USO DE LA PCR MÚLTIPLE PARA DETERMINAR LOS SEROGRUPOS DE CEPAS DE Escherichia coli UROPATÓGENAS

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1 Clave: BMD262NAY USO DE LA PCR MÚLTIPLE PARA DETERMINAR LOS SEROGRUPOS DE CEPAS DE Escherichia coli UROPATÓGENAS Autores: Nayelli Oliva Cabrera-Flores 1 ; Patricia Isidra Cauich- Sánchez 1 ; Armando Navarro-Ocaña 2 ; Ángel Manjarrez-Hernández 2 ; Sandra Gavilanes-Parra 2 ; María Elena Chávez-Berrocal 2 ; José Molina-López 2. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES 1 Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN), Prolongación Carpio y Plan de Ayala s/n, México D.F , México 2 Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, UNAM, México D.F , México CORREO ELECTRÓNICO joseml@servidor.unam.mx

2 INTRODUCCIÓN Escherichia coli (E. coli) fue descrita por primera vez, en el año 1885, por el pediatra alemán Theodore Escherich (Cervantes R., 2005). E. coli es causante de diversas infecciones que incluyen desde enfermedades intestinales como diarreas del tipo secretorio, inflamatoria o hemorrágica, hasta extraintestinales como infecciones del tracto urinario, meningoencefalitis e infecciones de heridas quirúrgicas. Entre sus factores de virulencia asociados a la patogenia de estas infecciones se encuentran la expresión de adhesinas, invasinas y varias enterotoxinas. Otro factor de virulencia importante es el lipopolisacárido (LPS) el cual esta formado de partes: el lípido A, el core y la cadena lateral de azúcares. Esta cadena es la región más expuesta al medio externo, por lo que sus características son esenciales para la supervivencia de la bacteria en diferentes ambientes. Es un polisacárido de gran variabilidad en cuanto a la longitud y tipos de azúcar presentes y contiene los determinantes antigénicos responsables de la especificidad serológica del microorganismo. Cuando la longitud de la cadena lateral de azúcares del LPS es muy corta, no se puede determinar su serogrupo por serología tradicional y se le llama cepas rugosa. Para tipificar E. coli desde el punto de vista serológico, se utiliza un esquema basado por Kauffman, y Edward. Se basa en la presencia de tres antígenos, el antígeno somático O, el capsular K y el flagelar H (Lior et al., 1996). El antígeno somático O es termoestable, su especificidad está relacionada con la disposición de los residuos de azúcares en el lipopolisacárido (LPS) localizado en la membrana externa; se han descrito cerca de 186 antígenos O y se ha observado que existen considerable variación en la distribución geográfica de los serotipos de E. coli (Cervantes R., 2005). E. coli se considera como parte de la microbiota autóctona del intestino del humano y de otros animales, algunas de sus clonas han desarrollado una adaptación, que las ha capacitado para producir diferentes enfermedades en varios órganos y tejidos del hospedero. La mayoría de esas enfermedades afectan las superficies mucosas del humano (Kaper et al., 2004). A las cepas de E. coli que por sus factores de virulencia causan infecciones en humanos, se les ha nombrado patotipos y se agrupan en dos categorías; intestinales y extraintestinales (ExPEC). Al grupo extraintestinal pertenecen E. coli uropatógena (UPEC) y E. coli asociada a meningitis (MAEC) (Johnson et al., 2005). Las cepas UPEC son un miembro prominente de la familia ExPEC, ya que es responsable de más del 90% de las infecciones del tracto urinario (IsTU) no complicadas (Zhang et al., 2003). Éstas se han asociado a 14 serogrupos de UPEC: O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O22, O25, O83 y O75. La determinación de estos serogrupos se puede llevar a cabo por serología

