UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA (Creada por la ley Nº 25265)

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA (Creada por la ley Nº 25265) DIRECCION UNIVERSITARIA DE INVESTIGACION FONDO DE DESARROLLO SOCIO ECONOMICO DEL PROYECTO CAMISEA (FOCAM) PROYECTO DE INVESTIGACIÓN - FOCAM OPTIMIZACION DE LA FECUNDACION IN VITRO PARA LA CONSERVACION DEL MATERIAL GENETICO DE LAS ALPACAS (Vicugna pacos) DE LA COMUNIDAD CAMPESINA DE CARHUANCHO DISTRITO DE PILPICHACA PROVINCIA DE HUAYTARA REGION HUANCAVELICA Línea de Investigación: Preservación de la biodiversidad y el ecosistema de la zona de influencia del proyecto Camisea. INVESTIGADORES Responsable Miembro : Dr. Jaime Ruiz Béjar : Ing. Marino Artica Félix FECHA DE REGISTRO: Fecha de Inicio: Junio del 2014 Fecha de término: Julio del 2016 HUANCAVELICA, MARZO DEL

2 ÍNDICE OPTIMIZACION DE LA FECUNDACION IN VITRO PARA LA CONSERVACION DEL MATERIAL GENETICO DE LAS ALPACAS (Vicugna pacos) DE LA COMUNIDAD CAMPESINA DE CARHUANCHO DISTRITO DE PILPICHACA PROVINCIA DE HUAYTARA REGION HUANCAVELICA Número Página CAPÍTULO I: DESCRIPCION DEL PROBLEMA DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA FORMULACIÓN DEL PROBLEMA OBJETIVOS GENERAL Y ESPECÍFICOS JUSTIFICACIÓN 14 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO DELIMITACIONES BASES TEÓRICAS Y CONCEPTUALES HIPÓTESIS DEFINICIÓN DE TÉRMINOS IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES DEFINICIÓN OPERATIVA DE LAS VARIABLES E INDICADORES 33 CAPÍTULO III: METODOLÓGIA DE LA INVESTIGACION TIPO DE INVESTIGACIÓN NIVEL DE INVESTIGACIÓN MÉTODO DE INVESTIGACIÓN DISEÑO DE INVESTIGACIÓN 34 EXPERIMENTO 1: OPTIMIZANDO EL TIEMPO DE MADURACIÓN DE 34 OVOCITOS DE ALPACA. EXPERIMENTO 2: OPTIMIZANDO EL MEDIO DE CULTIVO DE 35 EMBRIONES EXPERIMENTO 3: EVALUACIÓN DEL MÉTODO DE RECUPERACIÓN 36 DE OVOCITOS. 3.5 POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS ÁMBITO DE ESTUDIO 44 CAPÍTULO IV: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS POTENCIAL HUMANO RECURSOS MATERIALES PRESUPUESTO DE BIENES PRESUPUESTO DE INSUMOS 45 A MATERIALES 45 B REACTIVOS 46 C COMBUSTIBLE PARA EL LABORATORIO PRESUPUESTO DE VESTUARIO PRESUPUESTO DE MATERIALES DE ESCRITORIO PRESUPUESTO DE COMBUSTIBLE PRESUPUESTO DE SERVICIOS 48 a PUBLICACIÓN 48 b PASANTÍA 49 c OTROS SERVICIOS 49 3

3 d CAPACITACIÓN 49 e ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN 49 f CONSULTORÍA PRESUPUESTO (CADENA DE GASTO MENSUALIZADO) FINANCIAMIENTO CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DE ACTIVIDADES EXPERIMENTALES 50 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 51 ANEXO MATRIZ DE CONSISTENCIA PROPUESTA DE INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS 4

4 CAPÍTULO I: DESCRIPCION DEL PROBLEMA 1.1 DESCRIPCION DEL PROBLEMA En la región Huancavelica existen más de 225,000 alpacas (MINAG 2005), las que constituyen alrededor del 7% de la población total nacional y de las cuales el 90% es de raza Huacaya (Quispe et al., 2008). La crianza de alpacas es una importante actividad económica en las 60 comunidades alpaqueras existentes en la región y que agrupan a 3300 familias aproximadamente, las cuales están organizadas en comunidades de pastores bajo un sistema de crianza de rebaño mixto familiar (alpacas, llamas y ovinos). Estos rebaños se caracterizan por carecer de sistemas de crianza adecuados y con escasos criterios de mejoramiento genético (Quispe et al., 2008). La Comunidad Indígena de Carhuancho se encuentra ubicada en la región altoandina denominada Janca o Cordillera, entre los 3,500 a 5,000 msnm, en la jurisdicción del distrito de Pilpichaca, provincia de Huaytará, departamento de Huancavelica. Colinda con las comunidades campesinas de Choclococha, Santa Inés, Llillinta, Ingahuasi, y Carhuapata. En la actualidad hay más de 390 comuneros empadronados en esta Comunidad Indígena y una población de 2340 personas que dependen de la ganadería como actividad económica principal, consistente en el pastoreo de camélidos sudamericanos (alpacas y llamas), ovinos y esquila de vicuñas. Esta comunidad es la primera productora de alpacas en calidad y cantidad, para el año 2005 según fuentes de la Dirección Regional de Agricultura - Huancavelica registró 26,520 cabezas de alpacas, 9,600 llamas y 19,500 ovejas; quedando demostrado que en el ámbito de la región de Huancavelica representa Carhuancho el polo de desarrollo económico en la actividad alpaquera (CEPES, 2009). Por otro lado, en la actualidad los porcentajes de natalidad anual en la mayoría de explotaciones alpaqueras es del orden del 50% (Fernández Baca, 1993), con índices de fertilidad (Apaza et al., 1998) y de preñez (Apaza et al., 2001) que no superan el 65% y 60% respectivamente. Esto se deriva de un reemplazo inadecuado para la reproducción, desconocimiento de la fisiología reproductiva y un inadecuado empleo de reproductores en el apareamiento (Apaza et al., 1998). La aplicación de biotecnologías reproductivas puede contribuir a superar estos bajos índices y aportar al mejoramiento genético en estas especies, sobretodo en la multiplicación de animales de alto valor productivo mantenidos en núcleos genéticos y estos se convertirían en reproductores para los criadores de alpacas y de esta manera contribuir al mejoramiento de los ingresos de los criadores de alpacas de esta región del país (Ruiz, 2011). La transferencia de embriones puede constituir un método valioso para acelerar los programas de mejoramiento genético en camélidos sudamericanos (Franco et al., 1999). Sin embargo hasta 1996 solamente 11 crías de camélidos sudamericanos habían nacido en el Mundo utilizando esta técnica (Del Campo, 1997). En el Perú, Sumar y Franco (1974) lograron la primera cría viva de alpaca obtenida por transferencia quirúrgica de embriones. En Estados Unidos, Wiepz y Chapman (1985) lograron el primer nacimiento de una llama por transferencia de embriones no quirúrgica. Posteriormente, en Perú nacieron 2 crías de alpaca (Palomino et al., 1987); 7 crías de llama nacieron en el Reino Unido entre 1992 y 1995 (Bourke et al., 1992; 5

