METODOLOGÍA. Número más probable (NMP).

Transcripción

1 COMPARACION DE DOS METODOS DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) CON LA CUENTA VIABLE EN PLACA (CVP) Y EVALUACION DE LA CALIDAD DEL AGUA DE LA CIUDAD DE SALTILLO, COAHUILA. Chacón Garza, Luis Ervey Villarreal Sánchez, Juan Antonio Villarreal López, José Luis* Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la UA de C Tel. (844) y Fax CP Saltillo, Coahuila. ABSTRACT El agua en la actualidad es un recurso vital que escasea de manera constante en las ciudades, por lo que es muy importante preservarla y mantenerla libre de microorganismos que sean nocivos para la salud. En las regiones densamente pobladas los pozos artesianos se consideran como inseguros para proveer de agua potable, dado las posibles infiltraciones provenientes de letrinas, fosas sépticas y tuberías con fugas. Dado la relevancia de estos hechos los estudios bacteriológicos del agua han cobrado importancia en la evaluación de la calidad de la misma el presente trabajo se realizo en la ciudad de Saltillo Coahuila con el fin de comparar variantes de dos métodos de Número Más Probable (NMP) con la Cuenta Viable en Placa (CVP) y evaluar la calidad de el agua de la ciudad, así mismo se realizaron pruebas especiales para la determinación de microorganismos patógenos en este vital recurso. OBJETIVOS. Valorar los métodos de cuantificación de Número Mas Probable con el empleo de muestras de aguas claras y de arroyos de la ciudad de ciudad de Saltillo. Evaluar el grado de contaminación bacteriana de cada una de las muestras de agua. Comparar el métodos de Número Mas Probable con el de Cuenta Viable en Placa. Determinar la calidad bacteriológicas de las muestras de agua de la red.

2 INTRODUCCION. Desde sus mismos orígenes, las corrientes de agua han unido su curso a la vida del hombre, ya que este líquido fresco y agradable que apagaba su sed y que provenía de ríos y manantiales le sirvió también para proveerle alimentos, mas tarde con el descubrimiento de la agricultura, le fue vital para dar origen a los primeros asentamientos fijos. Hoy en día se sabe que el agua no es solamente una sustancia indispensable para la bebida, la higiene y la limpieza, sino que es el constitutivo fundamental de los seres vivos. No puede faltar en el protoplasma celular; la aparición de la vida misma en nuestro planeta esta ligada a la existencia del agua, ya que en su seno aparecieron las primeras formas de vida que después evolucionaron y conquistaron la tierra firme y el aire (2). Ninguna clase de agua ofrece absolutas garantías de higiene, ya que a mayor o menor el agua se contamina con facilidad extraordinaria por muchas precauciones que se tomen (2). En las regiones densamente pobladas los pozos artesianos se consideran como inseguros para proveer agua potable, dado las posibles infiltraciones provenientes de letrinas, fosas sépticas y tuberías con fugas (5, 6). En la actualidad el agua es de vital importancia para la economía humana, pues se emplea como bebida, disolvente y como elemento de limpieza, por lo que es necesario preservarla y mantenerla en el mejor estado posible, libre de microorganismos que sean nocivos para la salud de las personas y es por ello que se pretenden perfeccionar los métodos o técnicas de conteo de microorganismos en este importante recurso natural (7). En el presente trabajo se evaluó la calidad de el agua de Saltillo, Coahuila, una ciudad en el semidesierto del noreste de la Republica Mexicana, en la cual escasea con el paso de los años, por lo que es muy importante como ya se menciono cuidarla y mantenerla libre de microorganismos patógenos al ser humano. Existen diversos métodos o técnicas para el recuento de microorganismos de acuerdo a los diferentes tipos de muestras, las cuales pueden dividirse en dos grandes grupos que son: métodos directos y métodos indirectos.

