UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA POSGRADO EN ZOOTECNIA & GESTIÓN SOSTENIBLE: GANADERÍA ECOLÓGICA E INTEGRADA CAMPUS UNIVERSITARIO DE RABANALES JUNIO, 2011

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1 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA POSGRADO EN ZOOTECNIA & GESTIÓN SOSTENIBLE: GANADERÍA ECOLÓGICA E INTEGRADA CAMPUS UNIVERSITARIO DE RABANALES JUNIO, 2011 LOS AMINOÁCIDOS EXCITADORES COMO NEUROMODULADORES DE LA REPRODUCCIÓN CAPRINA DR. CESAR A. MEZA-HERRERA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO UNIDAD REGIONAL UNIVERSITARIA DE ZONAS ÁRIDAS BERMEJILLO, DURANGO, MÉXICO.

2 SNC HIPOTALAMO GnRH HIPOFISIS FSH LH ± E 2 TECA FGF IGF-1 GRANULOSA OVARIO

3 SENSORES METABOLICOS HIPOTALAMO GnRH CONSUMO VOLUNTARIO ALIMENTO SUPLEMENTO FSH LH NUTRIENTES TECA IGF-1 FGF HORMONAS METABÓLICAS GRANULOSA CONDICION CORPORAL

4 SUPLEMENTACIÓN PROTÉICA PROTEÍNA PROTEASAS PEPTIDASAS PÉPTIDOS AMINOPEPTIDASAS CARBOXIPEPTIDASAS ARG HIS MET ASP GLU ASP FUNCIÓN METABÓLICA -Lactancia -Pubertad -Crecimiento fetal SEÑAL NEUROENDÓCRINA -Gametogénesis -Fertilización -Embriogénesis

5 AMINOÁCIDOS SUPLEMENTACIÓN DE PROTEÍNA PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS GLUT R IONOTRÓPICOS GLUT R METABOTRÓPICOS N-METIL-D-ASPARTATO, NMDA KAINATO DL-AMINO METIL ACIDO PROPIONICO, AMPA mglur-1 & 5 mglur-2 & 3 mglur-4, 6, 7 & 8 HIPOTÁLAMO GLUT, Principal Neurotransmisor Regulador Función Neuroendócrina Aprendizaje y Memoria Alzheimer, Parkinson, & Epilepsia

6 AMINOÁCIDOS SUPLEMENTACION DE PROTEINA PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS GLUT R IONOTRÓPICOS GLUT R METABOTRÓPICOS HIPOTÁLAMO GnRH HIPÓFISIS (ACTH, PRL, GH LH & FSH) Neuroendocrinología Reproductiva Modulador de la Pubertad Modulador de la Estacionalidad Modulador de la Eficiencia Reproductiva????

7 AMINOÁCIDOS NEUROEXCITADORES & ACTIVIDAD REPRODUCTIVA EN CABRAS BAJO FOTOPERÍODOS DECRECIENTES (26 LN) I. EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD OVÁRICA TOTAL II. EFECTO SOBRE LA FUNCIÓN DEL EJE SOMATOTRÓPICO III. EFECTO SOBRE LOS NIVELES SÉRICOS DE INSULINA IV. EFECTO SOBRE LA FUNCIÓN LÚTEA & LA SÍNTESIS DE PROGESTERONA

8 SUPLEMENTACIÓN GLU GLU GLU HIPOTÁLAMO SENSOR METABÓLICO GnRH HIPÓFISIS FSH LH? TECA FGF IGF-1 GRANULOSA EXPERIMENTO - 1