5 Bourke et al., 1995a,b); y en Chile nació una cría de llama después de 2 transferencias no quirúrgica (Gatica et al., 1994). En los últimos años se han mejorado estos resultados empleando la transferencia de embriones no quirúrgica (Taylor et al., 2000; Von Baer et al., 2003a). En Estados Unidos durante 10 años de trabajo (Taylor, 2003) se logró el nacimiento de 250 crías llamas, mejorando significativamente el último año ya que hasta el año 2002 solamente 40 crías habían nacido vivas. En Chile Von Baer et al., (2003b) lograron transferir embriones de alpaca en llamas receptoras logrando tasas de preñez a los 30 y 90 días de 55,2% y 51,7% respectivamente. En Argentina, Aller et al., (2002) lograron 50% (2/4) de preñez utilizando embriones vitrificados de llama. En Perú, Palomino (2000) reportó el nacimiento de 19 crías luego de superovular 8 hembras donantes con un tratamiento combinado de FSHp/eCG, los embriones recuperados se transfirieron a 30 alpacas receptoras de las cuales 23 quedaron preñadas. Por otro lado, Huanca et al., (2006a) obtuvieron 4 y 23 crías de alpacas y llamas respectivamente, luego de transferir embriones en 10 alpacas y 32 llamas receptoras. Obtuvieron una tasa de colección de embriones de 1,6 ± 0,1 en alpacas y 4,8 ± 0,9 en llamas, una tasa de preñez al día 90 del 40,0% (4/10) y 71,8% (23/32) en alpacas y llamas respectivamente. Sin embargo todos estos resultados han sido obtenidos utilizando la transferencia de embriones tradicional, es decir luego de realizar el lavado uterino de una hembra donadora superovulada e inseminada y transfiriendo los embriones en receptoras sincronizadas, lográndose obtener crías. Por otro lado se han producido embriones in vitro en camélidos sudamericanos (Del Campo et al., 1994; Del Campo et al., 1995; Gómez et al., 2002; Conde et al., 2006; Ratto et al., 2007; Conde et al., 2008; Mendoza et al., 2008; Gamarra et al., 2008a; Machicado et al., 2009; Huanca et al., 2009; Huanca et al., 2010; Huamán et al., 2011; Berland et al., 2011 y Santayana 2012). Sin embargo hasta la fecha no ha nacido en el mundo cría alguna de camélidos sudamericanos con la aplicación de esta tecnología. Es necesario entonces mayores estudios, que nos permitan obtener embriones in vitro de alpaca de mayor calidad genética para que puedan ser transferidos satisfactoriamente en hembras receptoras y lograr gestaciones por primera vez en camélidos sudamericanos. Para ello se piensa obtener ovocitos de alpacas de la Comunidad Indígena de Carhuancho que cuenta con los mejores animales de la región Huancavelica y transferirlos en alpacas de los mismos productores de la Comunidad. 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Muy pocos estudios han sido conducidos sobre la maduración in vitro de ovocitos (Del Campo et al., 1992, 1994; Sansinema et al., 2003, 2006; Chaves et al., 2003; Miragaya et al., 2002; Ratto et al., 1999, 2005, 2006; Ruiz y Correa 2007; Huanca et al., 2009; Santayana 2012) en camélidos sudamericanos. La maduración in vitro simula el tiempo transcurrido y sobretodo los procesos metabólicos que en forma natural ocurren en el ovocito contenido en el folículo dominante, entre el pico preovulatorio de LH hasta que se produce la ovulación (Ruiz, 2011). 6

6 En alpacas, el tiempo mínimo de ovulación fue estimado 26 horas después de la monta natural y 24 horas después del tratamiento con hcg (San Martín et al., 1968). Los primeros reportes de maduración in vitro (MIV) en alpacas (Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007) se han realizado utilizando un tiempo de 26 horas. Asimismo existen reportes que indican el uso de horas de tiempo de maduración (Ruiz et al., 2007; Mendoza et al., 2008; Sacha y Rojas 2009; Taipe et al., 2010; Taipe et al., 2011; Ruiz et al., 2011; Huamán et al., 2011) de los Cúmulo Oóforo Compactos de alpacas con buenas tasas de segmentación y de desarrollo hasta blastocisto. Por otro lado, Park et al., (2005) han encontrado en bovinos, mayores tasas de segmentación y de blastocistos utilizando 18 horas de Maduración in vitro (MIV) de ovocitos que con 20, 22 y 24 horas; en las vacas la ovulación se produce horas después del pico de LH. Estos resultados nos llevan a pensar que es probable que el tiempo óptimo de maduración requerido para ovocitos de alpaca sea menor a 26 horas. Sin embargo, Gamarra et al., (2008a) han utilizado 30 horas de maduración in vitro de ovocitos de alpaca y Huanca et al., (2009) recomiendan 38 horas o más como tiempo óptimo para la maduración de ovocitos de alpaca y Santayana (2012) encontró mayor cantidad de ovocitos maduros con 34 horas comparado con 30 y 26 horas de maduración. Por otro lado, la utilización de la fecundación in vitro (FIV) en camélidos sudamericanos podría ser una alternativa para el mejoramiento genético de camélidos domésticos y para la preservación de los camélidos silvestres (Ruiz 2011). Sin embargo existen pocos reportes de FIV en camélidos sudamericanos: Del Campo et al., (1994); Del Campo et al., (1995); Gómez et al., (2002); Conde et al., (2006); Ratto et al., (2007); Conde et al., (2008); Gamarra et al., (2008a); Mendoza et al., (2008); Machicado et al., (2009); Huanca et al., (2009); Huanca et al., (2010); Huamán et al., (2011); Berland et al., (2011) y Santayana (2012) y hasta la fecha no se ha logrado producir gestaciones ni ha nacido cría alguna con la aplicación de esta técnica. El embrión producido in vitro no está en su ambiente natural que es el útero materno. Es por este motivo que en mamíferos se han evaluado diferentes medios para el cultivo de embriones mamíferos como son: KSOM, CR1aa, CR2, TCM-199, CZB, SOF, USU, Ham F-10, Menezo B, SOF-IVC etc. (Marquant-Leguienne y Humblot, 1998). En camélidos sudamericanos se han utilizado diferentes medios para el cultivo de embriones como son: SOF + 0,6% BSA (Machicado et al., 2009; Berland et al., 2011), SOF-IVC (Mendoza et al., 2008; Huamán et al., 2011; Santayana 2012), SOFaa (Gamarra et al., 2008a; Conde et al., 2008), TCM-199 (Del Campo et al., 1994; Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007; Huanca et al., 2009), KSOM (Condori et al., 2010; Huanca et al., 2010), sin embargo no se ha comparado cuál de estos podría dar mejores resultados para el cultivo de embriones en alpacas. Del Campo et al., (1994) han utilizado PHE (Penicilamina, Hipotaurina, epinefrina) y heparina para la capacitación de espermatozoides de llama, igualmente lo hicieron Gamarra et al., (2008a) para capacitar espermatozoides de alpaca. Por otro lado, Ratto et al., (2007) y Berland et al., (2011) han utilizado sólo heparina como agente capacitante de espermatozoides de llama antes de la fecundación in vitro. Existen otros trabajos de investigación (Mendoza et al., 2008; Huanca et al., 2009; Condori et al., 2010; Huamán et al., 2011; Santayana 2012) en los cuales no han utilizado ningún agente capacitante para la fecundación in vitro de ovocitos de alpaca. 7

