 0,8mm, tiene una asociación más potente que basarse en la presencia o ausencia de mitosis (8). No obstante, este parámetro debe seguir recogiéndose en los informes ya que su presencia sigue siendo un factor pronóstico adverso en tumores de cualquier espesor. El nivel anatómico de Clark ya no tiene utilidad en el estadiaje tumoral (8). Ganglios linfáticos regionales (N) (Tabla 2): La letra N describe la presencia o ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales; son los lugares más frecuentes donde metastatiza el melanoma (3,10). En el apartado Nódulos linfáticos se describió la asociación de la carga tumoral con un empeoramiento de la supervivencia (18,19). Otros estudios (22,23) han demostrado que los pacientes con micrometástasis en los ganglios linfáticos tienen mejor supervivencia que aquellos con metástasis macroscópica. Por otro lado, la edad avanzada se ha asociado con una menor incidencia de ganglio centinela positivo, pero con mayor tasa de mortalidad que los pacientes más jóvenes (24). Para definir la categoría N adecuada se tiene en cuenta el número de ganglios regionales afectados. NX representa pacientes en los que los ganglios regionales no pueden ser valorados, N0 indica la ausencia de metástasis regionales detectables, N1 hace referencia a la presencia de metástasis en un solo ganglio regional o metástasis en tránsito, satélite y/o microsatélite sin ningún ganglio linfático regional involucrado. N2 informa de pacientes con 2-3 ganglios linfáticos regionales positivos o metástasis en tránsito, satélite y/o microsatélite con un ganglio linfático regional involucrado, y N3 incluye: pacientes con 4 o más ganglios regionales metastásicos; aquellos con lesiones en tránsito, satélites y/o microsatélites que tienen 2 o más ganglios regionales afectos; cualquier número de ganglios regionales adheridos entre sí con presencia o ausencia de metástasis en tránsito, satélites y/o microsatélites. 25

Se puede añadir el sufijo a y b a N1 y N2 para indicar que son micrometástasis y macrometástasis, respectivamente. Además, el sufijo c describe pacientes con metástasis en tránsito o satélites que presentan las siguientes características: N1c no tiene ganglios linfáticos regionales afectos; N2c tiene un ganglio regional afecto; N3c tiene 2 o más ganglios regionales afectos o cualquier número de ganglios regionales adheridos entre sí. Las metástasis en ganglios linfáticos regionales son aquellas que ocurren en un ganglio de drenaje o dos contiguos. Las metástasis en ganglios que no son de drenaje se consideran enfermedad M1 (6). Metástasis a distancia (M) (Tabla 3): La letra M indica la presencia o ausencia de metástasis a distancia. A diferencia de las letras T y N donde la X significa que no se puede realizar una valoración de las características, la M no puede ser clasificada como MX; si no hay evidencia clínica o patológica de metástasis a distancia, se debe clasificar como M0. Para el resto de categorías: M1a indica metástasis a distancia en piel, tejidos blandos y/o ganglios linfáticos no regionales; M1b metástasis a distancia en pulmón con presencia o ausencia de enfermedad en localizaciones de la categoría M1a; M1c metástasis a distancia en localizaciones distintas al sistema nervioso central con posibilidad de que exista enfermedad en localizaciones de la categoría M1a y/o M1b; M1d metástasis a distancia en el sistema nervioso central con presencia o ausencia de enfermedad en localizaciones de la categoría M1a, M1b y/o M1c. La determinación de lactato deshidrogenasa (LDH) se incluye dentro del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC ya que se ha visto que es un factor pronóstico adverso independiente (25). En la última edición, se utilizan los sufijos (0) o (1) para indicar que los niveles de LDH no están elevados o sí están elevados, respectivamente. Si no se indica este sufijo, se entiende que no se ha podido determinar la LDH o es inespecífica (8). 26