3 Los métodos directos son aquellos que usan conteos al microscopio, pero tienen la desventaja de que realizan el recuento tanto de microorganismos viables como no viables por lo que son conocidos como recuento total de microorganismos. En el presente trabajo no nos enfocamos a estos métodos. Por otro lado tenemos los métodos indirectos entre los que se encuentra el recuento de células viables en placa o simplemente Cuenta Viable en Placa (CVP) la cual puede realizarse por vaciado en placa o bien por extensión. Tenemos también entre algunos otros el Número Mas Probable (NMP) y es a este método al que nos enfocaremos en el presente trabajo, debido a que es un método sencillo que puede aplicarse en múltiples tipos de productos y sus resultados tienen una amplia aproximación. Pareciera lógico que la prueba para determinar la pureza del agua sea la de examinar el tipo de bacterias que contenga. esto ha sido llamado búsqueda directa de patógenos. En la práctica, esto ha sido muy problemático ya que es difícil detectar la presencia de Salmonella typhi y otros organismos causales de las enfermedades entéricas. Existen varias razones que hacen pesada esta tarea. (1) Los mejores métodos que se conocen hasta la fecha son demasiado lentos, tediosos y antieconómicos para usarse en análisis rutinario de aguas (2) Por lo general existen muchos mas individuos inocuos que patógeno, lo cual interfiere con los resultado. (3) por medio de los mejores métodos disponibles en la actualidad los patógenos se minimizan, por lo que se requiere incrementarlos en cantidad para poder ser detectados (5, 6). Bajo el aspecto bacteriológico, la elección de gérmenes indicadores de contaminación, esencial para la interpretación de la calidad de las aguas objeto de examen, ha sido y es motivo de debate bajo la luz que proporcionan las nuevas técnicas analíticas, los medios de cultivo mas selectivos y el mejor conocimiento epidemiológico, que permiten conceder a cada indicador bacteriano el crédito de confianza que real y verdaderamente merece (1).

4 Según Buttiaux (1966), en el aspecto práctico de la bacteriología se han venido llamando coliformes a un conjunto de generos de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Eterobacter) que ofrecen los siguientes caracteres generales: bacilos gram negativos, móviles o inmóviles, que fermentan la glucosa generalmente con producción de gas, y hacen fermentar la lactosa, con frecuencia rápidamente. Se distinguen estos géneros entre si por las pruebas de Indol, rojo de Metilo, Vogues Proskahuer (IMViC) (1). METODOLOGÍA La ciudad se dividió en 20 zonas, de las cuales se tomaron 2 muestras de cada una. Se escogieron como sitios de muestreo en diversos planteles educativos de nivel básico del sector público. Las muestras se tomaron de aljibes, tinacos y directamente de la red. Además se tomaron muestras de ojos de agua y arroyos de diversos puntos de la ciudad para utilizarlas como controles positivos. Se utilizaron simultáneamente dos métodos de NMP con series de 3 y 5 tubos respectivamente y se uso también CVP. Además se inocularon tubos con Caldo Tripticaseína de Soya (CTS) los cuales se incubaron a 37 C 24 h y se pasaron amedios selectivos como EMB, S110, SB, SS y Agar Cetrimida para la búsqueda de microorganismos como Salmonella, Shigella, S. Aureus, E. Coli y Pseudomonas, identificándose las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas. Número más probable (NMP). Este número es calculado a partir de la observación del crecimiento, tanto con la aparición de turbidez como con la formación de gas, en cultivos en caldo duplicados, inoculados con porciones de un ml de diluciones decimales de la muestra. Las cifras que representan resultados positivos con crecimiento en tres diluciones sucesivas, suelen denominarse número significativo, por ejemplo, si tenemos dos tubos positivos en la muestra directa, uno en la dilución 10-1 y otro en la 10-2 se obtiene el número y se coteja con la tabla de Número Más Probable con lo que resulta un número significativo que es 210 (5, 6).

5 Cuenta viable en placa. El recuento de organismos unicelulares, puede también realizarse en placa, ya que las células viables separadas espacialmente unas de otras por dispersión sobre un medio de agar, originan cada una en su crecimiento colonias independientes y macroscopicamente visibles. Por lo tanto, si se preparan diluciones apropiadas de una población bacteriana y se siembra con ellas un medio conveniente, puede calcularse el número de células viables en al contar el numero de colonias que se desarrollan después de la incubación de las placas y al multiplicar dicho valor por el factor de dilución (4). RESULTADOS En la figura 1 se muestra como los dos métodos de Número Mas Probable, con series de 3 y de 5 tubos coincidieron entre si un 85 % de las ocasiones y difirieron solamente un 15 %. PORCENTAJE DE COINCIDENCIAS Y DIFERNCIAS ENTRE LOS METODOS 1 Y 2 DE NMP 15% 85% COINCIDENCIAS DIFERENCIAS

6 En la figura 2 se observa como el método 1 de Número Mas Probable con series de 3 tubos coincide un 73 % con la Cuenta Viable en Placa y difiere un 27 %. PORCENTAJE DE COINCIDENCIAS Y DIFERENCIAS ENTRE EL METODO DE NMP 1 Y LA CVP 27% 73% COINCIDENCIAS DIFERENCIAS La figura 3 nos dice como el método 2 de Número Mas Probable con series de 5 tubos coincide un 73 % con la Cuenta Viable en Placa y difiere un 27 %. PORCENTAJE DE COINCIDENCIAS Y DIFERENCIAS ENTRE EL METODO DE NMP 2 Y LA CVP 27% 73% COINCIDENCIAS DIFERENCIAS