7 Por otro lado, Conde et al., (2008) no encontraron diferencias estadísticas en las tasas de segmentación y de blastocistos, con o sin el uso de agentes capacitantes para los espermatozoides de llama. Los agentes capacitantes utilizados fueron penicilamina, hipotaurina y heparina. Estos resultados estarían indicando que no sería necesaria la capacitación espermática para la Fecundación in vitro en camélidos sudamericanos, sin embargo es necesario más trabajos de investigación para confirmar esta hipótesis. Para mejorar las condiciones del cultivo de embriones se ha utilizado diferentes tipos celulares: células de la granulosa, células epiteliales de oviducto de bovino (BOEC, por sus siglas en inglés), y líneas celulares establecidas (células Vero), etc. (Marquant-Leguienne y Humblot, 1998). Con la adición de monocapas de células somáticas al medio de cultivo (Gordon y Lu, 1990) se han mejorado las tasas de desarrollo embrionario en bovinos. Asimismo, el empleo de BOEC como co-cultivo propicia un buen ambiente para el desarrollo final del embrión (Eyestone et al., 1987), pero la utilización de células de la granulosa ha dado mejores resultados (Mochizuki et al., 1991), mientras que la utilización de células de hígado de rata, búfalo o de la teca interna, han dado resultados variables (Gordon, 1994). En camélidos sudamericanos existen pocos reportes del co-cultivo de embriones con células. Del Campo et al., (1994) utilizaron células de oviducto de llama para el co-cultivo de embriones de llama. Ratto et al., (2007) co-cultivaron los embriones híbridos de llama x alpaca con células epiteliales del oviducto de bovino. Por otro lado Berland et al., (2011) utilizaron células del cúmulus para el cocultivo de embriones de llama producidos por fecundación in vitro. En ninguno de los casos reportan algún efecto benéfico del co-cultivo de los embriones con estos tipos celulares, por lo que en este punto también hay un vacío de conocimiento necesario cubrir mediante un trabajo de investigación. Se ha investigado también en el uso de técnicas para la recuperación de COCs en hembras vivas en estas especies. Estas técnicas se presentan como una excelente alternativa para la producción in vitro de embriones ya que permiten disponer de una buena cantidad de COCs/hembra. La fecundación exitosa de estos COCs permitiría obtener más crías/año de la misma donante al transferir los embriones producidos in vitro en receptoras sincronizadas, y así superar el límite fisiológico de una cría/año en las hembras de los camélidos sudamericanos (Ruiz, 2011). En esta perspectiva, se han recuperado con éxito COCs con procedimientos menos invasivos y que no requieren de una cirugía, utilizando la aspiración folicular transvaginal (Brogliatti et al., 2000; Ratto et al., 2005; Huanca et al., 2006b; Sansinema et al., 2007; Gamarra et al., 2008b y Berland et al., 2011) y la laparoscopia (Ruiz y Correa, 2007). Sin embargo en la mayoría de estos estudios no se ha utilizado los ovocitos recuperados para la fecundación in vitro. En otro estudio, Berland et al., (2011) fertilizaron ovocitos de llama recuperados por aspiración transvaginal y lograron altas tasas de desarrollo embrionario (segmentación: 65,3% vs 63,1%; y blastocistos: 23,1 % vs 20,5 %, para los tratamientos superovulatorios con FSH y ecg respectivamente). Como mencionamos anteriormente, no se ha reportado hasta la fecha el nacimiento de cría alguna a partir de un embrión producido in vitro en camélidos sudamericanos. Conde et al., (2006) fueron los únicos que transfirieron embriones de llama producidos por FIV e ICSI y no lograron gestaciones. Por otro lado Aller et al., (2002) lograron gestaciones con embriones 8

8 vitrificados de llama, los embriones fueron recuperados por lavado uterino de llamas donantes. Estos resultados sugieren que se requiere mayor investigación para establecer un protocolo de sincronización de hembras receptoras de embriones frescos y criopreservados. La Comunidad de Carhuancho tiene un enorme potencial como productora de alpacas de calidad, se calcula que la cantidad de fibra por cada alpaca es de 5.00 libras promedio, pudiendo alcanzar hasta 8 libras (CEPES 2009). Se han identificado también alpacas adultas con micras de promedio, cuando el promedio regional es de micras de finura de fibra (Quispe et al., 2008). Sin duda las alpacas de Carhuancho pueden ser utilizadas para mejorar el diámetro de fibra y el peso de vellón en toda la región de Huancavelica, ya que en vacunos se han reportado hasta 80 crías/año por vaca donante de ovocitos (Ruiz 2011), y sabemos que una alpaca tiene menos de 6 crías en toda su vida reproductiva. Asimismo, la tecnología de FIV puede ser utilizada para la conservación de este valioso material genético que representan las alpacas de la Comunidad de Carhuancho, sin embargo para poder aplicar la FIV y lograr gestaciones en alpacas aplicando esta técnica son necesarios mayores estudios los cuales se han puesto en evidencia en esta sección. Ante todos estos aspectos, se presenta la siguiente interrogante la cual se pretende responder en la presente investigación: Problema General: Luego de obtener el tiempo óptimo de maduración de ovocitos, identificar el medio adecuado de cultivo de embriones, reconocer el método de recuperación de ovocitos más adecuado en alpacas donantes y el método adecuado de sincronización de las receptoras Es posible lograr preñeces con embriones producidos por fecundación in vitro para la conservación del material genético de las alpacas de la Comunidad Campesina de Carhuancho? Problemas específicos: Cuál es el tiempo óptimo de maduración in vitro de ovocitos de alpaca? Cuál es el medio adecuado para el cultivo de embriones producidos por fecundación in vitro? Son necesarios los agentes capacitantes de espermatozoides para mejorar las tasas de desarrollo embrionario in vitro? Es necesario el co-cultivo de células con embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro? Cuál es la técnica adecuada para la recuperación de ovocitos en alpacas? Cuál es el método adecuado de superovulación de las hembras donantes de ovocitos? Cuál es el método adecuado de sincronización de las hembras receptoras de embriones por fecundación in vitro? Cuáles son las tasas de desarrollo embrionario (segmentación, mórulas y blastocistos que se obtienen luego de optimizar el protocolo de fecundación in vitro? Cuáles son las tasas de preñez que se obtienen luego de optimizar el protocolo de fecundación in vitro? 1.3 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Optimizar la técnica de fecundación in vitro con gametos de alpacas para producir embriones de calidad que luego de ser transferidos en alpacas sincronizadas puedan 9

9 producir gestaciones que permitan contribuir a la conservación del material genético de las mejores alpacas de los productores de la Comunidad de Carhuancho en Pilpichaca Huancavelica OBJETIVOS ESPECIFICOS EXPERIMENTO 1: Optimizando el tiempo de maduración de ovocitos de alpaca. Encontrar el tiempo óptimo para la maduración in vitro de ovocitos de alpaca. Identificar los estados de maduración nuclear de ovocitos de alpaca madurados in vitro. Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en diferentes tiempos de maduración de ovocitos. EXPERIMENTO 2: Optimizando el medio de cultivo de embriones Identificar el medio adecuado para el cultivo de embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro. Evaluar diferentes agentes para la capacitación de espermatozoides de alpaca en la producción de embriones por fecundación in vitro. Evaluar el co-cultivo de células de oviducto, células de la granulosa y fibroblastos con embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro. Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro en las diferentes condiciones de cultivo. EXPERIMENTO 3: Evaluación del método de recuperación de ovocitos Identificar la técnica adecuada para la recuperación de COCs en alpacas donantes de ovocitos superovuladas. Encontrar el método adecuado de superovulación de las hembras donantes de ovocitos. Encontrar el método adecuado de sincronización de las hembras receptoras de embriones de alpaca. Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV. 1.4 JUSTIFICACIÓN La Comunidad indígena de Carhuancho tradicionalmente se ha dedicado a la crianza de alpacas y es reconocida como líder en la región Huancavelica en la producción de alpacas de calidad, tanto en cantidad como en calidad de vellón. Se han identificado alpacas con una finura de fibra envidiable (16 18 micras) y con peso de vellón que puede llegar a 8 libras, superando largamente los índices productivos de muchas comunidades de la región Huancavelica (24-25 micras de finura y 3-4 libras de peso de vellón). La tecnología de la fecundación in vitro permitiría la conservación de este importante germoplasma y multiplicar dentro de la misma Comunidad de Carhuancho las alpacas de mayor finura de fibra y peso de vellón. Asimismo, esta calidad genética de las alpacas de la Comunidad de Carhuancho se puede aprovechar para contribuir al mejoramiento genético de las otras comunidades de Huancavelica a través del uso de las biotecnologías reproductivas en este caso la fecundación in vitro. 10