El número de metástasis a distancia se considera un factor de riesgo importante. Sin embargo, no se incluye dentro del sistema de estadiaje porque hay una variabilidad significativa en la detección clínica mediante el uso de distintas técnicas (p.ej., radiografía simple de tórax, TAC, PET-TAC, RMN, etc.) (8). Descriptores: Al sistema TNM se le puede añadir un prefijo atendiendo a una serie de características que definen las condiciones en las que se ha definido el estadiaje: - Prefijo c : se usa cuando el estadiaje se realiza de forma clínica o radiológica. Este estadiaje se informa después de realizar la excisión completa del tumor primario con la evaluación de metástasis regional o a distancia. - Prefijo p : se emplea cuando se realiza el examen patológico del melanoma y los ganglios linfáticos después de una linfadenectomía parcial o total. - Prefijo y : se utiliza cuando al paciente se le administra radioterapia o quimioterapia antes de la resección quirúrgica, o cuando se ha administrado sin resección quirúrgica, yptnm o yctnm, respectivamente. - Prefijo r : se escribe cuando la enfermedad recidiva después de un intervalo libre de enfermedad (rtnm). No modifica el ctnm o ptnm original. - Prefijo a : se debe indicar cuando la enfermedad se descubre postmoretem (atnm). De forma adicional se puede determinar: - Tumor residual (R): es el tumor restante en un paciente después de haber sido sometido a terapia con intención curativa. o RX: Presencia de tumor residual que no puede ser evaluada. o R0: No hay tumor residual. o R1: Tumor residual microscópico. o R2: Tumor residual macroscópico. - Invasión linfovascular (LVI): como su nombre indica, incluye la invasión tumoral vascular sanguínea, vascular linfática o ambas a la vez. 27

Grupos de estadiaje (Tabla 4): Enfermedad localizada (estadio I y II): el melanoma localizado tiene un pronóstico favorable. Enfermedad regional (estadio III): los pacientes en este estadio tienen metástasis locorregionales, tanto nodales como no nodales. Los pacientes con un estadio IIIA tienen de 1 a 3 ganglios linfáticos afectos por micrometástasis (N1a y N2a) sin ulceración (T1a, T2a) o con ulceración (T1b). Los estadios IIIB y IIIC presentan una combinación compleja de T y N (observar tabla 4). Finalmente, la edición 8 del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC incluye un nuevo estadio (IIID) para aquellos melanomas ulcerados con un espesor superior a 4mm que presentan: 4 o más ganglios regionales metastásicos; lesiones en tránsito, satélites y/o microsatélites que tienen 2 o más ganglios regionales afectos; cualquier número de ganglios regionales adheridos entre sí con presencia o ausencia de metástasis en tránsito, satélites y/o microsatélites. Metástasis a distancia (estadio IV): el pronóstico es desfavorable. La presencia de LDH elevada tiene un impacto negativo en la supervivencia y determina la categoría M1(1). Algunos estudios informan de que el número de metástasis a distancia podría tener importancia en el pronóstico del melanoma metastásico (10). Tasas de supervivencia (Tabla 5): La tasa de supervivencia es el porcentaje de pacientes que se mantienen vivos después de un tiempo determinado a partir del diagnóstico de melanoma. La tasa de supervivencia se da en forma de porcentaje de pacientes que sobrevive a los 5 años o a los 10 años (26). Las tasas de supervivencia todavía no se han publicado para la 8ª edición del sistema de estadiaje de melanoma de la AJCC, pero podrían ser desarrolladas como parte de una herramienta online que usa algoritmos complicados para calcular la supervivencia del paciente (27). 28

Tabla 1 Definiciones de TNM Tumor primario (T) (8ª edición AJCC) Categoría T Espesor Ulceración TX: No puede evaluarse T0: No evidencia de tumor primario Tis: melanoma in situ T1 1,0mm Desconocido o no especificado T1a <0,8mm Sin ulceración T1b <0,8mm Con ulceración 0,8-1,0mm Sin ulceración T2 >1,0-2,0mm Desconocido o no especificado T2a >1,0-2,0mm Sin ulceración T2b >1,0-2,0mm Con ulceración T3 >2,0-4,0mm Desconocido o no especificado T3a >2,0-4,0mm Sin ulceración T3b >2,0-4,0mm Con ulceración T4 >4,0mm Desconocido o no especificado T4a >4,0mm Sin ulceración T4b >4,0mm Con ulceración Tabla 2 Categoría N Definiciones de TNM Ganglio linfático regional (N) (8ª edición AJCC) Nº de ganglios linfáticos involucrados Metástasis en tránsito, satélites o microsatélites NX Ganglios regionales no evaluados No N0 No se detectan metástasis regionales No N1 1 ganglio regional o metástasis en tránsito, satélite y/o microsatélite sin ningún ganglio linfático regional involucrado N1a 1 clínicamente oculto (p.ej., detectado por biopsia del ganglio centinela) No N1b 1 clínicamente detectado No N1c Enfermedad en ganglio linfático no regional Si N2 2-3 ganglios regionales o metástasis en tránsito, satélite y/o microsatélite con un ganglio regional involucrado N2a 2-3 clínicamente ocultos (p.ej., detectado por biopsia del ganglio No centinela) N2b 2-3 clínicamente detectados No N2c 1 clínicamente oculto o detectado Si N3 N3a N3b N3c ³4 ganglios o metástasis en tránsito, satélite y/o microsatélite con ³2 ganglios involucrados, o cualquier número de ganglios adheridos entre sí ± metástasis en tránsito, satélites y/o microsatélites No No ³2 clínicamente ocultos o detectados y/o presencia de cualquier número de ganglios adheridos entre sí Si 29

