PRACTICA 4 ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS

Transcripción

1 PRACTICA 4 ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS 1.- OBJETIVO: El objetivo fundamental de la practica es la comprobación de la migración electroforética de los aminoácidos sometidos a un campo eléctrico en función de su carga y PI 2.- FUNDAMENTO: a) PUNTO ISOELECTRICO Los aminoácidos son moléculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un amino y un carboxilo. A un ph adecuado (ph 7,4) toman la forma de ion dipolar. Para el aminoácido más sencillo, la glicina (Gly), la estructura ion dipolar se le denomina glicina isoeléctrica, por tener igual número de cargas positivas y negativas: En medio ácido, la forma dipolar puede aceptar un protón (H ) en el grupo carboxilato (- COO - ), y también puede en medio alcalino, perder un protón (H ) del grupo (- ). Al pasar de ph muy ácido a ph muy alcalino, la evolución de las cargas en la representación de Bronsted del aminoácido glicina, sería: 1

2 El aminoácido glicina es un ácido diprótico, que se caracteriza por tener dos constantes de ionización y por consiguiente dos pks: * El primero (pk 1 ) corresponde a la disociación del grupo carboxilo (- COOH). * El segundo (pk 2 ) corresponde a la disociación del grupo amino (-NH 3 ). Entre estos dos pk se sitúa el punto de equivalencia de las dos disociaciones iónicas: se conoce como punto isoeléctrico (phi), para el cual las cargas () y (-) se encuentran en equilibrio. A este phi, la movilidad del aminoácido es nula cuando se encuentra situado en un campo eléctrico. 2

3 Para la glicina: ph < pi ph=pi ph > pi R-CH-COOH R-CH-COO - R-CH-COO - NH 2 carga neta: Para un aminoácido básico, serían: ph << pi ph < pi ph = pi ph > pi NH 2 R-CH-COOH R-CH-COO - R-CH-COO - R-CH-COO - NH 2 NH 2 carga neta: b) Electroforesis Por electroforesis se entiende el método basado en el movimiento de iones o moléculas cargadas por acción de un campo eléctrico. En la Bioquímica y Biología Molecular sirve para la separación e identificación de biomoléculas. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del ph del medio en que se encuentren. 3

4 Una partícula cargada en un campo eléctrico intenso esta sometida a dos fuerzas importantes, la fuerza eléctrica proporcional a la carga y al campo eléctrico, y una fuerza hidrodinámica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante la ley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este análisis otra fuerza debida a la agitación térmica llamada fuerza browniana y que causa la difusión de las partículas. F el = eze, donde e es la carga elemental, z la carga iónica, y E el campo eléctrico igual a V/d, con V la diferencia de potencial aplicada y d la distancia entre electrodos. F Stokes = 6πηav, donde es la viscosidad del medio, a el radio de la partícula supuesta esférica y v su velocidad. La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter la partícula al campo eléctrico, ésta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que las dos fuerzas queden iguales, la partícula ha alcanzado la velocidad límite. Equiparando las dos fuerzas se obtiene la expresión para la velocidad límite: ez v = E = ue πη a 6, donde se ha introducido u, la mobilidad electroforética. La velocidad de migración de la partícula es proporcional al campo eléctrico aplicado y a la mobilidad electroforética: ez u = 6πηa De esta última fórmula, se deduce que la mobilidad electroforética es proporcional a la carga de la molécula, pero es inversamente proporcional a su tamaño (a) y a la viscosidad de la solución (). Entre los distintos métodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar: La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel, acetato de celulosa, almidón, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altos campos eléctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentes desnaturalizantes. 4

5 La inmuno-electroforesis, que combina la electroforesis en agar con la reacción de precipitación específica antígeno-anticuerpo. La electrofocalización o electroenfoque, que separa en base al punto isoeléctrico de la biomolécula. Se emplea fundamentalmente para proteínas. La electroforesis que se va a realizar en la práctica es la zonal en papel de celulosa. Se va a aplicar a la separación de los aminoácidos glicina (Gly), leu (Leu), ácido aspártico (Asp) y lisina (Lys). En el transporte electroforético, a la fuerza del campo se opone la resistencia viscosa del medio, produciéndose cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partículas. La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor. La fuerza impulsora de la separación es el campo eléctrico. La fuerza retardadora es la interacción del soporte con las moléculas cargadas a separar. A igualdad de campo eléctrico, tamaño de las moléculas y viscosidad de la solución, el único parámetro que afecta a la separación es la carga, dependiente a su vez del ph del medio. La celulosa del papel hace de soporte para la emigración de los iones y del medio conductor de la corriente entre los electrodos, a través de una solución tampón de ph. Los aminoácidos al situarlos en el medio tamponado de ph característico, adquirirán una determinada carga de acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos funcionales. Por tanto, la separación de una mezcla de aminoácidos por electroforesis consistirá en la emigración de los aminoácidos cargados positivamente hacia el electrodo denominado cátodo (polo negativo), o al electrodo opuesto llamado ánodo (polo positivo) si están cargados negativamente, o no se desplazarán si la carga neta del aminoácido es nula. Puesto que el tampón de electroforesis que se va a utilizar en la práctica está constituido por piridina/ácido acético glacial/agua de ph = 6,1, se puede predecir la 5

