HEMOGRAMA COMPLETO Hematología I-2018 Bioq. Magdalena Carbonell Cátedra Hematología 1 FBioyF. UNR
HEMOGRAMA Recuento de glóbulos rojos Dosaje de hemoglobina Hematocrito Índices hematimétricos Recuento de glóbulos blancos Fórmula Leucocitaria Relativa (FLR) Informe morfología HEMOGRAMA ESPECIALIZADO Recuento de plaquetas Recuento de reticulocitos 2
TOMA DE MUESTRA Primer paso del procedimiento analítico. Muestra: sangre venosa o sangre capilar (dactilar, talón). En la punción, la sangre debe fluir libremente sin necesidad de presionar la zona. Generalmente se recomienda realizar la extracción tras un ayuno de al menos seis horas, aunque para el hemograma no es imprescindible. Anticoagulante de elección: EDTA (ácido etilen-diamino-tetraacético) Complejante muy potente del calcio, necesario para la coagulación. Se usa 1 mg por ml de sangre, en su forma de sal disódica o tripotásica (EDTA-K3), el más conveniente es la potásica porque es más soluble. 3
TOMA DE MUESTRA Condiciones pre-analíticas Relacionados al paciente Toma de muestra post-ingesta Hábito de fumar Realizar actividad física 20 min. anteriores Estrés Ambulatorio o internado Administración de fármacos o suplementos Toma de muestra Diferencias horarias Postura: sentado, acostado, de pie Mantenimiento prolongado del torniquete Exceso de presión negativa al aspirar sangre por la jeringa Manejo de la muestra Anticoagulante insuficiente o en exceso Mezcla insuf. de sangre/anticoagulante Error en la identificación Almacenamiento inadecuado Retraso en el transporte de la muestra al laboratorio Tipo de tubo incorrecto 4
TOMA DE MUESTRA En el momento de la extracción debemos realizar el FSP de punta de aguja o jeringa Se deben observar los elementos en FSP realizados sin anticoagulante. 5
Cuando se almacena la sangre con o sin anticoagulante a TA se producen diversos cambios, éstos son más rápidos cuanto más elevada es la temperatura y se retrasan al conservar la muestra a 4ºC. En general todos los anticoagulantes producen cambios degenerativos en los elementos, pero con EDTA o heparina es menos notorio que con oxalato. Lóbulos y distorsiones del núcleo Vacuolas en el citoplasma Separación de lóbulos nucleares Borde citoplasmático deshilachado Crenación de hematíes Tinción anómala de estructuras celulares La aparición de estos artefactos subraya la importancia de hacer el extendido de sangre en el momento de la extracción y sin anticoagulante. 6
OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE 1. Sobre un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado, se coloca en un extremo una gota pequeña de sangre recién obtenida, sin anticoagulante. La sangre puede provenir de punción digital o del talón ( en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. 2. Se toma otro portaobjeto que servirá como extensor, el cual se apoya sobre la superficie libre del porta por delante de la gota de sangre formando un ángulo de 45º y se va retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se hace deslizar el extensor con firmeza hacia el otro extremo, dejando una fina película de sangre. 7
OBTENCIÓN DEL FROTIS SANGUINEO 3. Se seca el frotis a Temperatura ambiente. Extensor: portaobjetos de borde pulido, al cual se le han quitado los ángulos para que sea perfectamente liso y más angosto que el portaobjetos. 8
OBTENCIÓN ADECUADA DEL FROTIS SANGUINEO Tamaño de la gota: debe ser tal que, al extenderla no llegue hasta el otro extremo del portaobjetos. El grosor del extendido: depende de la velocidad del deslizamiento y el ángulo formado por los dos portas, cuanto mayor sea la velocidad, el ángulo y el tamaño de la gota, mayor resultará el espesor de la capa formada. Son frotis defectuosos aquellos que presentan los extremos desflecados e irregulares, estrías o escalones. La formación de espacios claros se debe a portas sucios o engrasados. Un buen extendido ocupa ¾ partes del porta, consta de cabeza (más gruesa), cuerpo 9 (mediano) y cola (delgada) y termina en un borde convexo sin estrías ni prolongaciones.
OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE Cabeza: zona excesivamente gruesa. Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la extensión (en ella hay siempre un aumento del número de linfocitos). Cuerpo: región central. En ella hay un reparto equilibrado de las células. Cola: zona excesivamente fina. Corresponde al final de la extensión y en ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos. 10
COLORACIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA Dos etapas: 1º-May Grünwald (MG) 2º-Giemsa 1) Se cubre totalmente el extendido de sangre con varias gotas de May Grünwald. Dejar actuar tres minutos. En ese tiempo actúa el alcohol metílico fijando el preparado: precipita las proteínas. 2) Se vierte sobre el MG igual cantidad de agua estabilizada ph=7. Dejar un minuto. En este tiempo y a este ph actúa el MG. 3) Volcar (no lavar). Cubrir con Giemsa diluido. Dejar 15 min. Dilución Giemsa: 1 ½ gotas de colorante / ml de agua estabilizada 4) Lavar con agua corriente. Secar al aire. 5) Observar al microscopio con aumento 100X 11
COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE Método que utiliza una mezcla de colorantes básicos (azul de metileno) y ácidos (eosina). Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de ph de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina ; mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno. Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado. Hematíes Plaquetas Blasto Hematíes policromatófilos 12
COLORACIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA May Grünwald Eosina (aniónico) Azul de metileno (catiónico) Alcohol metílico (solvente) Actúa óptimamente en medio acuoso a ph = 7. Tiñe: citoplasma, granulaciones específicas, colorea algo de los núcleos pero no diferencia cromatina. Eosinato: sustancias básicas: granulaciones eosinófilas y hemoglobina. Azul de metileno: sustancias ácidas: granulaciones basófilas, granulaciones neutrófilas,nucléolos y hematíes policromatófilos (restos de RNA). 13
Giemsa COLORACIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA -Azur II -Azur II eosina -Glicerina (evita la evaporación debido a la extrema volatilidad del alcohol metílico, aumenta la concentración del colorante). -Alcohol metílico puro (solvente). El Giemsa actúa fundamentalmente por el azur Tiñe: granulaciones azurófilas (presentes en precursores de los granulocitos y granulaciones inespecíficas), Cuerpos de Howell Jolly (restos nucleicos en glóbulos rojos), anillos de Cabot (producto de la fragmentación nuclear en glóbulos rojos),bastones de Auer. Diferencia cromatina nuclear Bastón de Auer Punteado basófilo Howell Jolly Parásitos intracelulares 14
La solución de uso del colorante Giemsa debe ser preparada inmediatamente antes de usar, dado que el colorante produce su efecto máximo en el momento en que la solución stock se adiciona al agua estabilizada. Siempre descartar el remantente. Cantidad de muestras a teñir. Gotas de Giemsa ml de agua estabiliza da 1 6 4 2 12 8 3 18 12 4 24 16 5 30 20 10 60 40 20 120 80 15
COLORACIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA Agua estabilizada Solución buffer de fosfato Sörensen: PO4H2K 0,354 g PO4HNa2 0,580 g H2O c.s.p. 100 ml -Preparación: dilución 1/50 con agua destilada. 16
17
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS 18
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS El examen al microscopio óptico del extendido de sangre periférica revela valiosa información sobre todos los elementos formes de la sangre. Los hematíes deben ser examinados en su tamaño, forma y concentración y distribución de hemoglobina. El tamaño normal del glóbulo rojo es aproximadamente 7. Las plaquetas deben observarse en función de su tamaño, morfología y agregación. Su tamaño es de 1 2. Los leucocitos que normalmente están presentes en la sangre periférica son los granulocitos maduros (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) linfocitos y monocitos. Cada uno cumple distintas funciones y provienen de diferentes estirpes hematopoyéticas. 19
