Investiga la vacuna de la malaria

Transcripción

1 Investiga la vacuna de la malaria Taller de experimentación PROTOCOLO

2 Introducción La malaria es considerada la enfermedad más importante del mundo debida a un parásito y es responsable de la muerte de aproximadamente personas cada año, especialmente niños menores de cinco años y mujeres embarazadas. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), unos millones de personas corren el riesgo de contraer la infección, y en el año 2010 se produjeron 225 millones de casos de malaria en el mundo, de los cuales un 90% tuvieron lugar en África. Actualmente, la malaria es endémica en más de 100 países localizados en el África Subsahariana y regiones del sur de Asia, de Latinoamérica y de Oceanía. Los últimos informes indican que la mitad de la población mundial vive en áreas donde existe riesgo de contraer la enfermedad y donde, además de las consecuencias sobre la salud de la población, la malaria contribuye a debilitar aún más la situación económica de la zona. Para erradicar la enfermedad, en las zonas con alto riesgo de transmisión se están llevando a cabo varias intervenciones que suponen una combinación de diferentes medidas que incluyen la utilización de mosquiteras impregnadas de insecticida, de aerosoles insecticidas, de tratamientos de prevención, la implantación de programas educativos e intervenciones ambientales, entre otras cosas. La comunidad científica está trabajando intensamente para desarrollar una vacuna que se cree que, en combinación con las medidas actuales, podría contribuir significativamente a un mejor control de la malaria. Actualmente ya existe una vacuna que se encuentra en fase de estudio clínico y que será efectiva en un 50% de los casos. En este taller investigarás con diferentes candidatos a vacuna para decidir cuál es el más eficaz. Países o zonas donde se produce la transmisión de malaria Países o zonas con riesgo limitado de transmisión de malaria Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). Datos de

3 Cómo se transmite la malaria? La malaria es una enfermedad infecciosa que se contagia mediante la picadura de un mosquito del género Anopheles que transmite parásitos del género Plasmodium y que por lo tanto actúa como vector. Dentro del organismo humano, los parásitos se multiplican en el hígado y a continuación infectan los glóbulos rojos. Entre los síntomas de la malaria destaca la fiebre, el dolor de cabeza y los vómitos, que aparecen entre 10 y 15 días después de la picadura del mosquito. Cómo se está interviniendo para controlar la malaria? Las intervenciones fundamentales para controlar la malaria se dividen en varios grupos: 1 Estrategias contra el mosquito o vector, como la fumigación de los espacios cerrados con insecticidas. Por qué es necesaria una vacuna contra la malaria? Históricamente las vacunas han constituido uno de los medios más eficaces para prevenir enfermedades y salvar vidas, especialmente en el caso de las enfermedades infecciosas. La obtención de una vacuna parcialmente eficaz podría significar la posibilidad de salvar a cientos de miles de vidas. La obtención de una vacuna supondrá un gran paso adelante y se podrá añadir al arsenal actual de medidas utilizadas para la prevención de la malaria, como las mosquiteras impregnadas con insecticida y el tratamiento oportuno y adecuado de los casos diagnosticados de malaria. Como su eficacia a corto plazo será parcial, no sustituirá estas medidas, sino que las complementará y, conjuntamente, constituirán una respuesta integral para la prevención de la malaria. 2 Estrategias para evitar el contacto vectorhuésped, como el uso de mosquiteras impregnadas con insecticida. 3 Estrategias contra el parásito. Dentro de este grupo de estrategias, encontramos el tratamiento con combinaciones de fármacos basados en una molécula llamada artemisinina, que es rápido y eficaz. Una vacuna también sería una estrategia de control contra el parásito que, en combinación con otras estrategias, podría contribuir significativamente a la erradicación de la malaria. 3