6 carga que tendrá cada uno de los aminoácidos a dicho ph y si el aminoácido, por tanto, emigrará al cátodo, al ánodo o permanecerá en el origen o punto de aplicación de la muestra. Como el parámetro que define la carga de una molécula de aminoácido es el punto isoeléctrico (pi), si se conocen o calculan los valores de pi para cada aminoácido que se va a ensayar, la carga que mostrarán al ph de la experimentación y la emigración que sufrirán por acción del campo eléctrico, es fácil determinarlas para cada uno de los aminoácidos. Aminoácido Gly Leu Asp Lys pi 5,97 5,98 2,77 9,74 Carga a 0 0 (-) () ph=6,1 Emigración Origen Origen Ánodo Cátodo Predicción del comportamiento electroforético de los aminoácidos En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica, 2) su tamaño, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo; si tiene carga negativa, hacia el ánodo. Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al ph de 6,1 al que se realiza la electroforesis, los aminoácidos neutros se quedarán en el origen, los aminoácidos ácidos emigrarán al ánodo y los aminoácidos básicos emigrarán al cátodo. 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL MATERIALES Y REACTIVOS 6

7 - Aminoácidos al 1% o glicina o leucina o ácido aspártico o lisina - papel whatman nº 1 - pinzas de madera - micropipeta - pulverizador - secador - solución de nihidrina (1mg/ml en acetona) - Tampón piridina: tampón ph 6,1, (40 ml piridina, 3,2 ml ácido acético glacial y agua hasta 1L) - tijeras - guantes - fuente de electroforesis - cubeta para electroforesis en papel - cubeta de revelado DESARROLLO EXPERIMENTAL El dispositivo experimental necesario para realizar una electroforesis zonal en papel consiste en: - Una fuente de alimentación que suministre un potencial constante (300 V). - Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de platino, que deben conectarse a la fuente de alimentación mediante los cables con conectores adecuados, uno para el electrodo que hace de cátodo y otro para el que hace de ánodo. Las principales precauciones que hay que tener son: 7

8 - El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel hay que manejarlo con las pinzas de madera. - No contaminar las soluciones de los aminoácidos patrón y de la muestra problema. - Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente a la cubeta de electroforesis, hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables, conexiones o disolución que esté en contacto con la corriente. a.- Aplicación de las muestras. - Se traza con el lápiz una línea muy débil en el centro del papel. En la línea se señalan débilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa. - Al mismo tiempo se señala en el margen superior derecho de la tira de papel el signo (), para indicar el extremo del papel que se va a situar en el compartimento de la cubeta que va a actuar como ánodo. A1 A2 A3 A4 problema Tira papel whatman nº 1 b.- Electroforesis de las muestras. 8

9 Una vez aplicadas las muestras, se rocía ligeramente el papel con la solución tampón de electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente las muestras. Se quita la tapadera de la cubeta, se coge el papel con las pinzas y se coloca sobre la cubeta. Se introducen cada uno de los extremos del papel en los compartimentos de la cubeta, procurando que el extremo señalado en el papel con () sea el compartimento del ánodo Si los extremos no quedan bien sumergidos en la solución tampón de electroforesis, se llenan los compartimentos con más tampón. Antes de comenzar la electroforesis, hay que asegurarse que el papel está bien humedecido. Se coloca la tapadera en la cubeta, se conecta la fuente de alimentación a la red de alimentación y se enciende la misma. Con el mando del voltaje se ajusta el potencial a unos 300 V. Al cabo de media hora se apaga la fuente, se desconecta de la red, se quita la tapadera, se saca el papel de la cubeta mediante las pinzas, procurando no romperlo y se coloca encima del papel de filtro de la mesa del laboratorio c.- Secado y detección de los aminoácidos. - Se airea el papel para que se seque - Con las pinzas de madera se sumerge en la cubeta que contiene la solución de ninhidrina. Nada más que se impregne, se saca de la solución, dejando que escurra el exceso de la misma. - Se espera hasta que se produce la reacción de color - La detección de los aminoácidos patrón y de la muestra problema se realiza por la aparición de las manchas de color púrpura. La reacción que se produce entre los aminoácidos y la nihidrina es la siguiente: 9

10 d.- Identificación electroforética de los aminoácidos de la muestra problema. Los aminoácidos contenidos en la muestra problema se identifican mediante la comparación de los desplazamientos de las manchas con los correspondientes a los de los aminoácidos patrones A1 A2 A3 A4 problema b a Catodo (-) Anodo () 10

11 4.- BIBLIOGRAFÍA - Modern experimental biochemistry. Rodney Boyer : Boyer, Rodney F - Bioanalytical chemistry. Susan R. Mikkelsen, Eduardo Cortón. 5.- CUESTIONES 1. Señala de que factores depende el movimiento de los aminoácidos en la electroforesis en papel. 2. Qué aminoácidos están presentes en la muestra problema? 3. Si el ph del tampón fuera 2 cual sería el resultado de la electroforesis? 4. Se podría identificar mediante esta técnica una mezcla de los aminoácidos valina y triptofano utilizando las condiciones de la práctica? 11