SITUACION DE la AFTOSA. EINJ LA ARGENTllNA TECNICAS DE DIAGNOSTICO ANAMARIA SADIR*

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1 SITUACION DE la AFTOSA EINJ LA ARGENTllNA TECNICAS DE DIAGNOSTICO ANAMARIA SADIR* E n los últimos años hemos tenido varias epidemias ligadas a las enfermedades que figuran en la "lista A de EPIZOOTIAS", entre ellas la fiebre añosa, la peste porcina clásica, y la fiebre aviar Esta situación llevó a la necesidad de desarrollar y aplicar técnicas de diagnóstico cada vez más rápidas, más sensibles, más económicas y eficientes. Numerosos centros de investigación se han abocado a esta tarea a fin de poseer una herramienta de prevención, que nos permita una reacción precoz y una respuesta adecuada ante la aparición de estas enfermedades. Vale destacar que en la tiltima epidemia que tuvo lugar en Inglaterra, los costos directos e indirectos llegaron a 14 mil millones de euros, a esto se sumó, la contaminación ambiental producida por la eliminación de miles de animales sacrificados, más el malestar ptiblico ligado al bienestar de los animales. Todo nos crea un escenario donde es necesario que la ciencia aporte todos sus esfiierzos,46

2 POR UN CAMPO SANO COMO ESTAMOS EN SANIDAD AGROPECUARIA? AG para lograr sacrificar la menor cantidad de animales sanos en los brotes de las enfermedades. La falta de diagnóstico y la falta de rapidez significó matanzas de animales sanos. si la vacuna tiene un virus distinto del que se presenta, no tiene protección contra ese subtipo y el animal, sufre la enfennedad. En el fondo esto nos dice que un país siempre va a tener un virus exótico de aftosa que produce la enfermedad. TECNICAS DE DIAGNOSTICO Se ha secuenciado el genoma del virus de la aftosa. de manera que los científicos del mundo Nuestro país se encuentra dentro de un nivel bastante avanzado con respecto a este tema. Y luego les mostraré cómo nos manejamos en el último brote del Las lesiones que produce este \ irus se localizan en boca, pezuña, lengua, ubre y afecta a vacas, ovejas, cerdos, búfalos y algunas especies salvajes. S CIENTIFICOS DEL MUNDO SABEN QDE PARTE DEL GENO MA CODIFICA PARA LAS PRO TEINAS ESTRUCTURALES. La enfennedad es producida por un virus muy pequeño de aproximadamente 23 a 30 nanómetros de diámetro, es simple, es muy conocido y fácil de trabajar con él, pero tiene comportamientos que le permiten sobrevivir y causar daño. Pertenece a la familia de las Picomavihdae. es su tremenda variabilidad; tenemos 7 serotipos de virus aftoso y más de 700 subtipos. Esto lleva a que poder controlar la enfermedad significa tener un alerta epidemiológico constante. Porque saben que parte del genoma codifica para las proteínas estructurales. Y que parte del virus codifica para las proteínas no estructurales. Por qué es importante tener este conocimiento? Porque sí empleamos una vacuna con virus CUADRO 1. Métodos de diagnóstico actualmente en uso V Brote Detección de virus V Seguimiento Epidemiológico Detección de los individuos que pudieran tener algún contacto con el brote 'Regiones con vacunación * Regiones sin vacunación V Determinar la ausencia de infección 471