9 MATERIAL & METODOS LOCALIZACIÓN DEL ÁREA EXPERIMENTAL & CONDICIONES AMBIENTALES. El estudio se realizó en la Unidad de Investigación Caprina Sur, UACH-URUZA, localizada en los 26 LN y 103 LO, a 1,117msnm. El área posee un clima seco cálido (BW) con oscilaciones térmicas extremas, con promedios anuales de precipitación y temperatura de mm, y 22.3 C, respectivamente. ANIMALES & DISEÑO DE TRATAMIENTOS. Cabras adultas (n=22, PV=46.0±3.5 kg, CC=3.38±0.03, 34 meses) con un encaste mínimo de 7/8 a Saanen y Alpina fueron aleatoriamente asignadas a uno de dos tratamientos, 1) Control, sin suplementación (CONT, n=12; PV= kg, CC=3.4±0.03), y 2) Aminoácidos Excitadores (AAE, n=10, PV= kg, CC=3.5±0.03). El grupo AAE recibió 7 mg kg - 1 PV de L-glutamato i.v. tres veces por semana del 20 de octubre al 5 de diciembre, bajo condiciones naturales de luz (fotoperíodo decreciente). ALIMENTACIÓN. La dieta ofrecida cubrió el 110% de los requerimientos nutricionales ajustada al PV, ofreciendo por la mañana heno de alfalfa (14% PC, 1.14 ENm Mcal kg -1 ) y ensilado de maíz (8.1% PC, 1.62 ENm Mcal kg -1 ), y por la tarde (1800) maíz rolado (11.2% PC, 2.38 ENm Mcal kg -1 ).

10 MATERIAL & METODOS PROTOCOLO DE EXPERIMENTACIÓN Período Experimental: 45 días GRUPO: AAE S n = 10; PV = 45.8 ± 4.0 AMINOÁCIDOS EXCITADORES / SOLUCIÓN SALINA GRUPO: CONT n = 12; PV = 46.2 ± ULTRASONIDO (Toshiba, 7.5 Mhz) ESPONJA PGF 2α ESTRO SINCRONIZACIÓN ACTIVIDAD OVÁRICA TOTAL: FA, FT, CLT, AOTFA & AOTFA ANOVA-DCA

11 9 OLEADAS DE DESARROLLO FOLICULAR EN CAPRINOS Ǿ, (mm) FASE LÚTEA F. F. Theriogenology, 2009, 52:

12 RESULTADOS & DISCUSIÓN Cuadro 1. Medias de mínimos cuadrados para peso vivo (PV, kg), condición corporal (CC, unidades), folículos totales (FT, unidades), folículos antrales (FA, unidades), cuerpos lúteos totales (CLT, unidades), actividad ovárica total folículos totales (AOTFT, unidades) y actividad ovárica total folículos antrales (AOTFA, unidades) en cabras suplementadas con aminoácidos excitadores (AAE) y sin suplementación (CONT) bajo fotoperíodo decreciente en la Comarca Lagunera (26 LN) Variables AAE CONT NSO 1 EE 2 PV CC FT 5.3 a 3.5 b FA 3.4 a 2.1 b CLT 2.9 a 2.8 a AOTFT 8.2 a 6.3 b AOTFA 6.3 a 5.0 b Nivel de significancia observado 2 EE, error estándar de medias de mínimos cuadrados más conservador.

13 CONCLUSIONES La aplicación endovenosa de 7 mg kg -1 PV de L-glutamina los días 1, 7, 11 y 14 postestro incrementó la actividad ovárica total (FT y AOT) en cabras adultas de la Comarca Lagunera (26 LN). El costo estimado de la suplementación de GLUT es cercano a $ 1.0 USD por cabra por tratamiento (incluye las cuatro infusiones). A dicho costo habría que agregar el costo de la sincronización ya sea mediante el uso de la esponja intravaginal o mediante el efecto macho. Futuros estudios deberán evaluar el posible rol que la suplementación de aminoácidos neuroexcitadores pueda ejercer sobre la expresión de ciertas hormonas ya sea de origen metabólico o gonadotrópico las cuales, en turno, puedan promover un efecto positivo sobre la función del eje hipotálamohipofisiario-gonadal en cabras.