7 En la figura 4 se nos muestra el porcentaje de coincidencias y diferencias entre los tres métodos utilizados de Número Mas Probable con series de 3 y 5 tubos además de la Cuenta Viable en Placa. PORCENTAJE DE COINCIDENCIAS Y DIFERENCIAS ENTRE LOS 3 METODOS 29% 71% COINCIDENCIAS DIFERENCIAS La figura 5 nos muestra el porcentaje de incidencia de bacterias en muestras de aguas de aljibes, en estas muestras las de mayor incidencia fueron Citrobacter freundii y Pseudomonas sp apareciendo en un 20 % de las muestras, luego siguió E. coli en un 10 % de las mismas, también se encontró C. diversus. INCIDENCIA DE BACTERIAS ENCONTRADAS EN AGUAS DE ALJIBES % E. coli Pseudomonas C. freundii C. diversus 3

8 En la figura 6 se nos muestra los índices de incidencia de bacterias que se encontraron en muestras de aguas de tinacos, se encontró C. freundii en un 15 % de las muestras y Pseudomonas en un 7.6 %. INCIDENCIA DE BACTERIAS ENCONTRADAS EN AGUAS DE TINACOS 15 % Pseudomonas C. freundii En la figura 7 se nos muestra la incidencia de bacterias en ojos de agua, las que se encontraron fueron C. freundii, E.coli y Pseudomonas. INCIDENCIA DE BACTERIAS EN OJOS DE AGUA % E. coli Pseudomonas C. freundii

9 La figura 8 muestra los porcentajes de incidencia de bacterias en aguas de arroyo, apareció E. coli y Pseudomonas en todas las muestras, E. coli (inactiva) en el 75 5 de las muestras, y S. Aureus, C. freundii y Enterobacter en el 25 % de ellas. INCIDENCIA DE BACTERIAS EN AGUAS DE ARROYO % E. coli Pseudomonas 1 S. aureus C. freundii E. coli (inactiva) Enterobacter La figura 9 muestra la incidencia total de bacterias en las muestras de agua, las mas abundantes fueron C. freundii en un 20 %, E. coli en un 15.5 %, Pseudomonas en un 12.2 %, E. coli (inactiva) en un 6.6 %, aparecieron luego en un 2.2 % S. Aureus, C. diversus y Enterobacter. INCIDENCIA TOTAL DE BACTERIAS % E. coli Pseudomonas 1 S. aureus C. freundii C. diversus E. coli (inactiva) Enterobacter

10 En todas las muestras de agua de la red los resultados de los métodos de NMP y CVP fueron muy bajos, menores de 1 coliforme por 100 ml., los 3 métodos coincidieron entre si, tampoco se encontraron bacterias patógenas en las mismas. Abreviaturas 1- NMP 1 Método de Número Mas Probable con series de 3 Tubos. 2- NMP 2 Método de número Mas probable con series de 5 Tubos. 3- CVP Cuenta Viable en Placa. CONCLUSIONES 1- Los tres métodos coinciden cuando la cantidad de microorganismos es muy alta o muy baja. 2- Los métodos de NMP coincidieron entre si en un 85 % de las veces. 3- Cada uno de los dos métodos de NMP coincidió con la CVP en un 73 %. 4- Las muestras de aguas de la red son potables ya que presentaron muy bajos índices de coliformes < 1 col/100 ml. y no tuvieron presencia de microorganismos patógenos. 5- En orden descendente en cuanto a la carga microbiana se encontraron aguas de arroyo, aljibes, tinacos y aguas de la red. 6- Los microorganismos de mayor incidencia fueron Pseudomonas sp en el 22 % de las muestras, Citrobacter freundii con un 20 %, E. Coli en un 15.5 % y E. Coli inactiva en el 6.6 % de las mismas. 7- Las aguas de arroyo presentaron las cargas microbianas mas altas así como los mas altos índices de bacterias patógenas.

11 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1- Cabo Ramón J Bacteriología y potabilidad del agua. 2- Leza Zamarrón Lilia 1964 Estudio del Agua Desde el Punto de Vista Químico y Bactetriológico en la Ciudad de Parras de la Fuente, Coahuila Tesis de Licenciatura universidad Autónoma de Coahuila, Saltillo Coahuila México 3- Madigan Martinko Parker 2000 Biología de los Microorganismos Prentice Hall Octava Edición Madrid España 4- Tatcher Clark 1972 Análisis Microbiologico de Alimentos Acribia Zaragoza España. 5- Walter William G. Mc Bee Richard H Microbiología General CECSA México D. F. 6- Walter W. G. Mc Bee R. H. Temple K. L Introducción a la Microbiología Cía Ed Continental México D. F.