3 Estimación cualitativa de las propiedades de los métodos empleados para detectar Virus de la Fiebre Aftosa (o sus componentes) Método Sensibilidad Especificidac Capacidad Automatización inmuno ensayo ELISA Costo RcproduC" tividad Rapidez Resultados Necesidad Bioseg. Nivel Complejidad Usuario MEDIA MEDIA ALTA BAJO ALTA MEDIO SI MEDIA AISLAMIENTO VIRAL (Cultivol ALTA ALTA NO ALTO MEDIA BAJA SI ALTA DETECCION ACIDO NUCLEICO (RT-PCRl ALTA ALTA MEDIA MEDIO BAJA MEDIA NO ALTA CUADRO 2. inactivado, tendremos anticuerpos en el animal contra las proteínas estructurales, pero no contra las proteínas no estructurales. Esto da lugar a que tengamos un método de METODOS DE DIAGNOSTICO El método de diagnóstico a emplear depende de varias cosas (Cuadro 1): Si estoy en medio de un brote o si quiero determinar la ausencia de infección, para decidir sí un país es libre o no de la enfermedad. ge EMPLEAN UNA BATERIA DE TECNICAS QUE NOS PERMITA CONOCER SI EL VIRUS ESTA PRESENTE. También debemos tener en cuenta si la región donde haremos la evaluación es una región donde se vacuna en forma continua, o no se vacuna. En general no hay una técnica más usada, se emplean una bateria de las mismas, que nos permite conocer si está o no el virus. diferenciación entre animales vacunados de infectados, esto es fundamental tanto para Argentina como para Latinoamérica donde se practica la vacunación sistemática. Se podría usar una vacuna marcadora? Hay posibilidades para el fumro, pero todos los países se han centrado en tener las mejores técnicas, las más baratas, rápidas y sensibles para determinar si un individuo está vacunado o infectado. En el Cuadro 2, se presentan las metodologías para detectar el virus de la fiebre aftosa que nos muestra la Organización Internacional de Epizootias (OIE): La técnica que más se utilizaba es la del aislamiento viral, se sigue usando, es de alta sensibilidad y alta especificidad, no tiene capacidad de automatización (no es fácil producir un alto número de muestras), es caro. La reproductívidad es media, la rapidez de los resultados es baja (pasan de 3 a 4 días), a veces hay que hacer nuevos muéstreos; es lento 48

4 POR UN CAMPO SANO COMO ESTAMOS EN SAMIUAD AGROPECUARIA? AGK y necesita bioseguridad, además es compleja su implementación. La técnica que mejor acompañaría en la situación antes planteada es una ELISA EN FASE SÓLIDA, se pueden usar anticuerpos monoclonales, como policlonales. Y dado el conocimiento del genoma viral que tenemos, se usa mucho la técnica de detenninación de la presencia del virus a través del método RT - PCR, que es una técnica que permite la detección del genoma del virus. Esto es muy importante porque la muestra puede estar muy deteríorada, pero mientras quede genoma viral, puede detectarse la enfermedad. El RT - PCR, es un método de sensibilidad alta, especificidad alta, no se lo puede automatizar fácilmente, un costo medio, reproductividad baja, los laboratorios deben tener mucho cuidado que no se contamine con otro ácido nucleico. Es ñindamental conservar buenas prácticas de laboratorio para emplear este método. Los resultados se obüenen con una rapidez media, no necesita biosegurídad, (se puede realizar en cualquier lugar del país), y su nivel de complejidad es alto. El Elisa tiene una sensibilidad y especificidad media, tiene una capacidad de automatización alta, es barato, es de alta reproductividad, los resultados tienden a ser rápidos, existe la necesidad de bioseguridad y su complejidad es de tipo medio. ^^^tlmtras QUEDE GENOlVIA VIRAL, PUEDE SER DETECTADA LA ENFERIVIEDAD CON EL METODO: RT-PCR ^ Cuando el brote ya pasó (sabemos que estuvo pero queremos determinar si hay anticuerpos o no contra la enfermedad), entonces (Cuadro 3) podemos emplear; La técnica tradicional de SERONEUTRALI- ZACION. que sigue siendo útil. Tiene una sensibilidad y especificidad relativa media, es complicada su automatización, de alto costo y reproductividad baja. También en obtención de resultados es baja, necesita bioseguridad \ posee una complejidad alta. CUADRO 3. Estimación cualitativa de las propiedades de los métodos empleados para la detección de anticuerpos estructurales contra el VFA (o sus componentes) Método Costo Sensibilidad Especificidao Capacidad Relativa Relativa de Automatización Reproductividad Veloc.Obt. Result. Necesidad debioseg. Complejidad para Usuarios ELISA MEDIA MEDIA ALTA BAJO MEDIA ALTA NO MEDIA Seroneutralización MEDIA MEDIA NO ALTO BAJA BAJA SI ALTA Strip Test N 0 D i s p o n ble 49