4 Qué hacemos en ISGLOBAL, el Instituto de Salud Global de Barcelona? El Instituto de Salud Global de Barcelona (ISGlobal) es una organización sin ánimo de lucro, cuyo objetivo es mejorar la salud y el desarrollo de las poblaciones más vulnerables mediante la generación, la gestión, la transmisión y la aplicación de conocimientos. Su visión es un mundo donde todos podamos gozar de una buena salud y, entre otras instituciones, cuenta con el apoyo de la Obra Social "la Caixa". Uno de los pilares esenciales de ISGlobal es la investigación centrada en problemas de salud que afectan a las poblaciones más vulnerables y se desarrolla desde el Centro de Investigación en Salud Internacional de Barcelona (CRESIB). La investigación sobre la malaria que se lleva a cabo desde el CRESIB se centra en: 1. Estudio de las bases moleculares de la enfermedad, así como de las diferentes respuestas inmunitarias. 2. Desarrollo de nuevos fármacos y evaluación de su seguridad, eficacia y efectividad. 3. Evaluación de las características epidemiológicas de la malaria en diferentes entornos y de los aspectos socioculturales que la rodean. 4. Análisis de la efectividad de diferentes herramientas de prevención, así como de la relación coste-efectividad de las intervenciones. Dentro del ámbito (4), el CRESIB lleva a cabo estudios clínicos de seguridad, de eficacia y de efectividad de vacunas. Actualmente participa en el desarrollo de la vacuna RTS,S contra la malaria, que está resultando efectiva en más del 50% de los niños infectados. En paralelo, los investigadores del CRESIB están investigando para identificar nuevos candidatos a vacuna. 4

5 Objetivos del taller En este taller te invitamos a analizar diferentes candidatos a vacuna contra la malaria con los que el CRESIB está investigando, para que identifiques cuál es el mejor candidato. Los candidatos a vacuna del CRESIB han sido obtenidos de proteínas del parásito que previamente se han purificado. 1 Para analizarlos dispondrás de varias muestras de sangre de personas residentes en zonas afectadas por malaria que ya han sufrido la enfermedad en varias ocasiones y que ya están inmunizadas. Para confirmar que nuestros candidatos a vacuna son efectivos, tenemos que comprobar que las personas inmunizadas han desarrollado una respuesta contra esos candidatos. Si en las personas se observa una activación de la respuesta inmunitaria contra las proteínas candidatas, significará que podrían ser buenos candidatos a vacuna porque también podrían desencadenar la respuesta necesaria para protegerse contra futuras infecciones

6 El objetivo de este taller es que te familiarices con una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios de biomedicina, la técnica ELISA ( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ). Se trata de un análisis para detectar si en las muestras de sangre hay anticuerpos. La presencia de anticuerpos específicos contra los candidatos indicará que ha sido capaz de activar una buena respuesta inmunitaria y que, por lo tanto, se podría tratar de un buen candidato. Gracias a esta técnica descubriremos concretamente cuál de los antígenos de los que disponemos en el laboratorio es un buen candidato a vacuna contra la malaria. Principios básicos de la técnica ELISA El principio básico de esta técnica se basa en la interacción del candidato a vacuna, o antígeno (1), con el anticuerpo (2). Un anticuerpo específico se unirá a un antígeno específico para dar un complejo antígeno-anticuerpo exclusivo. La técnica ELISA nos permite identificar si había anticuerpos, y por lo tanto, si se han formado los complejos antígeno-anticuerpo al poner en contacto las muestras de sangre con los candidatos a vacuna. Para llevar a cabo la identificación, se utilizan unos anticuerpos que tienen asociada una molécula llamada enzima (3), que tiene la capacidad de reaccionar con una sustancia llamada sustrato (4) que le añadiremos, y producir un color. Así pues, si la muestra tenía el anticuerpo que queríamos detectar, éste se unirá al que añadiremos unido a una enzima, que a la vez hará que el sustrato cambie de color y de este modo nos indicará el resultado positivo. Anticuerpo Enzima Sustrato Antígeno 1. Antígeno: cualquier material extraño que se une de forma específica a los anticuerpos o linfocitos específicos para activar una respuesta inmunitaria. En general, los antígenos tienen un peso molecular elevado y normalmente son proteínas o polisacáridos. 2. Anticuerpo: proteínas (inmunoglobulinas o Ig) del suero que se forman como respuesta a la invasión de moléculas extrañas en el organismo, bien por exposición natural a un antígeno o por inmunización mediante vacunas. Tienen forma de Y y están formados por cuatro cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro intercatenarios. Los anticuerpos tienen una región constante y una región variable. 3. Enzima: proteína que facilita reacciones específicas del metabolismo. 4. Sustrato: solución que contiene un compuesto sobre el cual actuará una enzima. 6