Tabla 3 Definiciones de TNM Metástasis a distancia (M) (8ª edición AJCC) Categoría M Localización Nivel de LDH M0 M1 M1a M1a(0) M1a(1) M1b M1b(0) M1b(1) M1c M1c(0) M1c(1) M1d M1d(0) M1d(1) No evidencia de metástasis a distancia Evidencia de metástasis a distancia Metástasis a distancia en piel, tejidos blandos y/o ganglios linfáticos no regionales Metástasis a distancia en pulmón ± localizaciones de M1a Metástasis a distancia en localizaciones distintas al SNC ± localizaciones de M1a o M1b Metástasis a distancia en el SNC ± localizaciones de M1a, M1b o M1c No registrado o inespecificado No elevado Elevado No registrado o inespecificado No elevado Elevado No registrado o inespecificado No elevado Elevado No registrado o inespecificado No elevado Elevado Tabla 4 Grupos de estadiaje para melanoma cutáneo (8ª edición AJCC) Estadiaje clínico (ctnm) Estadiaje patológico (ptnm) T N M T N M 0 Tis N0 M0 0 Tis N0 M0 IA T1a N0 M0 IA T1a N0 M0 T1b N0 M0 IB T1b N0 M0 IB T2a N0 M0 T2a N0 M0 IIA T2b N0 M0 IIA T2b N0 M0 T3a N0 M0 T3a N0 M0 IIB T3b N0 M0 IIB T3b N0 M0 T4a N0 M0 T4a N0 M0 IIC T4b N0 M0 IIC T4b N0 M0 III Todas N > N0 M0 IIIA T1a/b, T2a N1a, N2a M0 IIIB T0 N1b, N1c M0 T1a/b, T2a N1b/c, N2b M0 T2b, T3a N1a, N2b M0 IIIC T0 N2b/c, N3b/c M0 T1a-T3a N2c, N3a/b/c M0 T3b, T4a N > N0 M0 T4b N1a-N2c M0 IIID T4b N3a/b/c M0 IV Todas Todas M1 IV Todas Todas M1 30

Tabla 5 Tasas de supervivencia por estadiaje (7ª edición AJCC) Supervivencia a los 5 años Supervivencia a los 10 años IA 97% 95% IB 92% 86% IIA 81% 67% IIB 70% 57% IIC 53% 40% IIIA 78% 68% IIIB 59% 43% IIIC 40% 24% IV 15-20% 10-15% Niveles de LDH en suero: Numerosos estudios han sugerido que un nivel de LDH superior a 200-225U/L o por encima del rango de referencia del laboratorio es un factor pronóstico independiente que determina una disminución de la supervivencia en pacientes con melanoma (22). Si se obtiene una LDH elevada, se recomienda repetir la determinación como mínimo 24 horas después (10). AVANCES EN EL PRONÓSTICO DEL MELANOMA Los factores pronósticos del melanoma están en continua evolución gracias al avance en el conocimiento de sus características genéticas, biológicas y moleculares. Actualmente, se está estudiando toda una serie de parámetros que podrían verse incluidos en la práctica clínica en los próximos años como son la epigenética, el genotipo o el índice de proliferación Ki67. Epigenética: La epigenética hace referencia a un conjunto de factores que regulan la expresión génica de una célula sin modificar la secuencia de bases de la cadena de DNA (p.ej., metilación, acetilación, etc.). Cada vez hay más estudios que demuestran la importancia de la epigenética en el desarrollo y progresión del melanoma (28). Las alteraciones epigenéticas son más frecuentes que las mutaciones, pero son potencialmente reversibles (28). 31