5 En cambio el ELISA EN FASE LÍQUIDA, tiene una sensibihdad relativa y especificidad relativa media, (el CEVAN, Centro de Virología Aiümal, instímto perteneciente al CONICET, aportó muchísimo al desarrollo de esta metodología). Su capacidad de automatización es altísima, tiene bajo costo, reproductívidad media a alta, es rápido para la obtención de resultados y no necesita bioseguridad. La complejidad es media. NECESARIO TENER TEC NICAS CON ALTA SENSIBILI DAD Y ALTA ESPECIFICIDAD. No es fácil validar una técnica y este es un problema que está presente en todo el mundo. ^ Cuando se necesita realizar la detección de anticuerpos contra proteínas no estructurales para diferenciar animales vacunados de infectados es más complicado. En un trabajo publicado donde se comparan tres ELISA, nombrados A, B y C (porque son Elisas comerciales), desarrollados en diferentes lugares geográficos, se muestra que existen distintos grados de sensibilidad entre los tres, que van desde un 38% al 84% y al 64%. Esto es importante, porque los grados de especificidad también varían (Cuadro 4). El tema no es simple, aquellos animales que son negativos porque nunca tuvieron contacto con el virus de la aftosa, no ofrecen problemas; pero aquellos que fiieron vacunados reiteradas veces, cuando se produce el virus para formular esas vacunas (que no poseen las proteínas estructurales), las mismas contienen también estas proteínas no estructurales. Lo ideal para estos casos seria emplear un STRIP TEST. Hay desarrollos hechos, pero no se han validado adecuadamente por lo que no se emplea en forma masiva. Las proteínas de hoy en día concentran el antígeno, pero al hacerlo, también concentran las proteínas no estructurales que quedan dando vueltas en el medio. Entonces se trata de purífi- CUADRO 4. Sensitivity and specificity of the three NS ELlSAs ELISA A ELISA B ELISA C Positive /no. Sensitivity Positive /no. Sensitivity Positive /no. Sensitivity Tested tested Tested 6-21 days after infection daysaftef infection > IBO flays after infection 84/ (32.3-4S.1) 53/63 84,1 (73,3 ^ / (51, /218 S6-0[49,3-62.4) 62/ (91,5-39.7) 51/51 100( ) S7/2ia 54/63 36/51 26,2 (20,8-32.4) 85,7 (75,0-92,3) 70.6 (57,0-81.3] ELISA A ELISA B ELISA C Negative /no. Sensitivity Negative /no. Sensitivity Negative /no. Sensitivity Tested tested Tested Sera of non-vaccinated cattle 35/96 99,0 (94,3-99.8) 43/ ( ,8) 94/ (92,7-99.4) Sera of vaccinated caltle Overall 163/165 9B,8(9S,7-99,71 258/261 98,9 ( ,6) 112/ ( ,5) 15S/ (53, / / (97,7-100,0) 99,2 (97,3-99.8) Sensitivity was determinated using sera from cattle experimentaly infected with FMDV; specificity was determinated using sera from non -vaccinated cattle. Sensitivity and specificity are represented as percentages. 95o/o confidence intervals are between brackets P. ivtoonenet al./ Veterinary Microfaioiogy 99 {2004)

6 POR UN CAMPO SANO COMO ESTAMOS EN SANIDAD AGROPECUARIA? AG Percentage of genomic differences between South American strains AArg2000 AArg2001 A Arg A Arg A ARG A BRA A ARG A ARG A RlVD A ARG AURU ARIVDV A BRA A PAR A PAR A CORDOBA A Arg A URU 79 10,33 A CORDOBA A ARG A B0t A24CRUZEIR A cot 97 - B A BRA A 24CRUZEIR A cot 97 - B A COL A ARG A 8RA A32VENEZ A ARG A B0L CUADRO 5. car al máximo la elaboración de vacunas para que no se generen anticuerpos contra estas proteínas no estructurales, que darían lugar a un falso positivo por falta de purificación del antígeno. Es necesario tener las técnicas que conjuguen alta sensibilidad con alta especificidad, de modo que. no solamente sea buena la calidad de las técnicas, sino que también puedan emplearse para anímales con distinto número de vacunas. Cuando un animal se vacunó y estuvo cerca de animales enfermos pero no sufrió la enfermedad, puede suceder que halla tenido la enfermedad en forma subclínica. de la comparación de distintos métodos para determinar sí un animal es negativo, pero lo que ocurre es que por lo general, se presentan diferencias entre métodos cuando trabajamos con animales vacunados y negativos, pero la gran diferencia se encuentra cuando queremos saber sí un animal es "carrier" o no. A nivel mundial se seguirá trabajando, tratando de validar estas técnicas. La CIE no posee aún su "Golden Test", están esperando que surja, a través de todas estas Todas estas evaluaciones hay que realizarlas con estos métodos. Los test Elisa son diferentes entre si. según la empresa que los elabora, debido a que algunos emplean como antígenos a péptídos sintéticos, otros expresan las proteínas no estructurales en una bacteria, etc.. ^ ^ S TECNICAS DE CARACTERI ZACION NOS PERMITEN TENER LAS VACUNAS ADECUADAS. En el INTA se desarrolló un método a partir 51,