7 Organización del taller Para analizar qué candidato a vacuna o antígeno es el más efectivo, analizaremos si las muestras de sangre de personas inmunizadas contra malaria tienen anticuerpos contra los mismos. Para ello dividiremos el experimento en 3 etapas principales. 1. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS CANDIDATAS (O ANTÍGENOS) A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS El primer paso será fijar las proteínas candidatas objeto de estudio a un soporte sólido 2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO Después añadiremos las muestras de sangre, concretamente el suero (que corresponde a las muestras de sangre una vez extraídas las células y los factores de coagulación), y un anticuerpo marcado con una enzima que denominaremos anticuerpo secundario. En las muestras de sangre donde esté presente el anticuerpo de estudio se formarán complejos antígeno-anticuerpo, que a su vez se unirán al anticuerpo marcado con la enzima. Suero de los pacientes Anticuerpo secundario marcado con enzima 3. LECTURA DE LA REACCIÓN Por último, añadiremos el sustrato de la enzima, que cambiará de color en caso de que hubiera complejos antígeno-anticuerpo. De este modo podremos saber si las muestras de sangre tenían el anticuerpo de estudio y en qué cantidad. Sustrato de la enzima Resultados y conclusiones Con los resultados obtenidos podremos decidir qué candidato a vacuna activa una respuesta inmunitaria más intensa y por lo tanto puede ser el mejor candidato. 7

8 Equipamiento y material necesario Instrumentos y utensilios de laboratorio Agitador magnético (1) (para preparar PBS-Tween) Cronómetro Núcleo magnético y "pesca-núcleos" Probeta de 100 ml Micropipeta de 20 a 200 µl (2) Botella de cristal de 250 ml Embudo Material fungible Tiras de 12 pocillos de ELISA y soportes Pipetas Pasteur de plástico graduadas Puntas para micropipeta Papel absorbente Rotulador permanente Guantes, gafas y bata 1. En caso de que no tengas agitadores magnéticos, puedes comprar el PBS líquido 2. En caso de que no tengas micropipetas, puedes utilizar pipetas Pasteur de poco volumen 8

9 Reactivos y muestras A B Sustrato Candidatos a vacuna (antígenos) Sustrato o solución de revelado Detergente Tween-20 (4) C+ C- Controles positivos y negativos (5) 1 Agua destilada Anticuerpo 2ario Solución tampón PBS (3) Anticuerpo secundario con enzima (peroxidasa) Muestras de suero de 4 personas residentes en zonas endémicas de la malaria que son inmunes a la enfermedad 3. Ayuda a mantener el ph de la solución gracias a fosfatos de sodio y de potasio. 4. Ayuda a prevenir uniones de anticuerpos inespecíﬁcas 5. C+: contiene una mezcla de sueros de personas residentes en zonas endémicas de malaria y que son inmunes a la enfermedad. C-: mezcla de sueros de personas que nunca han estado expuestas a la malaria 9

10 Procedimientos Para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos específicos contra los 2 antígenos candidatos a vacuna que tenemos en el laboratorio, confrontaremos la sangre (concretamente el suero) de diferentes pacientes que residen en zonas endémicas de malaria con estos antígenos, para ver si en estos sueros encontramos anticuerpos específicos contra nuestros antígenos. 1 Unión de los antígenos a la superficie de los pocillos Las tiras de micropocillos se recubren con los candidatos a vacuna (antígenos) que queremos probar para ver si serían buenos candidatos a una vacuna contra la malaria. La unión de estos antígenos a la superficie de los pocillos se produce con facilidad por estar hechos con un plástico tratado que tiene una gran afinidad para unir proteínas. PROTOCOLO PARA LA UNIÓN DE LOS ANTÍGENOS A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS 1 A continuación anota qué pondrás en cada pocillo (controles, muestras de sangre y nombre de los antígenos que analizarás). 2 Rotula los pocillos marcando donde pondrás cada muestra. 10