MicroRNA (mirna): El micro RNA son moléculas de RNA de cadena sencilla no codificante sintetizadas por las propias células del organismo, con una longitud entre 19 y 22 nucleótidos, cuya función principal es actuar como regulador postranscripcional. En lo que al melanoma se refiere, algunos mirnas podrían tener un papel importante como biomarcadores para determinar el pronóstico del paciente (29,30,31). Por ejemplo: los niveles de mir-221 en el suero se correlacionan con el espesor del tumor, disminuyendo tras la resección quirúrgica exitosa y aumentando en la recurrencia; también se elevan los niveles de mir-15b en los pacientes con melanoma recurrente; mir-514a regula NF1 y podría ser un marcador de resistencia a los inhibidores de BRAF como el vemurafenib. El papel de la epigenética no solo podría ser importante para establecer el pronóstico del paciente, sino también para desarrollar terapias dirigidas en el melanoma ya que algunos mirnas están implicados en el ciclo celular y proliferación del melanoma (p.ej., Let-7b, mir-193b, entre otros) o intervienen en la migración celular y la invasión tumoral (p.ej., mir-137) (28). RNA no codificantes largos (lncrna): Los fragmentos de RNA no codificantes largos son aquellos que tienen un número mayor de 100 nucleóticos y no están implicados en la síntesis de proteínas. La disregulación de los lncrnas se asocia a la proliferación celular, motilidad, invasión y potencial metastásico en el melanoma. Malat1 y UCA1 podrían ser utilizados como factores pronósticos de metástasis ya que sus niveles se elevan mucho en el melanoma metastásico con respecto al melanoma que no produce metástasis (28). 32

Modificación de histonas y de la estructura de la cromatina: La expresión de SETDB1 conlleva la síntesis de una histona metiltransferasa que regula la metilación de histonas y en consecuencia el silenciamiento de genes y la represión transcripcional. Se ha encontrado una correlación entre la expresión de SETDB1 y la aparición de melanomas con mayor tasa mitótica, nivel de Clark avanzado, en pacientes sin antecedentes de exposición crónica al sol y con una mayor frecuencia de metilaciones en el gen supresor de tumores p16 (32). Metilación de DNA: La metilación del DNA actúa principalmente reprimiendo la transcripción génica. Se han descrito metilaciones aberrantes que podrían ser útiles como marcadores pronósticos (28): la hipometilación de LUNE-1 se asocia a un mejor pronóstico en pacientes en estadio III y la hipermetilación a un incremento en la cantidad de genes supresores de tumores hipermetilados en los melanomas; la metilación de RASSF1A predice la respuesta a la quimioterapia habiendo mejor respuesta cuando RASSF1A está hipometilado; MGMT, promotor de la metilación, se asocia con una mayor respuesta al tratamiento con dacarbazina o temozolamida. Genotipo: Hoy en día, gracias al desarrollo de terapias dirigidas, el estudio de mutaciones genéticas se ha incorporado en la rutina diagnóstica de los pacientes con melanoma metastásico. Diversos estudios (33) demuestran que hay diferencias en la tasa de supervivencia y el perfil de metástasis en función de genotipos específicos. Por ejemplo: los pacientes que presentan la mutación NRAS en melanomas metastásicos tienen una tasa de supervivencia menor que aquellos que no la presentan; la presencia de mutaciones BRAF/NRAS se asocia con una mayor incidencia de metástasis cerebrales con respecto a los tumores no BRAF/NRAS. Otros estudios (34) concluyen que, distintas mutaciones dentro del mismo gen BRAF, muestran tasas de supervivencia distintas. Por ejemplo, la mutación BRAF V600K presenta una tasa de supervivencia inferior a la BRAF V600E. 33

Índice de proliferación Ki67: La proliferación de las células tumorales es una característica importante de la progresión del melanoma. Lo primero que se produce es la fase de crecimiento radial que, como se ha descrito previamente, puede ser in situ (células tumorales confinadas a la epidermis) o invasiva (células tumorales invaden la dermis e histológicamente no hay mitosis ni nidos mayores que los de la epidermis). A continuación, las células tumorales pasan a la fase de crecimiento vertical (histológicamente se encuentran mitosis en la dermis o nidos de células tumorales mayores que los de la epidermis). En ambas fases la proliferación es aparente. Phyllis AG et al (35) muestran que la proliferación disminuye cuando el melanoma entra en la dermis y posteriormente incrementa cuando se inicia la fase de crecimiento vertical. Ki67 es una proteína que se expresa en todas las fases del ciclo celular, excepto en la fase G0. Por tanto, es un marcador de proliferación celular más sensible que las mitosis, que se observan solo en la fase M. Algunos autores proponen utilizar la expresión de Ki67 >20% como un marcador pronóstico independiente (35,36). 34