7 Mumber of FMDV outbreaks, virus types and vaccine strains used in Argentina between theyears 2000 and 2002 step Year Virus strain N of outbreal<s Vaccine strains* Emergency Step (July -December) 01 9 A Arg /OO c -A24 ~ C3 [ndaial and 01 c -A24 Emergency Step 2 (December -March) 2000/2001 A Arg /OO c -A24 - A Arg /OO National Campaign 1 (March - July) 2001 A Arg /Ol c An - A Arg /OO National Campaign 2 (August -December) 2001 A Arg /Ol c -A24 -AArg/00 -AArg/Ol National Campaign 3 (February -June) 2002 A Arg /Ol 1 01 c -A24 -AArg/OO -AArg/Ol National Campaign 4 (September - December c -A24 -AArg/00 -AArg/01 CUADRO 6. validaciones que se están realizando. ra una notable reducción de esos periodos. Gracias al amplio conocimiento del virus de la aftosa, hemos introducido técnicas de caracterización que nos permitan contar con las vacunas adecuadas en fonna más rápida. En la década del '80 reconocer una variante que estaba produciendo una ruptura de inmuni- ^"^^ORAESOS PERIODOS SE REDUJERON NOTABLEMENTE. En un árbol filogenético, donde ponemos todo el parentesco del virus aftósico, figura el virus A que se presentó en nuestro país hace poco tiempo. Los estudios realizados en Argentina en el LNTA sobre un pedazo de genoma del virus (que se convierte en la proteína de la cápside), llevaron a los investigadores a la conclusión de que el A 24 Cruzeiro que estaba en el banco de vacunas con respecto al A Argentina 2000 tenía una diferencia del 17% y comparando el A 24 Cruzeiro con el A Argentina 2001, la diferencia era del 15,96% (Cuadro 5). Esto fue un llamado de atención y el SENA- SA rápidamente jimto con la empresa productora de la vacuna, realizó las pruebas virales en bovinos vacunados con la A 24 que estaba en el banco y con el A Argentina 2001 que estaba en el campo. dad y ponerla en ima vacuna llevaba mucho tiempo. Las nuevas metodologías nos penniten aho- Esta vacuna confería una protección de sólo el 30%, entonces se llegó a concluir que se realí-

8 POR UN CAMPO SANO / COMO ESTAMOS EN SANIDAD AGROPECUARIA? AGlQ Reactivity of the new F1VIDV isolates with a panel of IVIabs generated to serotype A regional reference strains A Argentma/79 A Argenijna/87 I i = 3 0 p! p S p? M '? M P MAbs A Arg GraL Villegas (38796) A Arg 2001 T. Lauguen {MC267) P? S P? ^? = - f S I P? P 8 = MAbs CUADRO 7. zara la adaptación a este nuevo virus, con lo que luego se logró un 80% de efectividad. En poco tiempo hemos bajado de brotes a cero (Cuadro 6). CONCLUSION Como conclusión quisiera destacar que, la rápida caracterización de las cepas de campo y su rápida introducción en la cepas de vacunas. permitió el control de un virus altamente patógeno como ocurrió en A Argentina 2001 y esto sucedió en un tiempo menor a los 9 meses. Un trabajo realizado por el CONICET, a través del CEVAN, donde se logró determinar el virus A Argentina 2000 y el virus A Argentina 2001, causantes de los últimos brotes se encontró (Cuadro 7) que estaban bastante alejados en su reactividad a lo que era el virus A 24 Cruzeiro que estaba en el banco de vacunas. *ANA MAKIA SAUIR Licenciada en Bioquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional de Tucumán (UNT). Es doctora en diclia universidad y Directora int. Del Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, 1NTA - Castelar Miembro de la Can-era de Investigador del CONICET. Primer Premio, medalla de oro y diploma. V11 Seminario de Remonta y Veterinaria Bs. As. Noviembre de Premio Bernardo Houssay. Es responsable de la fonnación en Becas de Iniciación, Perfeccionamiento y Postdoctorales. Contacto: dítcicv@cicv.inta.gov.ar 53