14 SUPLEMENTACIÓN GLU GLU GLU HIPOTÁLAMO? GH SENSOR METABÓLICO - IGF-1 GnRH HIPÓFISIS FSH LH TECA FGF IGF-1 GRANULOSA EXPERIMENTO - 2

15 GLUTAMATO Y FUNCIÓN REPRODUCTIVA El glutamato es reconocido como el principal neurotransmisor en el cerebro responsable del 75% de la neurotransmisión excitadora. Dicho aminoácido excitador afecta muchos procesos fisiológicos debido a la existencia de un gran número de subtipos de receptores a glutamato en el SNC; > 25 (Brann, 2005). EL EJE SOMATOTRÓPICO: GH IGF-1 Las interacciones del eje somatotrópico cuyos componentes endocrinos incluyen a la hormona del crecimiento (GH), los factores de crecimiento análogos a insulina tipos I y II (IGF-I y IGF-II), así como las proteínas enlazadoras de IGF (IGFBP), juegan un rol esencial en la función ovárica (Barb et al., 1996). En la mayoría de los mamíferos tanto los IGF-1 como la insulina estimulan la proliferación de las células de la teca y de la granulosa, así como la mitogénesis y el sinergismo con las gonadotropinas para estimular la esteroidogénesis ovárica y lograr la formación de folículos preovulatorios (Davidson et al., 2002).

16 EL EJE SOMATOTRÓPICO: GH IGF-1 La GH promueve la sobrevivencia y proliferación folicular al potenciar la acción de LH, y regular positivamente la expresión de receptores a LH (I'anson et al., 2003). El efecto foliculogénico de GH (número y diámetro), es reflejado por un incremento en la proliferación y función de las células de la granulosa (Cognié et al., 2003). La GH previene la atresia en folículos pequeños, promoviendo el crecimiento de los folículos >2 mm en borregas y cabras (Müller et al., 1999). Cambios agudos o crónicos en los niveles de GH, IGF-1 e Insulina han mostrado efectos directos a nivel ovárico sobre el desarrollo folicular, así como sobre el desarrollo y actividad estrogénica del folículo dominante (Mihm & Bleach, 2003).

17 MATERIAL & METODOS PROTOCOLO DE EXPERIMENTACIÓN Período Experimental: 45 días GRUPO: AAE S n = 10; PV = 45.8 ± 4.0 AMINOÁCIDOS EXCITADORES / SOLUCIÓN SALINA GRUPO: CONT n = 12; PV = 46.2 ± MUESTREO INTENSIVO 6 h x 15 min, GH; n=250 6 h x 60 min, IGF-1; n=60 ESPONJA PGF 2α ESTRO SINCRONIZACIÓN AOT & GH (AUC-PULSE): ANOVA-DCA [GH] & [IGF-1]: ANOVA-DCA-PROC MIXED- SAS

18 RESULTADOS & DISCUSIÓN Cuadro 1. Medias de mínimos cuadrados para actividad ovárica total (AOT, unidades), nivel sérico de GH (ng ml -1 ), pulsos (GH-PULSE, unidades) y área bajo la curva (GH-AUC, unidades 2 ) de GH, y nivel sérico de IGF-I (ng ml -1 ), en cabras en fase folicular media suplementadas con aminoácidos excitadores (AAE) y cabras control (CONTROL) bajo fotoperíodo decreciente en la Comarca Lagunera (26 LN) AAE CONTROL NSO 1 EE 2 AOT 8.2 a 6.3 b GH GH-AUC GH-PULSE IGF-I Nivel de significancia observado 2 Error estándar de la media

19 CONCLUSIONES Aunque la suplementación de L-glutamato incrementó la actividad ovárica total (FT, FA, AOTFT & AOTFA), no promovió diferencias entre tratamientos con respecto a la función del eje somatotrópico. La suplementación de AAE pudo invocar alguna otra señal endocrina, ya sea gonadotrópica o metabólica, o alguna otra ruta neuroendocrina no dependiente de la acción del eje somatotrópico GH-IGF-1. Alternativamente, la suplementación de glutamato pudo potencialmente haber ejercido un efecto directo sobre los diferentes componentes celulares del ovario, particularmente sobre la expresión de ciertos receptores de las células ováricas. Otro efecto pudo ser ejercido mediante la activación de señales autocrinas o paracrinas, generado un mayor reclutamiento y(o) selección foliculares, o una posible reducción en el nivel de atresia folicular en las cabras suplementadas.