10 La fecundación in vitro maximiza el uso de los gametos de animales de calidad genética superior. Una alpaca hembra con empadre natural puede tener sólo una cría al año, sin embargo es posible recuperar de 10 a 15 ovocitos/sesión en alpacas vivas a través de la aspiración transvaginal guiada por ultrasonografía o a través de aspiración laparoscópica y repetir la aspiración al menos 4 veces al mes. Esto nos permitiría tener hasta 60 ovocitos al mes los cuales pueden ser fertilizados y tener de 10 a 15 embriones transferibles por mes y al año 120 a 180 embriones transferibles los cuales pueden perfectamente producir 50 a 60 gestaciones al año al transferir estos embriones en alpacas receptoras de la Comunidad de Carhuancho o de otras comunidades de Huancavelica. Con respecto a la alpaca macho, debido a su pequeño testículo y su escasa producción de espermatozoides, este sólo puede hacer de 2 a 3 servicios por día los cuales muchas veces pueden ser realizados en alpacas receptivas pero que aún no tienen un folículo dominante con un tamaño mínimo de 7 mm y por lo tanto no ovulan y no quedan preñadas desperdiciándose los espermatozoides del eyaculado. Utilizando un eyaculado de alpaca macho se pueden fertilizar in vitro hasta 300 ovocitos recuperados en un día de diferentes alpacas. El éxito de la fecundación in vitro en alpacas que es un camélido doméstico podría aplicarse para la producción de embriones de animales en peligro de extinción como la vicuña y el guanaco, lo que permitiría contribuir al incremento poblacional de ambas especies silvestres que se encuentran en peligro de extinción siendo más crítica la situación del guanaco de los cuales sólo existen alrededor de 4000 animales en todo el Perú. La fisiología reproductiva de la alpaca y la llama es similar a la de la vicuña y el guanaco. Se podría recuperar ovocitos de vicuñas y guanacos hembras sin la necesidad de matarlas y sin poner en riesgo su supervivencia. Los espermatozoides de vicuñas y guanacos macho igualmente se pueden recuperar por electroeyaculación y con estos se pueden fertilizar ovocitos de su misma especie. Los embriones de guanaco y vicuña producidos en el laboratorio por fecundación in vitro pueden ser transferidos a alpacas y llamas receptoras y como son especies domésticas en los primeros meses de vida se puede controlar y cuidar a las crías guanacos y vicuñas de los depredadores y las inclemencias del tiempo para que cuando llegadas a adultas puedan ser liberadas a su medio de vida natural y de esta manera contribuir a la conservación de estas especies amenazadas. Sin embargo es necesario investigar en la optimización de la fecundación in vitro, en las técnicas de recuperación de ovocitos y la mejor forma de sincronizar a las receptoras de embriones. Si en este proyecto de investigación logramos identificar el tiempo óptimo de maduración de ovocitos y el medio adecuado de cultivo de embriones, y producto de ello logramos obtener gestaciones en alpacas con embriones producidos por fecundación in vitro, estos resultados serán de gran aporte para la comunidad científica nacional e internacional representando la originalidad del trabajo y colocando a la Universidad Nacional de Huancavelica como líder en la investigación en biotecnologías reproductivas aplicadas en camélidos sudamericanos. Hasta la fecha no se ha producido ninguna cría ni se ha reportado alguna gestación con la transferencia de embriones producidos por fecundación in vitro en camélidos sudamericanos. En bovinos se han logrado hasta 90 crías al año por vaca donante de ovocitos en países como Japón y Australia en programas de transferencia de embriones producidos por fecundación in 11

11 vitro. El éxito de la transferencia de embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro permitiría tener más de una cría al año de una alpaca hembra sobresaliente en el hato. Si además sabemos que las alpacas hembras tienen la limitante de producir menos de 6 crías durante toda su vida reproductiva, podríamos en el futuro obtener más crías por alpaca hembra donante de ovocitos y de esta manera maximizar el número de crías por alpaca reproductora, y de esta manera contribuir al mejoramiento genético en esta especie. Desde el punto de vista social, obtener mayor número de crías de una alpaca donante de ovocitos, generará mayores ingresos a los productores alpaqueros de Huancavelica y del Perú. Por todos estos motivos se justifica la realización de este trabajo de investigación, en el que se pretende poner a punto la producción de embriones in vitro para luego recuperar ovocitos de hembras vivas de calidad genética superior, fertilizarlos y transferirlos a receptoras sincronizadas adecuadamente y lograr las primeras gestaciones en alpacas con embriones producidos por fecundación in vitro. CAPITULO II: MARCO TEÓRICO 2.1 DELIMITACIONES Del Campo et al., (1994) lograron recuperar 27 COCs por llama, desmenuzando los ovarios con ayuda de una hoja de afeitar descartando 26% de los 1324 COCs recuperados. También se han recuperado COCs de llama (Del Campo et al., 1992; Ratto et al., 1999 y Ratto et al., 2005) y alpaca (Ruiz et al., 2007; Mendoza et al., 2008; Gamarra et al., 2008a; Fernández y Esteban 2009; Ruiz et al., 2009a; Ruiz et al., 2009b; Sacha y Rojas, 2009) puncionando folículos de ovarios recuperados en el camal con ayuda de una jeringa manual. Con esta metodología Del Campo et al., (1992) recuperaron 6,4 ovocitos por llama y Ratto et al., (1999) recuperaron 2,2 COCs/ovario con 95% (308/324) seleccionados como aptos para el cultivo in vitro en medio de maduración. Ruiz et al., (2007), utilizando ovarios procedentes del Camal Municipal de Huancavelica aspiraron folículos con agujas 21g y jeringas estériles de 5cc en el Laboratorio de Biotecnología Reproductiva de la Universidad Nacional de Huancavelica. Recuperaron 2,2 COCs/ovario de llama y 3,5 COCs/ovario de alpaca con 66% y 69% COCs de llama y alpaca respectivamente seleccionados como aptos para la maduración in vitro. Esta fue la metodología de trabajo aplicada por primera vez en el Perú, utilizándose los ovocitos en la producción in vitro de embriones tanto de alpaca como de llama. Se han recuperado COCs vía laparotomía lateral (Miragaya et al., 2002; Sansinema et al., 2007; Conde et al., 2008) en llamas; vía laparotomía ventral en vicuñas (Chaves et al., 2003) y en alpacas (Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007; Gamarra et al., 2008b). Miragaya et al., (2002) aspiraron los folículos ováricos utilizando una aguja 21g conectada a una jeringa manual y obtuvieron 87% y 59% COCs recuperados en hembras superovuladas y no superovuladas respectivamente. La superovulación de hembras donantes permite una mayor presencia de folículos en la superficie ovárica y de esta manera recuperar una mayor cantidad de ovocitos. Con la misma técnica quirúrgica, Sansinema et al., (2007) aspiraron folículos utilizando una aguja 21g conectada a una bomba de vacío. La aspiración se hizo con una presión negativa de mm Hg recuperando 94% de COCs en llamas superovuladas. Asimismo Conde et al., 12