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS Neutrófilos: de 12 14 de diámetro. Núcleo : 2 5 lóbulos unidos por puentes de cromatina condensada Citoplasma : abundante y color rosado, cubierto por una granulación fina específica de color violeta púrpura distribuida uniformemente. 20
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS Eosinófilos:12 17 de diámetro. Núcleo: usualmente dos lóbulos puentes de cromatina. unidos por Citoplasma: granulaciones específicas de color pardo-naranja 21
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS Basófilos: 10 aproximadamente. Núcleo: voluminoso con relación al citoplasma. Cromatina condensada. A veces dificil de distinguir por la presencia de granulaciones gruesas. Citoplasma: granulaciones groseras y muy irregulares en forma y tamaño, color pardo-púrpura. Las granulaciones se presentan también superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente. 22
MORFOLOGÍA DE LOS ELEMENTOS Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 ), pero puede llegar hasta 12, encontrando pequeños, medianos y grandes. Núcleo: por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa o condensada. Citoplasma: Los más pequeños poseen escaso citoplasma color basófilo claro. Alrededor de un 10% son células más grandes y con citoplasma más abundante. Monocitos: 12 18 Núcleo : grande, irregular con escotadura (arriñonada),forma plegada, con cromatina esponjosa. Citoplasma: color gris. Granulaciones azurófilas finas. 23
LINFOCITO GRANULOCITO NEUTROFILO MONOCITO GRANULOCITO EOSINOFILO BASOFILO 24
FÓRMULA LEUCOCITARIA FÓRMULA LEUCOCITARIA RELATIVA (FLR): expresa la cantidad de cada tipo leucocitario en un total de 100 leucocitos. La forma de contar es haciendo una guarda griega desde el cuerpo del frotis hacia la cola hasta llegar a 100 elementos; la observación se hace con objetivo de inmersión y una gota de aceite. FÓRMULA LEUCOCITARIA ABSOLUTA (FLA): expresa la cantidad de cada tipo leucocitario por mm3. Para calcularla es indispensable conocer la cifra de glóbulos blancos (GB) / mm3. FLA: GB/mm 3 x % N N = tipo leucocitario 100 GB normales: 5000 9000/mm 3 25
VALORES NORMALES En Adulto FLR FLA (5000-9000/mm3) Neutrófilos en cayado (NC) 0 1 % 0 90/mm 3 Neutrófilos segmentados (NS) 55 65 % 2750 5850/ mm 3 Eosinófilos (Eo) 1 4 % 50 360/mm 3 Basófilos (B) 0 2 % 0 180/mm 3 Linfocitos (L) 25 35% 1250 3150/mm 3 Monocitos (M) 4 9 % 200 810/mm 3 Ej: Forma de expresar la FLR: (0-63-2-1-30-4) (NC-NS-Eo-B-L-M) 26
INTERPRETACÓN DE LA FORMULA LEUCOCITARIA Recuento total de GB: bajo: leucopenia normal elevado: leucocitosis Recuento diferencial de GB: neutropenia/neutrofilia eosinofilia basofilia linfopenia/linfocitosis monocitosis Relativa Absoluta Ejemplo=un paciente con 14.000/leucocitos mm 3, FLR: 0-80-2-0-14-4 Leucocitosis con neutrofilia relativa y absoluta y linfopenia relativa. Ejemplo= 7500/mm3. FLR: 0-75-2-1-20-2 Neutrofilia y linfopenia relativa 27
VARIACIÓN DE LOS GB CON LA EDAD 28
LA FLR NO VARÍA CON EL SEXO PERO SI CON LA EDAD RN 3 años Adulto Embarazo Mielocito 1 2 % - - - maduro Metamielocito 2 3 % - - - N en cayado 1 4 % 0 2 % 0 2 % 1 3 % N segmentado 65 75 % 25 35 % 55 65 % 65 80 % Eosinofilo 1 4 % 1 4 % 1 4 % 1 4 % Basofilo 0 2 % 0 2 % 0 2 % 0 2 % Linfocito 10 20 % 55 65 % 25 35 % 15 25 % Monocito 4 9 % 4 9 % 4 9 % 4 8 % FLR invertida 29
VARIACIÓN DE LA FLR CON LA EDAD Linfocitos Neutrófilos 30
Material necesario: RECUENTOS GLOBULARES métodos visuales Micropipetas de 20 o 50ul para dilución en tubo Cámara cuentaglóbulos Cubrecámara Diluyentes 9 16 en cada 1º 16 en cada 2º 31