20 SUPLEMENTACIÓN GLU GLU GLU HIPOTÁLAMO? INSULINA SENSOR METABÓLICO GnRH HIPÓFISIS LH? TECA FGF IGF-1 GRANULOSA EXPERIMENTO - 3

21 MATERIAL & METODOS PROTOCOLO DE EXPERIMENTACIÓN Período Experimental: 45 días AMINOÁCIDOS EXCITADORES / SOLUCIÓN SALINA GRUPO: AAE S n = 10; PV = 45.8 ± 4 GRUPO: CONT n = 12; PV = 46.2 ± MUESTREO INTENSIVO 6 h x 15 min, LH; n=250 6 h x 60 min, INS; n=60 ESPONJA PGF 2α ESTRO SINCRONIZACIÓN AOT & LH (AUC-PULSE): ANOVA-DCA [LH] & [INS]: ANOVA-DCA-PROC MIXED

22 RESULTADOS & DISCUSIÓN Cuadro 1. Medias de mínimos cuadrados para peso vivo (PV, kg), condición corporal (CC, unidades), actividad ovárica total (AOT, unidades); niveles séricos (LH, ng ml -1 ), área bajo la curva (LH-AUC, unidades 2 ) y pulsos (LH-PULSE, unidades) de LH y niveles séricos de insulina (INS, ng ml -1 ) en cabras suplementadas con aminoácidos excitadores (AAE) y sin suplementación (CONT) bajo fotoperíodo decreciente en la Comarca Lagunera (26 LN) Variables AAE CONT NSO 1 EE 2 PV CC AOT LH LH-AUC LH-PULSE INS Nivel de significancia observado 2 EE, error estándar de medias de mínimos cuadrados más conservador.

23 RESULTADOS & DISCUSIÓN Incrementos en los niveles de insulina mediante la infusión endovenosa de glucosa aumenta la tasa de ovulación (Bucholtz et al. 1988). En el mismo sentido, tanto insulina como IGF-I muestran efectos directos sobre el ovario, estimulando la proliferación de las células de la granulosa, de la teca así como la producción de progesterona. Además de una acción reguladora de los niveles de glucosa, la insulina parece promover un efecto directo sobre la función ovárica en ovejas (Gong et al., 1993; Spicer et al., 1993; Spicer y Echternkamp, 1995). Los resultados del presente estudio sugieren que el incremento en la AOT en las cabras suplementadas con AAE pudo ser mediado por una ruta metabólica dependiente de insulina. Los resultados sugieren la posibilidad de una acción co-gonadotrópica de la insulina a nivel ovárico (Bucholtz et al., 2000), potenciando una posible acción de LH sobre el comportamiento ovárico en las cabras suplementadas.

24 CONCLUSIONES La aplicación endovenosa de 7 mg kg -1 PV de L-glutamato los días 1, 7, 11 y 14 después del estro a cabras adultas 7/8 Saanen-Alpina en la Comarca Lagunera (26 LN) paralelo a incrementos en la AOT generó un incremento en los niveles séricos de insulina, sin alterar la concentración de la hormona luteinizante. El efecto observado en los animales tratados con el neuroexcitador glutamato, pudo haber potenciado una ruta de acción no dependiente de gonadotropinas, con incrementos en los niveles séricos de insulina. La insulina, en turno, puede ejercer efectos directos a nivel ovárico promoviendo la proliferación celular de la teca y la granulosa, aumentando la esteroidogénesis, potenciando la activación de receptores a LH, ó promoviendo el desarrollo folicular, sin incrementos en los niveles de secreción de LH.

25 SUPLEMENTACIÓN GLU GLU GLU HIPOTÁLAMO LHRH HIPOFISIS LH SLC FGF IGF-1 CL LLC CL CL? P 4 EXPERIMENTO - 4

26 INTRODUCCION La fisiología reproductiva en la hembra es un proceso biológico complejo ya que las hembras llevan a cabo dos funciones reproductivas distintas: El desarrollo de los gametos, y en caso de que ocurra la fertilización del óvulo, El mantenimiento de un feto hasta que éste tenga la capacidad de sobrevivir fuera del útero. Para controlar éstas dos funciones, el ovario posee dos sistemas endocrinos relacionados. El sistema responsable de la oogénesis consiste de una estructura, el folículo, dentro del cual ocurre el proceso de oogénesis y se sintetiza su principal hormona, el estradiol (E2).