12 (2008), recuperaron 86,5% COCs en llamas superovuladas, los COCs recuperados fueron utilizados para la producción de embriones por fecundación in vitro y por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). En vicuñas superovuladas, Chaves et al., (2003) exteriorizaron los ovarios por laparotomía ventral y puncionaron los folículos con una aguja 21g conectada a una jeringa manual de 10cc logrando recuperar 55,4% COCs. En alpacas superovuladas con FSH, el porcentaje de recuperación de COCs con la misma técnica fue de 82% (Gómez et al., 2002); mientras que en alpacas superovuladas con FSH y ecg, Ratto et al., (2007) recuperaron 89% y 87% para FSH y ecg respectivamente, asimismo los tratamientos de superovulación con FSH o ecg no fueron diferentes con respecto al número de folículos mayores a 6mm presentes al momento de la colección de los COCs. En Perú, Gamarra et al., (2008b) también han evaluado la utilización de laparotomía ventral para la recuperación de COCs en alpacas. Lograron recuperar 7,6 COCs/hembra con 81% COCs de buena calidad cuando utilizaron como tratamiento de sincronización y estimulación ovárica dispositivos intravaginales con 0,78 mg de Progesterona combinada con 1 mg im de estradiol (Día = 0) y 700 UI de ecg al momento del retiro de los dispositivos intravaginales (Día = 7). Asimismo recolectaron 7,0 COCs/alpaca con 79,5% COCs de buena calidad cuando el tratamiento de sincronización y estimulación ovárica se hizo aplicando i.m. 3,1 mg LH (Día = 0) más 700 UI de ecg (Día = 2). Demostrando que sin el uso de un dispositivo vaginal con progesterona se colecta una misma cantidad y calidad de COCs en alpacas. Si bien estos autores en la mayoría de los casos lograron altas tasas de recuperación de COCs, la técnica de laparotomía es invasiva y útil solamente para aplicarla a manera de investigación, ya que limitaría la repetición de las sesiones de recuperación de COCs. Por otro lado, se ha reportado (Sansinema et al., 2003) la aspiración de folículos en ovarios extirpados (ovariectomía) de llamas superovuladas con FSH antes de la cirugía. Se logró recuperar 97% de COCs. Sin embargo esta técnica también es útil sólo para fines de investigación y utilizando hembras de descarte, ya que si se utiliza hembras selectas estas quedarían infértiles definitivamente. También se han recuperado con éxito COCs con procedimientos menos invasivos y que no requieren de una cirugía, utilizando la aspiración folicular transvaginal (Brogliatti et al., 2000; Ratto et al., 2005; Huanca et al., 2006b; Sansinema et al., 2007; Gamarra et al., 2008b, Berland et al., 2011) y la laparoscopia (Ruiz y Correa, 2007). Mediante la aspiración folicular transvaginal guiada por ultrasonografía, Brogliatti et al., (2000) alcanzaron una tasa de colección de COCs de 65% en llamas no estimuladas frente a un 52% en llamas estimuladas hormonalmente para la superovulación. Sin embargo en las llamas superestimuladas se recuperó un mayor número de ovocitos (9,0 vs 3,1) y de mayor diámetro (7,7mm vs 4,5mm). Posteriormente estos resultados han sido mejorados por Ratto et al., (2005) quienes trabajaron con llamas del Centro de Investigación y Producción Quimsachata de la Estación Experimental ILLPA INIA Puno. Lograron recuperar 71% y 74% de COCs con 10,7 ± 2,1 y 11,2 ± 2,3 en llamas superovuladas con FSH y ecg respectivamente. En Argentina, Sansinema et al., (2007) obtuvieron una tasa relativamente menor recuperando 61% de COCs en llamas superovuladas con FSH y los COCs recuperados por esta técnica de aspiración transvaginal fueron de menor calidad a los colectados por laparotomía lateral. En el Perú también se ha utilizado la técnica de aspiración folicular guiada por ultrasonido para recuperar COCs en alpacas. Gamarra et al., 13

13 (2008b) lograron recuperar en promedio 6 COCs/alpaca cuando el tratamiento para la sincronización y superovulación se hizo con 0,78 mg de progesterona + estradiol (Día = 0) y una dosis de 700 UI de ecg al momento del retiro de las esponjas con progesterona (Día = 7) y recuperaron 6,0 COCs en promedio por alpaca y cuando aplicaron otro tratamiento con LH (Día = 0) y ecg (Día = 2) recuperaron 6,1 COCs/alpaca. Los COCs de buena calidad fueron 7,4% y 64,9% con dispositivo intravaginal y sin este respectivamente. Otro grupo de investigación en el Perú, encontraron resultados un tanto diferentes (Huanca et al., 2006b) con un promedio de 4,5 folículos ováricos mayores a 6 mm y una tasa de recuperación de 55,5% COCs en alpacas superovuladas con un tratamiento consistente de 200 mg de FSH dividido en una aplicación dos veces/día por 4 días consecutivos realizándose la aspiración de los folículos el sexto día. Por otro lado Ruiz y Correa (2007) recuperaron COCs de alpaca y llama utilizando un laparoscopio con 30 de ángulo de cámara y con una fuente de luz tipo 488B. Introdujeron 3 trócares a la cavidad abdominal a unos 6-10 cm craneales a la glándula mamaria. El primero 2 cm a la izquierda de la línea media, el segundo sobre la línea media y el tercero 4 a 6 cm a la derecha de la línea media. Por la incisión de la izquierda se introdujo un trócar de 7 mm de diámetro a través del cual pasó el laparoscopio conectado a una fuente de luz fría. Ubicado el ovario, se introdujo por la incisión de la derecha un forceps atraumático con el cual se manipuló y sujetó el ovario. Seguidamente se introdujo por el trócar del centro una aguja conectada a una bomba de vacío con 40 mm de Hg de presión negativa con la que se aspiró el fluido folicular con los COCs. Con esta técnica se recuperaron 57% y 60% de COCs en llamas y alpacas respectivamente sin tratamientos para la superovulación. COCs de llama fueron madurados in vitro (MIV) por primera vez por Del Campo et al., (1992), utilizando un tiempo de 36 horas de maduración en medio TCM-199 suplementado con suero fetal bovino, piruvato de Na, FSH, estradiol y sulfato de gentamicina, obtuvieron 62% de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II. En otro experimento, Del Campo et al., (1994) obtuvieron 30% de ovocitos en metafase II luego de 30 horas de MIV. Distintos protocolos de recuperación de COCs se utilizaron en ambos experimentos lo que podría explicar los diferentes resultados. En el primer caso se aspiraron los folículos ováricos con ayuda de una jeringa manual mientras que en el segundo caso los ovarios fueron seccionados con ayuda de una hoja de afeitar recuperando una población muy heterogénea de ovocitos desde folículos preantrales y antrales en todos los estados de desarrollo (Hyttel et al., 1997). Asimismo, Ratto et al., (1999) utilizando un protocolo similar de MIV mejoraron sustantivamente los resultados anteriores. En este trabajo evaluaron 26, 30 y 36 horas de maduración in vitro de COCs de llama y obtuvieron 58%, 73% y 75% de ovocitos que alcanzaron la metafase II con extrusión del primer corpúsculo polar sin diferencias estadísticas. Por otro lado, Miragaya et al., (2002) utilizaron un tiempo de horas para la maduración de COCs utilizando un medio diferente a los casos anteriores, el cual estaba compuesto por TCM 199 con bicarbonato, 10% de suero fetal bovino y glutamina; obtuvieron 62% y 74% de ovocitos en metafase II en llamas en las cuales se recuperó los COCs sin superovulación y con superovulación respectivamente. En otro estudio, Ratto et al., (2005), utilizando un medio de maduración consistente de TCM-199 suplementado con piruvato de Na 0,2 mm, sulfato de gentamicina 25 µg/ml, FSH 0,5 µg/ml, estradiol 17-β 1µg/ml y suero fetal bovino al 10%, encontraron 77,7%, 80,6% y 80,4% de COCs maduros cuando utilizaron 28, 30 y 36 horas para la MIV de COCs de llama sin diferencias estadísticas entre los 3 tiempos evaluados. Por otro lado, Sansinema et al., (2003) para la MIV 14