3 tradicional y por el empleo de la PCR. (Bidet et al., 2007; Lloyd et al., 2007). OBJETIVOS Objetivo general: Determinar los serogrupos de cepas de Escherichia coli asociados a infecciones del tracto urinario por serología tradicional y por PCR múltiple Objetivos particulares: Identificar bioquímicamente las cepas de Escherichia coli asociadas a infecciones del tracto urinario. Tipificar por serología tradicional las cepas en estudio. Determinar los serogrupos UPEC por PCR múltiple. MATERIALES Y MÉTODOS Se estudiaron 98 cepas de E. coli aisladas de pacientes ambulatorios con infección de vías urinarias del Hospital General de México, entre el mes de octubre del año 2004 a octubre del 2006, Las cepas de referencia de los cuatro serogrupos uropatógenos de E. coli, empleadas fueron proporcionadas por el laboratorio de Serología de la Facultad de Medicina en la UNAM Para confirmar la especie bacteriana de algunas cepas se utilizó una serie de pruebas bioquímicas, Kiliger, SIM, Malonato, Fenilalanina, Rojo de metilo - Voges Proskauer, urea y gluconato. La tipificación serológica se realizó en placas de 96 pozos con antisueros contra los antígenos somáticos producidos en conejos, y titulados por medio de diluciones seriadas. Se llevó a cabo la extracción de DNA genómico por el kit comercial Insta Gene TM Matrix (BioRad, EUA) y en la PCR múltiple, se utilizaron reactivos de Fermentas y los iniciadores fueron obtenidos de Eurofins (Bioselec, México). DESARROLLO El criterio de selección de las cepas fue que provinieran de pacientes ambulatorios con síntomas clínicos de infecciones del tracto urinario, que tuvieran un resultado positivo al estudio de urocultivo con 100,000 o más unidades formadoras de colonias por ml de orina (UFC/mL) y que no presentaran alguna otra infección simultáneamente. Para la identificación bioquímica las cepas se sembraron en las pruebas bioquímicas mencionadas en materiales y métodos, y se incubaron a 37 C por 24 horas, posteriormente se hizo la lectura de cada una de ellas. Para la extracción de DNA, las cepas se cultivaron en 3 ml de caldo Luria a 37 por 24 h, posteriormente se centrifugó el cultivo a 12,000 rpm durante 1 min. Se removió el sobrenadante y al paquete celular se le trató tal como indica el fabricante. El DNA se conservó a -20 C.

4 La tipificación serológica del antígeno somático se realizó utilizando 186 sueros anti-o 1 de E. coli producidos en conejo. La identificación de los antígenos somáticos se realizó colocando 50 μl de cada suero monoespecífico y 50 μl del antígeno en cada uno de los 96 pozos de la microplaca. Cada placa se incubó a 50 C durante 24 horas cubriéndola para evitar la desecación. Después de este periodo se observó para buscar aglutinación, y determinar los positivos, posteriormente se realizó la titulación correspondiente con los sueros preparados en una solución 1:100: se colocó 100 μl en el primer pozo y 50 μl de solución salina en los pozos restantes, para realizar diluciones 1:2 seriadas hasta tener una dilución final de 1: A cada pozo se le agregó 50 μl del antígeno en estudio incubando durante toda la noche la placa a 50 C para realizar la lectura. El título se definió como aquel en donde la reacción de aglutinación se