27 INTRODUCCION El otro sistema endocrino, el cuerpo lúteo, es responsable del mantenimiento de la preñez y tiene como principal compuesto endocrino a la P4. Este sistema es completamente funcional durante la preñez y funciona en forma parcial en hembras no-gestantes. Bajo condiciones normales, estos dos sistemas operan en una forma secuenciada mas que simultánea, siendo ésta secuencia de eventos de los sistemas foliculares y lúteos la que dá lugar a un ciclo estral de 21 días en la cabra. Durante la fase folicular, el sistema opera para producir un folículo maduro listo para ser fertilizado. Posteriormente, durante la fase lútea, la P4 secretada por el CL prepara al sistema reproductivo de la hembra para una posible fertilización del óvulo liberado.

28 HIPOTALAMO GnRH HIPOFISIS FSH LH FL TECA FGF IGF-1 UTERO RMP SLC FGF CL IGF-1 GRANULOSA LLC SISTEMA FOLICULAR SISTEMA LÚTEO P4

29 HIPOTÁLAMO LHRH ( + ) ( - ) RECONOCIMIENTO MATERNO DE LA PREÑEZ ESTIMULA SECRECIÓN DE NUTRIENTES EN OVIDUCTO Y ÚTERO HIPOFISIS LH P4 INHIBE CONTRACCIONES MIOMETRIALES EN UTERO AUMENTA EL APORTE SANGUÍNEO AL ENDOMETRIO SLC FGF IGF-1 LLC CL INCREMENTA LA VISCOCIDAD DEL MOCO CERVICAL INDUCE CAMBIOS ESTRUCTURALES DURANTE LA PLACENTOGÉNESIS

30 MATERIAL & METODOS PROTOCOLO DE EXPERIMENTACIÓN Período Experimental: 45 días AMINOÁCIDOS EXCITADORES / SOLUCIÓN SALINA GRUPO: AAE S n = 10; PV = 45.8 ± 4 GRUPO: CONT n = 12; PV = 46.2 ± MUESTREO INTERMITENTE 2 x semana, P4; n=84 ESPONJA PGF 2α ESTRO SINCRONIZACIÓN ULTRASONIDO (Toshiba, 7.5 Mhz) AOT & VLT (4/3 π R 3 ) * CLT

31 RESULTADOS & DISCUSIÓN Cuadro 1. Medias de mínimos cuadrados de cuerpos lúteos totales (CLT, unidades), volumen lúteo total (VLT, mm 2 ) y niveles séricos P4 (ng ml -1 ), en cabras suplementadas con aminoácidos excitadores (AAE) y sin suplementación (CONT) bajo fotoperíodo decreciente en la Comarca Lagunera (25 LN) AAE CONTROL E. E 1 NSO 2 CLT 2.9 a 2.8 a VLT a a P4 4.6 a 4.5 a EE, error estándar de medias de mínimos cuadrados más conservador 2 Nivel de significancia observado.

32 SUPLEMENTACIÓN X GLU GLU GLU HIPOTÁLAMO LHRH HIPOFISIS LH X X SLC FGF IGF-1 CL LLC CL CL P4

33 CONCLUSIONES Los promedios globales para CLT, VLT y P4 fueron 3.03, 2,180.3 mm 3, y 4.88 ng ml -1, respectivamente, sin observar diferencias (P>0.05) entre tratamientos para dichas variables. Los resultados observados sugieren que la aplicación endovenosa de 7 mg kg -1 PV de L-glutamato los días 4, 8, 12 y 17 después del estro, no generó una mayor eficiencia en los diferentes componentes celulares lúteos. En el mismo sentido, sugieren que no existió un incremento en la función de los grupos enzimáticos que definen las rutas esteroidogénicas que se reflejara en una mayor síntesis de progesterona.

34 SUPLEMENTACIÓN GLU GLU GLU SENSOR METABÓLICO HORMONAS METABÓLICAS INSULINA FL FL FL TECA FGF IGF-1 GRANULOSA HIPOTALAMO GnRH HIPOFISIS LH FSH х P4 SLC FGF CL IGF-1 LLC