14 de COCs de llama introdujeron LH en su protocolo de maduración, así el medio de maduración estuvo compuesto por TCM-199, 5 μg/ml de FSH, 10 μg/ml de LH, 1 mg/ml de estradiol 17b y 10% de suero fetal bovino, y obtuvieron 52% de ovocitos maduros. Posteriormente el mismo grupo de investigación (Sansinema et al., 2007) utilizó un medio diferente para la MIV de ovocitos de llama consistente de TCM-199, 5 μg/ml de FSH, 10 μg/ml de LH, 10 ng/ml de EGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 1μg/ml de estradiol 17b y 10% de suero fetal bovino, mejorando su anterior resultado con 74% de ovocitos en metafase II luego de 30 horas de MIV. También se han madurado con éxito ovocitos de vicuña y alpaca. Chaves et al., (2003), reportaron la única MIV de ovocitos de vicuña. Maduraron utilizando un tiempo de 27 horas en un medio similar al utilizado por Miragaya et al., (2002) consistente de TCM 199 con bicarbonato, 10% de suero fetal bovino y glutamina; obtuvieron 41% de maduración nuclear con extrusión del primer cuerpo polar y la totalidad de los ovocitos presentó maduración citoplasmática finalizado el tiempo de cultivo en el medio de maduración. En alpacas, Gómez et al., (2002) y Ratto et al., (2007) han utilizado 26 horas para la MIV de COCs recuperados por laparotomía ventral. Gómez et al., (2002) obtuvo 46% y 40% de ovocitos en metafase II en alpacas donantes superovuladas con FSH y ecg respectivamente. Ratto et al., (2007) mejoró los resultados obtenidos por Gómez et al., (2002) alcanzando 82% y 64% de ovocitos en metafase II para los mismos tratamientos superovulatorios. Por otro lado, Ruiz y Correa (2007) maduraron ovocitos de alpaca y llama durante 27 y 30 horas respectivamente en un medio compuesto por TCM-199 suplementado con piruvato de Na 0,2 mm, sulfato de gentamicina 50 µg/ml, FSH 0,02 unidades/ml, estradiol 17-β 1µg/ml y suero fetal bovino al 10%. Con este medio obtuvieron tasas de 75% y 100% de ovocitos maduros de llama y alpaca respectivamente. Sin embargo es necesario repetir la experiencia con una mayor cantidad de ovocitos de alpaca para confirmar la alta tasa obtenida de ovocitos en metafase II. Del Campo et al., (1994) separaron epidídimos de testículos de llama macho y obtuvieron espermatozoides por centrifugación en gradiente de Percoll, los cuales fueron utilizados para fecundar ovocitos madurados in vitro logrando por primera vez el desarrollo de embriones producidos por FIV. En este trabajo recolectaron 1324 COCs de 98 ovarios de llamas beneficiadas, permitiéndoles disponer de gran cantidad de ovocitos para realizar diferentes tratamientos para la FIV, fijar ovocitos para evaluar el estado de maduración nuclear y describir el desarrollo embrionario producido después de la FIV. 234 ovocitos inseminados fueron cocultivados con células epiteliales de oviducto de llama (LLOEC) previamente preparadas, 32% dividieron (embriones de 2 células) a las 48 horas de evaluación y a los 9 días de evaluación 15,8% detuvo su desarrollo entre 2-16 células, 5,6% desarrollaron hasta mórula, 6,0% entre blastocistos tempranos y expandidos y 4,7% de blastocistos eclosionados. Conde et al., (2006) utilizaron un sistema similar para FIV en llamas, la diferencia con Del Campo et al., (1994) fue que recuperaron los gametos de animales vivos, ya que es de esta manera en que la producción de embriones por FIV puede contribuir al mejoramiento genético si se logra recuperar gametos de animales de comprobada calidad genética. Los ovocitos se recuperaron por punción folicular de ovarios expuestos por laparotomía lateral en hembras superovuladas y los espermatozoides fueron recuperados por electroeyaculación. El semen fue tratado con colagenasa para reducir su viscosidad. Las tasas de división (formación de cigotos) 15

15 a las 48 horas de la fecundación fueron 56% y 50% con y sin agentes capacitantes (heparina, penicilamina e hipotaurina). En otro trabajo, los mismos autores ) reportaron 40,8% y 42,2% de división a los dos días y 35% y 47% de blastocistos a los 8 días con y sin agentes capacitantes. Demostrando que la colagenasa no afecta la capacidad fecundante del semen y que es posible producir embriones de llama por FIV con semen fresco (Conde et al., 2008). Gómez et al., (2002) fecundaron ovocitos de alpaca con semen epididimario de llamas beneficiadas. Los ovocitos de alpaca fueron recuperados por punción de los folículos ováricos expuestos por laparotomía ventral en hembras superovuladas. Los 5 COCs que fueron fecundados y cultivados in vitro desarrollaron hasta mórula a los 6 días de evaluación, ninguno continuó el desarrollo hasta el estadío de blastocisto. Este sería el primer reporte de la producción de embriones híbridos de alpaca-llama después de una fecundación in vitro heteróloga, experiencia que también fue reportada por Ratto et al., (2007). Sin embargo, Del Campo et al., (1995) indican que recuperaron ovocitos de alpacas superovuladas los cuales fueron fecundados con semen de llama y los embriones producidos desarrollaron hasta el estadío de blastocisto expandido. En Perú, también existen reportes sobre fecundación in vitro en alpacas (Gamarra et al., 2008a; Mendoza et al., 2008). Gamarra et al., (2008a) congelaron espermatozoides epididimarios previamente diluídos en una solución de TRIS-Fructosa con 10% de glicerol. Los pellets conteniendo los espermatozoides fueron descongelados y centrifugados en una gradiente de Percoll y resuspendidos en medio FERT-TALP suplementado con penicilamina, hipotaurina, epinefrina y heparina. Los ovocitos madurados in vitro fueron inseminados con una concentración de 10 x 10 6 espermatozides/gota de 100 ml de FERT-TALP. Obtuvieron 27,1% de segmentación a las 72 horas, a los 5 días 8,0% de mórulas y blastocistos y a los 7 días de cultivo embrionario 3% de blastocistos eclosionados. Por otro lado (Mendoza et al., 2008) compararon los métodos de gradiente de Percoll y Swim up para la recuperación de espermatozoides epididimarios para utilizarlos en la fecundación in vitro de ovocitos de alpaca aspirados de ovarios obtenidos en el camal. Los epidídimos fueron separados de los testículos y ordeñados sobre SPERM-TALP. Posteriormente fueron centrifugados en SPERM-TALP y finalmente sometidos a uno de los dos tratamientos siguientes: centrifugados en una gradiente de Percoll o colocados en la estufa por minutos con una inclinación de 45. Los ovocitos previamente colocados en FERT-TALP fueron inseminados con una concentración final aproximada de x 10 6 espermatozoides/ml. Los resultados que obtuvieron fueron 36,0% y 43,9% de segmentación, y 6,3% y 6,9% de blastocistos para Percoll y Swim up respectivamente, demostrando que es posible utilizar el método de swin up en la FIV de ovocitos de alpacas. En Bolivia, Machicado et al., (2009) recuperaron COCs por laparotomía en llamas superovuladas con ecg, los COCs fueron madurados in vitro en TCM-.199 con Albúmina de suero bovino (BSA). Posteriormente, los ovocitos fueron inseminados con semen fresco tratado con proteasa. Obtuvieron 60% de ovocitos fertilizados. Al sexto día se obtuvo 29,4% de mórulas tempranas con un promedio de 8 blastómeros, 23,8% de mórulas con membrana irregular y 16 blastómeros, 29,4% de blastocistos tempranos provistos de zona pelúcida regular y delgada con 16