11 3 Prepara una solución de lavado (PBS-Tween 0,05%). A Mide 200 ml de agua destilada utilizando la probeta y enrasando con la pipeta Pasteur. Añade los 200 ml de agua destilada a la botella utilizando el embudo. C Cuando la píldora se haya disuelto, extrae el núcleo magnético y añade 100 µl de Tween-20 con una pipeta Pasteur de plástico. B Deposita el núcleo magnético dentro de la botella y diluye con el agua 1 pastilla de PBS utilizando el agitador magnético. D Remuévelo bien invirtiendo la botella varias veces. Nota: La solución de lavado contiene PBS (phosphate buffer saline), que permite que los anticuerpos se mantengan en un ambiente estable que ayuda a conservar su estructura. El Tween-20 es un detergente que ayudará a eliminar las proteínas que se hayan podido unir de forma no específica y se une a las partes del pocillo que no están cubiertas por antígeno. De este modo se reduce el ruido de fondo. 11

12 4 5 Añade los dos antígenos problema a los pocillos correspondientes utilizando la micropipeta (50 µl por pocillo). Es importante que uses una punta limpia para dispensar los antígenos, así se evitarán contaminaciones. Deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. 6 7 Lávalo para eliminar el exceso de antígeno no unido a la tira. Para ello, llena los pocillos con la solución de lavado mediante una pipeta Pasteur de plástico. Elimina los restos de antígeno mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. 8 Descarta la solución de lavado mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. 9 Repite los pasos 7 y 8 una vez más. 12

13 2 Formación de complejos antígeno-anticuerpo En este paso, primero acondicionaremos el suero de los pacientes para analizar si contienen anticuerpos contra el candidato a vacuna. A estos anticuerpos que queremos analizar los llamaremos anticuerpos primarios. Después añadiremos un anticuerpo secundario marcado con una enzima llamada peroxidasa. Como a cada anticuerpo primario se le puede unir más de un anticuerpo secundario, la cantidad de color que se obtendrá en el paso tres será amplificada. De este modo la técnica tendrá más sensibilidad. Suero de los pacientes Anticuerpo secundario marcado con enzima PROTOCOLO DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO 1 2 Añade los controles positivos y negativos a los pocillos correspondientes utilizando la micropipeta (50 µl por pocillo). El control positivo (C+) contiene una mezcla de sueros de personas residentes en zonas endémicas de malaria y que son inmunes a la enfermedad. El control negativo (C-) contiene una mezcla de sueros de personas que nunca han estado expuestas a la malaria. Añade las distintas muestras de sueros de 4 residentes en zonas endémicas de malaria a los pocillos correspondientes utilizando la micropipeta (50 µl por pocillo). 13

14 3 4 Déjalo incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. 5 Elimina el exceso de muestra mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. 6 Lava todos los pocillos para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado con los antígenos y que por lo tanto no son específicos. Llena los pocillos con la solución de lavado mediante una pipeta Pasteur de plástico. 7 Descarta la solución de lavado mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. 8 Repite los pasos 5 y 6 dos veces más. Con la micropipeta, añade el anticuerpo secundario que está unido a una enzima a todos los pocillos (50 µl por pocillo). 14

15 9 10 Elimina el exceso de anticuerpo secundario mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. Deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente Lava los pocillos llenándolos con la solución de lavado mediante una pipeta Pasteur de plástico. Descarta la solución de lavado mediante inversión de la tira sobre un papel absorbente. 13 Repite los dos pasos anteriores 3 veces más. 15

16 3 Lectura de la reacción Después de lavarlo para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de complejos antígeno-anticuerpo, se añade el sustrato enzimático en solución, que facilitará el cambio de color. Sustrato de la enzima PROTOCOLO DE LA LECTURA DE LA REACCIÓN 1 2 Añade el sustrato de la enzima a todos los pocillos con la micropipeta (50 µl por pocillo). Déjalo incubar durante 5 minutos. Durante este tiempo el sustrato se unirá a la enzima e irá apareciendo el color a temperatura ambiente. 16