CRITERIO PARA CONTAR Al contar debemos elegir 2 líneas del borde del retículo. Los elementos que toquen esas líneas van a ser contados pero los que toquen la línea opuesta, van a ser descartados. Los recuentos de hematíes, leucocitos y plaquetas y los índices hematimétricos permanecen habitualmente estables durante 6 hs tras la toma de muestra 32
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS DILUYENTE: Líquido de Turk (Ác. Acético glacial, azul de metileno y Agua). El ácido hemoliza los glóbulos rojos y el colorante agregado permite visualizar perfectamente los leucocitos. DILUCIÓN EN TUBO: En un tubo de Kahn, colocar 380 µl de líquido diluyente. Agregar 20 ul de sangre enjuagando 3 o 4 veces el tip y homogeneizar perfectamente. Hacemos una dilución 1/20. Cargar la cámara. 33
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS CÁLCULOS: Se cuentan los elementos (N) en los cuatro cuadrados primarios. Cada cuadrado 1 o tiene una superficie de 1mm 2 por lo tanto los elementos están en 4mm 2. Para saber el volumen en el que están esos elementos se multiplica por la altura de la cámara que es de 0,1 mm3, eso nos dará el número de elementos por 0,1 mm 3 de solución y para expresarlo en mm3 lo multiplicamos por 10. N elementos----------------- 4mm 2 X =----------------------- 1mm 2 N 0 de GB/mm 3 = N. 10. 20 (por la dilución 1/20) = 4 N x 50 VN (adultos) = 5000 a 9000/mm3 34
RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS DILUYENTE: Líquido de Gowers (Na 2 SO 4 anhidro, ácido acético, agua destilada). Mantiene la forma y tamaño de los GR. La concentración de AcH no es tan alta como para producir hemólisis. DILUCIÓN EN TUBO: En un tubo de Khan colocar 4 ml de líquido de dilución y agregar 20 ul de sangre enjuagando 3 o 4 veces el tip. Homogeneizar y cargar la cámara. Hacemos una dilución 1/200. 35
RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS CÁLCULOS: Se usa el retículo de Thoma en el que se cuentan 5 cuadrados secundarios (80 cuadrados terciarios). Como el retículo de Thoma tiene 400 cuadros terciarios que ocupan una superficie de 1mm 2. Esto nos dará el número de elementos por 0,1 mm 3 de solución y para expresarlo en mm3 lo multiplicamos por 10. N elementos-------------- 80 cuadrados X=-------------------- 400 cuadrados N 0 GR/ mm 3 = N. 400. 10. 200 = 80 N x 10.000 Retículo de Thoma VALORES NORMALES HOMBRES: 4.600.000/mm3 a 5.200.000/mm3 MUJERES: 4.200.000/mm3 a 4.600.000/mm3 R. NACIDOS: 4.300.000/mm3 a 5.000.000/mm3 36
RECUENTO DE PLAQUETAS DILUYENTE : Solución al 1% de Ox (NH 4 ) 2 en Agua destilada. Permite visualizar perfectamente las plaquetas, es fácil de preparar y económico. Hay que controlar la contaminación con gérmenes ya que se pueden confundir con plaquetas (mantener en heladera) DILUCIÓN EN TUBO : Se hace una dilución 1/20 como en el caso de los GB. CÁLCULOS : Se cuenta en el retículo de Thoma igual que los GR. N 0 PLQ/mm 3 = N.400.10. 20 = 80 N x 1.000 VN: 150.000 a 350.000/mm 3 37
RECUENTO DE PLAQUETAS MÉTODO INDIRECTO DE FONIO : En un extendido de sangre fresca, mezclada con liquido dispersante y coloreada con MGG se cuentan las plaquetas en distintos campos microscópicos elegidos al azar y simultáneamente los GR de los mismos campos hasta completar un total de 1000 GR. Realizar aparte un recuento de GR en la misma muestra. 1.000 Hematíes -------------- N 0 de plaquetas Hematíes/mm 3 -------------- =X plaquetas/mm 3 Extendido sin dispersante ni anticoagulante Plaquetas dispersas optimas para hacer recuento 38
Materiales necesarios para los laboratorios: Guardapolvo Guantes Por comisión: Lavandina Papel absorbente Alcohol Cubre cámaras El alumno debe concurrir al TP conociendo el tema a desarrollar; dichos conocimientos serán evaluados en forma oral y escrita. 39
MUCHAS GRACIAS 40