16 numerosos blastómeros y 17,4% de blastocistos de forma circular, membrana regular con blastómeros difíciles de contar y sin espacios entre células. En Chile, Berland et al., (2011), recuperaron COCs en llamas superovuladas con ecg y FSH. Los COCs expandidos colectados con ambos tratamientos fueron fecundados in vitro usando espermatozoides epididimarios. Los gametos fueron co-incubados a 38,5 C con 5% CO2 por 18 horas. Después de la FIV, los presuntos cigotos fueron incubados en medio Fluido de oviducto sintético (SOF) suplementado con 0,6% de BSA con células de la granulosa de llama a 39 C, 5% CO2, 5% O2, 90% N2 por 7 días. El porcentaje de presumibles cigotos tratados con FSH y ecg que desarrollaron a 2-8 células en el día 2 (65,3 vs 63,1%), mórulas en el día 5 (46,2 vs 42,5%) y estado de blastocistos en el día 7 (23,1 vs 20,5%) no fue diferente (P>0.05) entre las llamas tratadas con FSH y ecg respectivamente. Concluyendo que los COCs expandidos recuperados con FSH o ecg pueden ser utilizados directamente para la fecundación in vitro. 2.2 BASES TEÓRICAS Y CONCEPTUALES Distintas metodologías se han evaluado para la recuperación de COCs (Complejos ovocitocúmulo) en camélidos sudamericanos. Ovarios de alpacas y llamas obtenidos de hembras beneficiadas en el camal son una fuente adecuada para la recuperación de COCs, facilitando gran disponibilidad de ovocitos para la investigación en la estandarización de protocolos de maduración y/o fecundación in vitro; y para su utilización como receptores de núcleo de células donadoras en un programa de clonación por transferencia nuclear (Ruiz, 2011). Se ha investigado en el uso de técnicas para la recuperación de COCs en hembras vivas en camélidos sudamericanos. Estas técnicas se presentan como una excelente alternativa para la producción in vitro de embriones ya que permiten disponer de una buena cantidad de COCs/hembra. La fecundación exitosa de estos COCs permitiría obtener más crías/año de la misma donante al transferir los embriones producidos in vitro en receptoras sincronizadas, y así superar el límite fisiológico de una cría/año en las hembras de estas especies (Ruiz, 2011). Los COCs recuperados requieren de un proceso de maduración artificial en el laboratorio antes de utilizarlos en la producción in vitro de embriones. La maduración in vitro simula el tiempo transcurrido y sobretodo los procesos metabólicos que en forma natural ocurren en el ovocito contenido en el folículo dominante, entre el pico preovulatorio de LH hasta que se produce la ovulación. En este proceso se reactiva la división meiótica desde el diploteno de la profase I de la primera división hasta alcanzar la metafase II de la segunda división meiótica, momento en que el ovocito ovula en forma natural. El ovocito se mantiene en este estado hasta que es fecundado por un espermatozoide o activado artificialmente para producir embriones por partenogénesis, por ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides), por clonación o por transgénesis. Para la MIV de ovocitos, se utilizan medios de cultivo clasificados por Gordon (1994) en medios simples y medios complejos. Un medio simple es aquel que contiene una solución salina fisiológica bufferada usualmente con bicarbonato y adicionada de piruvato, lactato y glucosa. Un medio de maduración complejo contiene, además de los constituyentes de un medio simple, aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias encontradas asociadas al suero. En bovinos el medio tradicional y exitosamente usado es el Tissue Culture Medium 199 (TCM 199), medio complejo, compuesto por sales Earle`s con HEPES y bicarbonato, como 17

17 estabilizadores de ph y suplementado con piruvato, lactato, vitaminas, aminoácidos, purinas y proteína como suero fetal bovino o albúmina sérica bovina (Rath, 2001). En camélidos sudamericanos se ha utilizado principalmente medios de maduración similares a los utilizados en bovinos. In vivo, la maduración de COCs de alpaca y llama se ha estimado calculando el tiempo que transcurre desde la cópula hasta la ovulación. Así, en alpacas el tiempo mínimo de ovulación fue estimado 26 horas después de la monta natural y 24 horas después del tratamiento con hcg (San Martín et al., 1968). En llamas, usando la técnica de ultrasonografía la ovulación fue detectada en promedio 2 días después de la monta (Adams et al., 1989, 1990). Muy pocos estudios han sido conducidos sobre la maduración in vitro de ovocitos (Del Campo et al., 1992, 1994; Sansinema et al., 2003, 2007; Miragaya et al., 2002; Chaves et al., 2003; Ratto et al., 1999, 2005, 2007; Ruiz y Correa 2007) en camélidos sudamericanos. La FIV es el procedimiento por medio del cual los ovocitos maduros son cultivados junto con espermatozoides y de esta forma fecundados, para esto los espermatozoides deben ser sometidos previamente a un proceso de preparación in vitro con el objetivo de iniciar su capacitación y desencadenar la reacción acrosómica (Palma, 2001). La utilización de la fecundación in vitro en camélidos sudamericanos podría ser una alternativa para el mejoramiento genético de camélidos domésticos y para la preservación de los camélidos silvestres. Sin embargo existen pocos reportes de FIV en estas especies: Del Campo et al., (1994); Del Campo et al., (1995); Gómez et al., (2002); Conde et al., (2006); Ratto et al., (2007); Conde et al., (2008), Gamarra et al., (2008a), Mendoza et al., (2008), Machicado et al., (2009) y Berland et al., (2011); y hasta la fecha no se han logrado preñeces con la aplicación de esta técnica. 2.3 HIPÓTESIS HIPÓTESIS GENERAL Si logramos optimizar la técnica de fecundación in vitro entonces luego de transferir los embriones en alpacas sincronizadas lograrán producir gestaciones que permitirán contribuir a la conservación del material genético de las mejores alpacas de los productores de la Comunidad de Carhuancho en Pilpichaca Huancavelica HIPÓTESIS ESPECÍFICAS EXPERIMENTO 1: Optimizando el tiempo de maduración de ovocitos de alpaca. Si logramos encontrar el tiempo óptimo para la maduración in vitro de ovocitos de alpaca entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo embrionario. No existen diferencias significativas entre los estados de maduración nuclear de ovocitos de alpaca madurados in vitro. No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en diferentes tiempos de maduración de ovocitos. 18