5 presente con la mayor dilución. En caso de existir títulos muy cercanos se utilizaron sueros puros adsorbidos con los antígenos que presentaron cruce antigénico (Licona-Moreno y Méndez- Sánchez, 1995). Para el desarrollo de la PCR múltiple, los iniciadores que se emplearon son los descritos por Li et al. (2010). La PCR múltiple se realizó en un volumen final de 30μL de una mezcla de reacción que consiste en 5μL de DNA, 3 μl del regulador de la PCR 1x (50mM KCl, 10 mm Tris-HCl (ph 8.3)), 3 μl de MgCl 2 1.8mM, 1 μl, dntps 3 mm (Fermentas, México), 0.25 μl de los iniciadores respectivos (Bioselec) pmol y 0.25μL de Taq DNA polimerasa (Fermentas, México) a una concentración final de 1.5U. Los parámetros de las reacciones fueron de 95 C durante 5 min, 30 ciclos de 95 C durante 30 s, 53 C durante 1 min y 72 C por 1 min, y una extensión final a 72 C durante 5 min. RESULTADOS En la tipificación serológica los resultados mostraron que de las 98 cepas trabajadas, 65 (66%) fueron tipificables y 33 (34%) no tipificables, por otro lado, de 65 cepas tipificables 47 (48%) correspondieron a serogrupos uropatógenos, de los cuales el serogrupo O25 fue el más frecuentemente encontrado. A las 33 cepas no tipificables no se les pudo determinar los serogrupos por serología tradicional y se les clasificó como rugosas (OR) o no tipificables (ONT). Las cepas OR aglutinaron con todos los antisueros utilizados y las ONT no aglutinaron con ninguno de los 186 antisueros contra el antígeno somático. Se realizó la PCR con las muestras del DNA de todas las cepas del estudio y los resultados mostraron que en 17 cepas (17%) se encontró el mismo serogrupos por ambos métodos. En cambio, en 3 cepas (5%) se encontró un serogrupo diferentes tanto por serología tradicional como por la PCR múltiple y 67 cepas (68%) no amplificaron con los iniciadores trabajados. De las muestras de DNA correspondientes a las cepas no tipificables por serología tradicional, por PCR se encontró que en 11 cepas (11%) se logró identificar el serogrupo, siendo de las ONT 4 positivas para los serogrupos O25 y O21 y 7 de las cepas OR, amplificaron con los iniciadores para los serogrupos O8, O25 y O21. En el electroferograma que se muestra en la figura 1 se pueden observar las bandas de los amplificados, cuyos pesos moleculares corresponden a los serogrupos de las cepas de referencia y de algunas muestras de las cepas de origen clínico: O8 (448 pb), O16 (302 pb), O21 (209 pb) y O25 (230 pb). CONCLUSIONES Se estandarizó la técnica de PCR múltiple usando los iniciadores correspondientes a los serogrupos O8, O16, O21 y O25. En la mayoría de las cepas se encontró correlación de los serogrupos identificados por ambos métodos.

6 El serogrupo O25 fue el más frecuentemente encontrado por la PCR múltiple. En la determinación de serogrupos de cepas UPEC, la PCR múltiple fue más confiable, debido a que se pudieron identificar serogrupos en cepas rugosas y no tipificables. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Li D, Liu B, Chen M, Guo D, Guo X, Liu F, Feng L, Wang L, (2010): A multiplex PCR method to detect Escherichia coli serogroups associated with urinary tract infections, J. Microbiol Methods, 82: Licona-Moreno D, Méndez-Sánchez J.L. (1995) Contaminación bacteriana del estuario del Río Tuxpan y su repercusión en la incidencia de diarrea en el municipio de Tuxpan, Veracruz-México. (Tesis de licenciatura). Tuxpan, Ver. Facultad de Biología, Universidad Veracruzana. pp Lior H. (1996). Classification of Escherichia coli. In: C.L. Gyles (Eds) Escherichia coli in domestic animals and human. CAB International, Wallingford, United Kingdom. pp Cervantes R. (2005) Escherichia coli. En: Bacteriología médica, Lugo, G (Ed). Ediciones Cuellar, 3ª edición, México, D.F. pp Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. (2004) Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol. 2: Johnson JR, Russo TA. (2005) Molecular epidemiology of extraintestinal pathogenic (uropathogenic) Escherichia coli. Int J Med Microbiol. 295: Bidet P, Mahjoub-Messai F, Blanco J, Blanco J, Dehem M, Aujard Y, Bingen E, Bonacorsi S. (2007) Combined multilocus sequence typing and O serogrouping distinguishes Escherichia coli subtypes associated with infant urosepsis and/or meningitis. J Infect Dis. 196: Zhang L and Foxman B. (2003) Molecular epidemiology of Escherichia coli mediated urinary tract infections. Front Biosci. 8:e235- e244.