17 3 Recoge los resultados en forma de gráfico de barras. ANTÍGENO 1 máximo Intensidad Intensidad mínimo Muestras C+ C- M1 M2 M3 M4 ANTÍGENO 2 máximo mínimo Muestras C+ C- M1 M2 M3 M4 17

18 Resultados y conclusiones Interpreta y apunta los resultados 1. Qué antígeno de los que has probado crees que es el mejor candidato a vacuna? Crees que los antígenos que has probado son un buen candidato a vacuna? Por qué? 2. Cuándo una reacción es positiva y cuándo es negativa? Por qué? 3. Por qué crees que se utilizan los controles? 18

19 4. Qué parte del anticuerpo primario es reconocida por el anticuerpo secundario: la región constante o la variable? Razona la respuesta. 5. Qué pasaría si no hiciéramos los lavados antes de poner el sustrato de revelado? 6. Podríamos utilizar sangre de compañeros de tu clase para determinar si nuestros antígenos de laboratorio son buenos candidatos para una vacuna contra la malaria? Razona la respuesta. 7. Crees que con este experimento ha quedado demostrado que el candidato seleccionado estimula la respuesta inmunitaria? Tendría que hacerse algún otro tipo de experimento para evaluar si también es capaz de activar algún otro tipo de respuesta? 19

20 Anexo I Precauciones de seguridad USO OBLIGATORIO DE GAFAS USO OBLIGATORIO DE BATA USO OBLIGATORIO DE GUANTES INFÓRMATE Localiza los elementos de seguridad del laboratorio o el espacio habilitado para experimentar (extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee atentamente las instrucciones antes de hacer un experimento. No olvides leer las etiquetas de seguridad de reactivos y aparatos. UTILIZA VESTIMENTA ADECUADA Guantes, bata y gafas de protección. NORMAS GENERALES Está prohibido fumar, comer o beber en el laboratorio o en el espacio habilitado para experimentar. Lávate las manos antes de salir del laboratorio. Trabaja ordenadamente, pulcramente y sin prisas. Si se te cae algún producto, recógelo inmediatamente. Deja siempre el material limpio y ordenado. No uses nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. MANIPULACIÓN DE CRISTAL Protégete las manos cuando manipules material de cristal. No uses cristal agrietado. PRODUCTOS QUÍMICOS No uses ningún frasco de reactivos sin etiqueta. No huelas, inhales, pruebes o toques los productos químicos. No pipetees nunca con la boca. Ponte guantes y lávate las manos a menudo si usas productos tóxicos o corrosivos. No acerques envases de reactivos a una llama. No calientes líquidos inflamables. Transporta las botellas sujetándolas por la base, nunca por la boca. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS Deposita en contenedores especiales y debidamente señalizados el cristal roto, los reactivos tóxicos, nocivos o perjudiciales para el medio ambiente y los residuos biológicos. No tires nunca residuos sólidos por el fregadero. En caso de accidente, avisa inmediatamente al educador. Recuerda: Ante cualquier duda, consulta al educador. PRECAUCIONES ESPECÍFICAS PARA ESTE TALLER En esta práctica deberás seguir las precauciones generales para la manipulación de productos químicos. A continuación se enumeran sólo los que presentan los grados de peligrosidad siguientes: PBS: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Tween 20: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Irritante. Anexo II Referencias de los reactivos NOMBRE PBS Tween-20 CHK IGY, bagged (= ANTÍGENO) RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) GAR-HRP, bagged (= ANTICUERPO SECUNDARIO) SUSTRATO REVELADO REFERENCIA P TAB P ML EDU EDU EDU EDU CASA COMERCIAL Sigma Sigma BioRad BioRad BioRad BioRad 20

21 Sigue investigando en Xplore Health! Investigadores que han contribuido con contenidos: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal. DESARROLLADO POR Esta obra ha sido incluida con una licencia Attribution-NonCommercial- NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Para ver una copia de la licencia, visita