18 EXPERIMENTO 2: Optimizando el medio de cultivo de embriones Si logramos identificar el medio adecuado para el cultivo de embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo embrionario. Si logramos identificar el agente adecuado para la capacitación de espermatozoides de alpaca para la producción de embriones por FIV entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo embrionario. Si logramos encontrar el tipo celular adecuado para co-cultivo con embriones de alpaca producidos por FIV entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo embrionario. No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en las diferentes condiciones de cultivo. EXPERIMENTO 3: Evaluación del método de recuperación de ovocitos Si logramos identificar la mejor técnica para la recuperación de COCs en alpacas donantes superovuladas entonces se lograrán recuperar mayor número de COCs por hembra donante para la FIV. Si logramos encontrar el método adecuado de superovulación de las hembras donantes de ovocitos entonces se logrará recuperar mayor número de COCs por hembra donante para la FIV. Si logramos encontrar el método adecuado de sincronización de las hembras receptoras de embriones de alpaca entonces se logrará mejores tasas de preñez. No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en los diferentes métodos de recuperación de COCs y en los diferentes métodos de superovulación de la hembras donantes de COCs. 2.4 DEFINICIÓN DE TÉRMINOS Ovocitos: Los ovocitos u óvulos son las células sexuales femeninas y se localizan dentro de los ovarios, en unos folículos de aproximadamente 2 cm. de diámetro en la hembra. Maduración in vitro: La maduración del ovocito ocurre dentro del folículo, artificialmente se utilizan hormonas, Piruvato de Na, antibióticos diluídos en un medio de cultivo de tejidos (TCM) y se coloca en una estufa de CO2 a 38,5 ºC por un tiempo determinado de acuerdo a la especie. En este proceso se produce la reactivación de la división meiótica hasta alcanzar la metafase de la segunda división meiótica, momento en que el ovocito, retorna al arresto meiótico, hasta que sea fecundado o activado artificialmente para producir embriones partenogenéticos. Segmentación: División de la célula embrionaria en dos blastomeras, formándose el cigoto. Mórula: Etapa temprana del embrión, que durante el período de segmentación tiene el aspecto de una mora, las blastómeras son difíciles de discernir una de otra, la masa de células (embrión) ocupa casi todo el espacio perivitelino dentro de la zona pelúcida, edad estimada 2 días. 19

19 Blastocisto: Embrión en estadío avanzado compuesto por las células que darán forma al feto. Etapa del embrión en la cual presenta diferenciación clara entre el trofoblasto externo y el MCI. El embrión tiene apariencia de anillo y ocupa el 90 % del espacio dentro de la zona pelúcida, edad estimada 5 días. CR1aa: Es un medio definido de composición química simple, que se utiliza durante el cultivo de los embriones, su patente pertenece al laboratorio Infigen de los Estados Unidos de América. CR2: Medio de cultivo de embriones medio. CZB: Medio de cultivo de embriones preparado de acuerdo a la fórmula de Chatot-Ziomek- Bavister. FIV: Fecundación in vitro. FIV-TALP: Es un medio que se utiliza durante la preparación de los ovocitos y espermatozoides, para la fertilización in vitro. HAM F-10: Nutriente para el cultivo de embriones. Es una mezcla de sales enriquecida con aminoácidos, vitaminas y otros componentes esenciales para el crecimiento celular. HEPES: Es un reactivo que se utiliza para regular el ph de los medios de cultivo de embriones. Su fórmula química es N-(2-hidroxietil) piperazina - N -2- ácido etanolsulfónico. HEPES-TALP: Medio utilizado para el lavado de ovocitos y embriones. KSOM: Es un medio definido de composición química compleja, se utiliza durante el cultivo de los embriones. Menezo B: Combinación definida de aminoácidos, además de utilizar albúmina sérica como fuente de macromoléculas. Fue preparado por primera vez por Menezo en 1984 de allí su nombre. MIV: Maduración in vitro. PHE: Penicilamina-Hipotaurina-Epinefrina. Es una mezcla estimulante de la motilidad espermática. SP TALP: Se utiliza durante la purificación del semen. TALP: Medio Tyrode s Albúmina-Lactato-Piruvato. Es un medio que sirve para preparar las soluciones: Sp -TALP, FIV -TALP y HEPES TALP. TCM-199: Las siglas significan tissue culture medium. Es un medio que se utiliza para la maduración de ovocitos. Satisface las necesidades de las células durante prolongados periodos de cultivo. SOF: Las siglas significan Sinthetic oviduct fluid. Es un medio para el cultivo de embriones después del proceso de fecundación in vitro. SOF-IVC: Fluido de oviducto sintético para el cultivo in vitro. USU: Medio de cultivo de embriones. 2.5 IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES VARIABLES INDEPENDIENTES: Experimento 1: - Tiempo de maduración de ovocitos. Experimento 2: - Medio de cultivo de embriones. - Tipo de agente para la capacitación espermática. - Tipo de células usadas para el co-cultivo. Experimento 3: - Método de recuperación de ovocitos. -Tratamiento de superovulación de las donantes. 20

20 -Tratamiento de sincronización de las receptoras VARIABLES DEPENDIENTES: Experimento 1: - Estados de maduración nuclear de los ovocitos. -Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos. Experimento 2: -Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos de ovocitos de alpaca fecundados in vitro. Experimento 3: -Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos de ovocitos de alpaca fecundados in vitro. - Tasas de presentación de ovulación, número de folículos, tamaño de folículos, de hembras receptivas y de preñez de alpacas receptoras de embriones. INDICADORES De las variables independientes: Experimento 1 a ovocitos madurados in vitro a diferentes tiempos. Los ovocitos serán recuperados de ovarios de hembras beneficiadas en el camal. Experimento 2 a. 600 embriones cultivados en diferentes medios de cultivo. Los gametos para producir los embriones in vitro serán recuperados de testículos y ovocitos de alpacas beneficiadas en el camal. b. 500 ovocitos fertilizados con espermatozoides tratados con diferentes agentes capacitantes.. Los gametos para producir los embriones in vitro serán recuperados de testículos y ovocitos de alpacas beneficiadas en el camal. c. 400 embriones cultivados con diferentes células para el co-cultivo. Los gametos para producir los embriones in vitro serán recuperados de testículos y ovocitos de alpacas beneficiadas en el camal. Experimento 3 a. 400 ovocitos aspirados de alpacas superovuladas. Alpacas con peso vivo promedio de 45 kilos y de buena condición corporal. b. 20 hembras donantes superovuladas. Alpacas con peso vivo promedio de 45 kilos y de buena condición corporal. c. 45 hembras receptoras sincronizadas. Para transferirles los embriones producidos con los gametos aspirados en la sección a y b. Alpacas con peso vivo promedio de 45 kilos y de buena condición corporal. De las variables dependientes: Experimento 1 a. 200 ovocitos en vesícula germinal, 200 ovocitos en vesicula germinal rota, 200 ovocitos en metafase I y 200 ovocitos en metafase II. b. 70% de segmentación, 50% de mórulas y 25% de blastocistos. Experimento 2 21